徐 珊, 蘭金蘋, 郭亞璐, 王田幸子,李莉云, 竇世娟, 劉國振

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071001; 2. 河北北方學(xué)院 生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000； 3. 中國農(nóng)科院 農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東 深圳 518116）

促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）在酵母、真核生物中廣泛存在［1］。植物中MAPK 的序列結(jié)構(gòu)高度保守，其作用模式主要是將胞外的刺激信號通過膜受體傳遞給MAPKKK，然后激活并磷酸化下游的MAPKK，MAPKK 蛋 白 質(zhì) 中 有 保 守 的S/T-X3～5-S/T 序 列（S 為絲氨酸，T 為蘇氨酸，X 為任意氨基酸）。MAPKK 進而激活下游的MAPK［2-3］，這樣MAPK系統(tǒng)將信號逐級放大并傳遞給下游的轉(zhuǎn)錄因子，如WRKY、bHLH 等，使植物對外界的刺激信號做出應(yīng)答。

植物MAPK 級聯(lián)系統(tǒng)在生長發(fā)育和逆境應(yīng)答過程中都發(fā)揮重要作用，對生物和非生物逆境脅迫的應(yīng)答直接決定著作物的產(chǎn)量，其重要性在多種真核細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中已經(jīng)被普遍發(fā)現(xiàn)和證明［4］。水稻基因組分析表明共有75 個MAPKKK、8 個MAPKK 以及17 個MAPK 基因［5-6］。Ning 等人鑒定到對干旱敏感的DSM1 基因突變，該基因是水稻的MAPKKK，過量表達DSM1 降低水稻的失水速度，提升了苗期水稻對干旱的耐受性，DSM1 的表達受鹽脅迫、干旱脅迫和ABA 處理的誘導(dǎo)，但低溫處理不影響其表達［7］。水稻OsMPK4 基因的表達受機械損傷和二化螟侵染的誘發(fā)，超表達OsMPK4的水稻受二化螟的危害減輕且植株生長遲緩，提示OsMPK4 是二化螟抗性的正調(diào)控子和植株生長的負(fù)調(diào)控子［8］。淹脅迫也能激活MAPK 級聯(lián)途徑，通過磷酸化耐淹基因SUB1A1 提高水稻對淹脅迫的耐受性［9］。本實驗室曾報道超表達水稻OsMPK17 蛋白質(zhì)增強了水稻的耐旱性［10］。水稻MAPK 家族有近百個成員，逐個鑒定水稻MAPK 基因在生物和非生物逆境脅迫應(yīng)答過程中的功能對水稻基礎(chǔ)和應(yīng)用研究都有重要的意義。

本研究擬開展OsMPK7 的功能研究，首先在前期建立的水稻蛋白質(zhì)樣品資源庫（RiceS-A300）的基礎(chǔ)上［11］，通過免疫印跡（Western blot, WB）分析，發(fā)現(xiàn)OsMPK7 蛋白質(zhì)在旱脅迫下表達下調(diào)，具備了開展進一步功能調(diào)查的初步數(shù)據(jù)，為此制備了超表達的載體，轉(zhuǎn)化水稻后鑒定獲得了超表達OsMPK7蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因材料，鑒定發(fā)現(xiàn)超表達轉(zhuǎn)基因材料在萌發(fā)期和幼苗期都降低了對旱脅迫的耐受性。本研究增進了對水稻OsMPK7 基因功能的了解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 所用水稻品種為粳稻TP309。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 克隆用大腸桿菌菌株為DH5a，原核表達載體為pET30a 和pGST，該載體由pGEM改造獲得，具體步驟參見文獻［12］。超表達質(zhì)粒構(gòu)建載體有pUC57-3HA、pEASY-T1（購自上海生工）和pUBI-C4300（由美國UC Davis 植病系Pamela Ronald 教授惠贈）。包含目的基因的質(zhì)粒為水稻OsMPK7 基因cDNA（AK099472），購自日本農(nóng)業(yè)生物資源研究所水稻基因組資源中心。

1.2 方法

1.2.1 水稻樣品總蛋白質(zhì)提取及WB 分析 水稻樣品稱重后用錫箔紙包裹，液氮速凍，用研磨儀打碎，按3∶8 樣品和蛋白質(zhì)提取液比例加入相應(yīng)體積的緩沖液并置于冰上，保持低溫。將蛋白質(zhì)提取緩沖液與水稻樣品混合物渦旋4 ～5 次，每次30 s，間隔 2 min。完成渦旋的樣品用冷凍離心機離心（4 ℃, 12 000 r/min）20 min，離心回收上清后加入1/4 體積的上樣緩沖液（250 mmol/L Tris-HCl pH 6.8、10% SDS、0.5%溴酚藍、50%甘油和5% β-巰基乙醇）煮沸即得到水稻的總蛋白質(zhì)［11］。WB 分析方法參見文獻［13］，主要步驟為：用SDS-PAGE 將總蛋白質(zhì)樣品進行分離，電泳條件為恒壓160 V。電泳完成后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，電壓100 V，電泳時間1 ～1.5 h。轉(zhuǎn)膜后用30 mL TTBS 緩沖液（0.2 mol/L Tris、1.36 mol/L NaCl、1.5% HCl 和1% Tween-20）配制的 5%的脫脂奶粉封閉，封閉時間為1 ～1.5 h。封閉結(jié)束后準(zhǔn)備一抗孵育液，在20 mL 的牛奶中加入特定效價比例的一抗（anti-OsMPK7 抗體），室溫孵育3 h 或4 ℃過夜。二抗孵育在20 mL 的脫脂奶粉中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗。信號檢測用MiniChemi610 化學(xué)發(fā)光成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)），用Image J 軟件［14］進行信號采集。以水稻HSP82 的表達豐度作為上樣內(nèi)參［15］。

1.2.2 水稻旱脅迫處理 水稻非生物逆境脅迫處理樣品參見文獻［11］報道，主要步驟為：水稻種子浸種3 d 露白后在培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)（30 ℃，12 h 光/12 h 暗），將水稻種子在紗網(wǎng)上培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d 時進行PEG-6000 旱脅迫處理，在0 h、4 h、8 h、12 h、 1 d、2 d、3 d、5 d 和7 d 等時間點取材，對照組用水處理。

1.2.3 超表達轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建 目的基因的PCR 引 物 通 過Primer CE［16］軟 件 設(shè) 計，由 北 京六合華大公司合成。上游引物序列為5’-GC GGTACCAT G C C T G A G G C A A AT G C G-3’，斜體表示Kpn I 識別位點， 下游引物序列為5’-GCGAGCTCGTACATCCTTGAAACAC-3’，斜體表示Sac I 識別位點。PCR 擴增模板為OsMPK7基因的cDNA，將 PCR 產(chǎn)物和 pET30a 載體雙酶切，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序確認(rèn)，具體構(gòu)建過程可參見文獻［10］。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化 將pUBIC4300-OsMPK7 質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)入水稻TP309，以甘露糖作為篩選壓力，遺傳轉(zhuǎn)化由武漢伯遠公司完 成［17-18］。

1.2.5 水稻種子萌發(fā)期旱脅迫處理 參照文獻［19］進行PEG-6000（PEG）擬旱處理，取野生型和轉(zhuǎn)基因材料種子各30 粒，用15 ～20 mL 70%的乙醇洗5 min，無菌水洗3 遍，每次5 min，25%次氯酸鈉處理30 min，無菌水洗3 遍，每次5 min，進行種子的消毒處理。培養(yǎng)皿里放2 層滅菌濾紙，待萌發(fā)的種子用無菌水浸種3 d，至種子露白后進行PEG處理。野生型和轉(zhuǎn)基因材料的種子分為對照組和試驗組，對照組用無菌水處理，試驗組用20% PEG 處理，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后拍照、測量10 株以上水稻的根長和芽長，計算平均值并進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 苗期土培干旱脅迫處理 取野生型和轉(zhuǎn)基因材料的種子5 ～8 粒，培養(yǎng)箱里浸種3 d，選取露白且長勢均勻的種子進行試驗，每盆播種野生型和轉(zhuǎn)基因種子各5 粒，正常培養(yǎng)至苗期并開始停止?jié)菜?，讓花盆自然干燥。?jīng)一定時間的干旱脅迫后，水稻葉片開始干枯、萎蔫，然后再適時恢復(fù)澆水，拍照觀察記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 旱脅迫對OsMPK7 蛋白質(zhì)的豐度的影響

利用本實驗室張劍碩等構(gòu)建的水稻RiceA-S300蛋白質(zhì)樣品資源庫［11］。采集水稻苗期經(jīng)PEG-6000旱脅迫處理0 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 等時間點的樣品，提取總蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)膜，用OsMPK7 特異抗體進行WB 檢測。由圖1 可見，對照水處理樣品中OsMPK7 的表達豐度基本保持恒定，而旱脅迫處理的樣品中OsMPK7 的豐度在4 h 時表現(xiàn)提高，隨后持續(xù)下降，在1 d 時豐度開始低于0 h 對照時間點，1 d 后樣品中OsMPK7 豐度均下降明顯。該結(jié)果表明，旱脅迫使OsMPK7 蛋白質(zhì)的表達水平下調(diào)，豐度與旱脅迫的負(fù)相關(guān)提示OsMPK7 基因在旱脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

圖1 WB 檢測水稻OsMPK7 蛋白質(zhì)在旱脅迫下的表達特征Fig. 1 WB detection of OsMPK7 protein in seedlings under drought stress

2.2 水稻OsMPK7 超表達轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建和鑒定

以含有OsMPK7 基因全長cDNA 的質(zhì)粒為模板進行PCR 擴增，OsMPK7 基因擴增產(chǎn)物大小與理論值相符。將擴增的OsMPK7 片段插入到超表達中間載 體pEASYT1-3HA 中，用Hind III 和Xba I 雙 酶切重組質(zhì)粒，得到4 000 bp 左右的載體片段和1 779 bp 的OsMPK7 片段，酶切產(chǎn)生片段與理論值一致。將重組質(zhì)粒進行雙酶切，回收插入片段，再與轉(zhuǎn)化載體pUBI-C4300 連接，用Kpn I 和Sac I 雙酶切驗證，確認(rèn)獲得了預(yù)期的超表達載體質(zhì)粒，構(gòu)建的pUBI-C4300-OsMPK7 超表達載體用于后續(xù)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的OsMPK7 基因超表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入水稻TP309 中，T0 代獲得了22個陽性株系，將陽性植株種子繼續(xù)播種，在后代篩選鑒定。在T4 代獲得了4 個超表達純合株系（編號依次為A101、A103、A105 和A107）。4 個株系的PCR 和WB 檢測結(jié)果見圖2。由此可見，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR 結(jié)果都表現(xiàn)為陽性，而野生型對照植株表現(xiàn)為陰性，WB 檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系中OsMPK7蛋白質(zhì)的豐度明顯高于野生型。

圖2 超表達OsMPK7 轉(zhuǎn)基因水稻的篩選與鑒定Fig. 2 Screening and identification of OsMPK7 over-express transgenic lines of rice

2.3 OsMPK7 超表達轉(zhuǎn)基因水稻在萌發(fā)期旱脅迫下的形態(tài)特征

如前所述，苗期樣品WB 結(jié)果提示OsMPK7 蛋白質(zhì)在旱脅迫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。為了進一步驗證其功能，用20% PEG 對野生型和超表達轉(zhuǎn)基因材料進行擬旱處理，以水處理的種子作為對照，培養(yǎng)7 d 的結(jié)果見圖3。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，擬旱脅迫條件下，超表達轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)較晚，生長緩慢，芽長與根長都低于野生型。其中，A103 轉(zhuǎn)基因株系的生長受旱脅迫影響最大，根與芽的生長受到了嚴(yán)重的抑制。水稻萌發(fā)期超表達轉(zhuǎn)基因株系的耐旱能力不強，說明超表達OsMPK7 降低了水稻的耐旱性，而在對照水處理培養(yǎng)條件下，野生型與轉(zhuǎn)基因的種子長勢沒有明顯區(qū)別。

圖3 超表達OsMPK7 水稻植株萌發(fā)期耐旱性鑒定Fig. 3 Drought tolerance assay of OsMPK7 over-expressed rice plants at germination stage

2.4 OsMPK7 超表達轉(zhuǎn)基因水稻苗期耐旱性鑒定

采用同盆栽培的方法對OsMPK7 超表達轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性進行分析，每盆栽培野生型與轉(zhuǎn)基因植株共10 棵，正常培養(yǎng)15 d 后停止?jié)菜? ～10 d左右水稻葉片表現(xiàn)萎蔫，拍照記錄比較，然后再恢復(fù)澆水，旱脅迫處理條件下水稻的生長情況見圖4。由圖可見，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的生長均弱于野生型，在離盆拍攝的照片中可清楚地看到明顯的萎蔫。恢復(fù)澆水后也可看到超表達水稻的生長弱，說明超表達OsMPK7 蛋白質(zhì)使水稻對旱脅迫更為敏感。

圖4 超表達OsMPK7 蛋白質(zhì)水稻苗期耐旱性鑒定Fig. 4 Characterization of drought tolerance for rice seedlings with over expressed OsMPK7 protein

3 結(jié)論與討論

水稻是重要的糧食作物，水稻的正常生長和產(chǎn)量的獲得是抵抗各種逆境脅迫的結(jié)果，了解水稻與逆境的互作機制具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。本研究采用基于抗體的水稻蛋白質(zhì)組學(xué)策略［20］，通過對逆境脅迫過程中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達特征調(diào)查獲得與功能相關(guān)的線索，進而開展轉(zhuǎn)基因驗證。

MAPK 級聯(lián)途徑在水稻的正常生長和各種脅迫應(yīng)答過程中的功能已經(jīng)有許多報道。敲除水稻的OsMPK15 基因?qū)е虏〕滔嚓P(guān)基因（Pathogenesisrelated proteins, PR）的組成型表達、活性氧（ROS）積累的提高以及顯著提高對稻瘟病和白葉枯病的抗性，而在OsMPK15 的超表達轉(zhuǎn)基因植株中，PR 基因的表達上調(diào)，ROS 的積累提高，對病原物的抗性下降，說明OsMPK15 是抗性的負(fù)調(diào)控因子［21］。超表達水稻MPKK10.2 通過磷酸化下游的MPK6和MPK3 增強了對細菌條斑病及干旱脅迫的抗性，RNA 干擾植株則降低了抗性，說明MPKK10.2 是一個節(jié)點，連同其下游的MPK6 和MPK3 正調(diào)控對病原物和干旱脅迫的抗性［22］。水稻OsMPK5 受低溫、高鹽、干旱和機械損傷等誘導(dǎo)，通過轉(zhuǎn)基因干擾OsMPK5 的表達降低了對干旱、高鹽和低溫的耐性，支持OsMPK5 在這些逆境脅迫過程中發(fā)揮正調(diào)控作用［23］。

本研究對OsMPK7 蛋白質(zhì)在逆境脅迫下的表達特征進行分析，鑒定到OsMPK7 在旱脅迫下表達下調(diào)，豐度的負(fù)相關(guān)提示其發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。為此，構(gòu)建了OsMPK7 超表達轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的策略轉(zhuǎn)化水稻，獲得超表達純合轉(zhuǎn)基因植株。種子萌發(fā)期的擬旱試驗和苗期的缺水試驗結(jié)果表明，超表達OsMPK7 降低了水稻的萌發(fā)期和苗期對旱脅迫的耐受性。水稻中有近百個MAPK 家族成員，精細地平衡與調(diào)控下游基因的表達，保證水稻在面臨逆境時做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。所以需要對每個MAPK的功能進行多方面的調(diào)查，才能逐步描繪出完整的MAPK 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。