劉玉霞，曹伶俐，竇世娟，王秀伶

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；2. 滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北 滄州 061001）

脯氨酸（Proline，Pro），通常指L- 脯氨酸，其化學(xué)名稱為吡咯烷酮羧酸，是一種重要的生物蛋白質(zhì)氨基酸。由于其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的獨特性（亞氨基酸、分子量小、水溶性大），除了作為蛋白質(zhì)成分外，還發(fā)揮多方面生理功能?，F(xiàn)有研究結(jié)果證實，許多植物在應(yīng)激條件下會積累脯氨酸，此現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于枯萎的黑麥草中［1］。積累的脯氨酸除作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還在清除活性氧、穩(wěn)定蛋白質(zhì)（酶）、調(diào)控蛋白合成和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換等方發(fā)揮重要作用［2-5］。 在細(xì)菌中，脯氨酸的積累最初發(fā)現(xiàn)與其滲透脅迫耐受性密切相關(guān)［6］，1981 年Csonka 的研究結(jié)果表明，鼠傷寒沙門氏菌的脯氨酸高產(chǎn)菌株獲得了滲透抗 性［7］；后來，Zaprasis 等的研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可通過從頭合成與吸收、外源多肽水解或其他氨基酸代謝轉(zhuǎn)化等方式積累胞內(nèi)脯氨酸，對抗高滲透壓的影響［8-9］。另外，有研究報道，大腸桿菌中積累的脯氨酸在熱應(yīng)激過程中可減少蛋白質(zhì)聚集［10］。2014 年，Cheng 等研究結(jié)果還證實，脯氨酸和谷氨酰胺可通過上調(diào)NtrY/NtrX、PutA/GlnA 和加速DNA 結(jié)合蛋白CtrA 的降解來調(diào)控人單核細(xì)胞查菲埃立克體（一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生菌）的快速增殖，提高其致病力［11］。

試驗菌株Clostridium sp. AUH-JLC108 是本實驗室從公雞新鮮糞樣中分離得到的革蘭氏陽性嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，該菌株在厭氧條件下能將底物大豆異黃酮黃豆苷原開環(huán)轉(zhuǎn)化為 O-Dma，為提高其耐氧能力，本實驗室對其進行了耐氧馴化，并成功得到既能在有空氣氧條件下生長又能高效轉(zhuǎn)化的耐氧突變株Clostridium sp. Aeroto-AUH-JLC108［12］。與原出發(fā)菌株相比，在相同接種條件下，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 在有氧條件下的生長速度比原出發(fā)菌株在厭氧條件下明顯加快，生物量（OD 值）是原出發(fā)菌株在厭氧條件下的2 ～3 倍。為探索該耐氧突變株在有氧條件下生長速度變快以及生物量成倍增加的原因，本研究對菌株發(fā)酵液中的代謝物進行檢測，發(fā)現(xiàn)耐氧突變株在有氧條件下生長時，獲得了積累脯氨酸的能力。本研究對耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 脯氨酸合成動態(tài)進行檢測，并從脯氨酸直接和間接抗氧化能力方面展開研究，以期為進一步研究脯氨酸對耐氧突變株菌體增殖的作用和機制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

試驗菌株為具有大豆異黃酮（黃豆苷原）轉(zhuǎn)化活性的專性厭氧菌AUH-JLC108 (Clostridium sp.)及其耐氧突變菌株 Aeroto-AUH-JLC108，2 菌株均由本實驗室分離保存。

腦心浸液培養(yǎng)基（BHI），美國BD 公司；化學(xué)限定培養(yǎng)基（配制1 L 培養(yǎng)基，需葡萄糖10 g、硫酸銨2 g、KH2PO42 g、K2HPO47 g、檸檬酸鈉0.5 g、 MgSO40.2 g、無水氯化鈣 20 mg、FeSO4·7H2O 10 mg、 L- 谷氨酰胺 0.6 g、L- 半胱氨酸 0.6 g）；L- 脯氨酸，北京索萊寶科技有限公司；FMOC-Cl，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氟乙酸，上海麥恪林生化科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美國Sigma 公司；NADH 氧化酶和過氧化物酶檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；乙腈（色譜純），北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司。

Concept 400 型厭氧工作站，英國Ruskinn 公司；BCM-1000A 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZXDP-B2080 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；高效液相色譜儀，美國 Waters 公司；DU-650 型紫外可見分光光度計，美國Beckmen 公司；5417R 型低溫高速離心機，德國Eppendorf 公司。

1.2 菌株培養(yǎng)條件

嚴(yán)格厭氧梭菌AUH-JLC108 的培養(yǎng)條件為：在厭氧工作站內(nèi)以10%的接種量將種液接種到盛有 1 mL 新鮮BHI 液體培養(yǎng)基的帶蓋螺口玻璃試管中，接種后在厭氧工作站內(nèi)靜置培養(yǎng)。厭氧工作站內(nèi)混合氣體種類及配比為：5% CO2，10% H2和85% N2，厭氧工作站內(nèi)溫度設(shè)定為37 ℃。

耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 的培養(yǎng)條件為： 在超凈工作臺內(nèi)以10%接種量將種液接種到盛有 4 mL 新鮮BHI 液體培養(yǎng)基（或化學(xué)限定培養(yǎng)基）的帶蓋螺口玻璃試管中，將接種后的試管放在37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。

1.3 脯氨酸的高效液相檢測

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和衍生溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取色譜純脯氨酸標(biāo)品適量，用超純水溶解成濃度為10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)母液，然后梯度稀釋至 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mg/mL。

FMOC-Cl 乙腈溶液：準(zhǔn)確稱取FMOC-Cl 適量，用乙腈溶解成濃度為0.2 mol/L 的溶液。

四硼酸鈉水溶液：準(zhǔn)確稱取四硼酸鈉適量，用超純水溶解成濃度為0.125 mol/L 的溶液。

1.3.2 HPLC 檢測 標(biāo)準(zhǔn)溶液或細(xì)菌發(fā)酵上清液參考文獻［13］，衍生化后進行HPLC 檢測。色譜柱為Agilent C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流速為1 mL/min；流動相 A 為 0.05% 三氟乙酸水溶液，B 為 0.05% 三氟乙酸乙腈溶液；檢測波長 263 nm， 進樣量10 μL，梯度洗脫條件如下：0 ～5 min, 70% A; 5 ～10 min, 70% ～60% A; 10 ～15 min, 60% ～50% A; 15 ～20 min, 50% ～40% A; 20 ～25 min, 40% ～60% A; 25 ～28 min, 60% ～ 70% A。

1.4 脯氨酸的產(chǎn)生動態(tài)

按照1.2 的方法培養(yǎng)菌株Aeroto-AUH-JLC108，每隔3 h 取發(fā)酵液測定OD600，同時取離心后發(fā)酵上清夜，按照1.3 的方法進行衍生及高效液相色譜檢測，試驗重復(fù) 3 次。分別記錄不同取樣時間脯氨酸的出峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中脯氨酸含量，繪制 Aeroto-AUH-JLC108 的脯氨酸產(chǎn)生動態(tài)。

1.5 脯氨酸的抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH 清除能力測定 參考本實驗室以前報道［14］的方法進行。

1.5.2 H2O2清除能力測定 參考文獻［15］方法略有改動，將Aeroto-AUH-JLC108 接種于含有（或不含有）10 mmol/L 脯氨酸的化學(xué)限定培養(yǎng)基中生長至OD600為0.3。離心收集細(xì)胞沉淀，洗滌并重懸于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中至OD600為0.1。然后加入5 mmol/L H2O2，于不同時間點取樣，在230 nm 波長處測定吸光度值，計算H2O2清除率。同時在磷酸鹽緩沖液中，將脯氨酸（10 mmol/L）和H2O2（5 mmol/L）一起孵育，相同時間點測定單純的脯氨酸對H2O2的清除能力。

1.5.3 氧化脅迫與抗氧化脅迫試驗 參考文獻［16 ～ 17］方法進行設(shè)計和試驗，原理是通過添加外源氧化劑和抗氧化劑所分別造成的氧脅迫或抗氧脅迫環(huán)境，檢測氧化劑和抗氧化劑對細(xì)菌生長，以及抗氧化酶活性的影響。

具體方法為：分別配制1 mol/L H2O2和200 mol/L 脯氨酸母液，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，于超凈工作臺中加入滅菌培養(yǎng)基至適當(dāng)終濃度。將Aeroto-AUH-JLC108 分別接種于外源添加或不添加H2O2和脯氨酸的液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，測其OD600。取菌液離心收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，然后重懸于800 μL 生理鹽水中超聲破碎細(xì)胞，4 ℃離心除去細(xì)胞碎片，按照試劑盒說明書測定上清液中過氧化物酶（POD）和NADH 氧化酶的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株發(fā)酵液中脯氨酸的檢測

在BHI 液體培養(yǎng)基中37 ℃下分別培養(yǎng)原出發(fā)菌株AUH-JLC108（厭氧工作站內(nèi)）及其耐氧突變菌株Aeroto-AUH-JLC108（普通恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)），以不接菌的BHI 新鮮液體培養(yǎng)基為對照，測定發(fā)酵液和新鮮BHI 液體培養(yǎng)基中的脯氨酸含量，結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可以看出，脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（圖1A）的出峰時間在21 min 左右，而不接菌的新鮮BHI 培養(yǎng)基（圖1B）在相同的保留時間亦有相應(yīng)的物質(zhì)峰，通過添加脯氨酸內(nèi)標(biāo)后峰面積的變化規(guī)律，證實圖1B中在相同保留時間出現(xiàn)的物質(zhì)峰為脯氨酸，該結(jié)果表明，在BHI 培養(yǎng)基中含有一定量的游離脯氨酸。類似地，在未馴化的原出發(fā)菌株AUH-JLC108（圖1C）的培養(yǎng)液中同樣檢測到了與脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相同、且峰面積大小與新鮮BHI 培養(yǎng)基中的脯氨酸相近的物質(zhì)峰。由于在未馴化原出發(fā)菌株AUH-JLC108 不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液中檢測到的脯氨酸的量比較接近，因此推測，原出發(fā)菌株AUHJLC108 可能不產(chǎn)生脯氨酸；或者產(chǎn)生與消耗脯氨酸的速度相近。與未馴化的原出發(fā)菌株AUH-JLC108類似，在耐氧突變株 Aeroto-AUH-JLC108（圖1D）的培養(yǎng)液中檢測到了脯氨酸的物質(zhì)峰，但不同的是，脯氨酸的峰面積卻明顯高于BHI 培養(yǎng)基中以及未馴化菌株AUH-JLC108 發(fā)酵液中的檢測量。故推測，與未馴化的原出發(fā)菌株AUH-JLC108 相比，耐氧突變株 Aeroto-AUH-JLC108 產(chǎn)脯氨酸能力明顯加強；或者耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 產(chǎn)脯氨酸能力與馴化前相比無明顯加強，但消耗利用脯氨酸能力卻明顯減弱，因而導(dǎo)致了菌株培養(yǎng)液中脯氨酸的累積。

圖1 BHI 培養(yǎng)基及菌體培養(yǎng)液中脯氨酸含量 檢測的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC elution profiles of proline detected in fresh BHI liquid medium and cultural broth

2.2 耐氧突變株脯氨酸合成能力的驗證

本研究發(fā)現(xiàn)，BHI（腦心浸液培養(yǎng)基）本身含有一定量的游離脯氨酸（圖1B）。另外，BHI 培養(yǎng)基含有大量動物蛋白，在菌體產(chǎn)生蛋白酶作用下，一些含脯氨酸的蛋白質(zhì)也有可能產(chǎn)生游離脯氨酸?；瘜W(xué)限定培養(yǎng)基成分確定，為消除培養(yǎng)基本身含有的脯氨酸的干擾，本研究在化學(xué)限定培養(yǎng)基中添加已知濃度的脯氨酸，并檢測不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)液中的脯氨酸含量。結(jié)果表明，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 接種后0 h 能檢測到一定量的脯氨酸 （1.44 mmol/L）（圖2B），這是因為用于制備耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 的種子液的是BHI培養(yǎng)基，而耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 在BHI培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生較大量的脯氨酸。當(dāng)耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 在化學(xué)限定培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后（圖2C），檢測到脯氨酸的量（2.79 mmol/L）比培養(yǎng)0 h 時增大近1 倍。因此，可以肯定的是，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 在有氧條件下培養(yǎng)時能夠合成和積累脯氨酸。需指出的是，原出發(fā)菌株AUH-JLC108 在化學(xué)限定培養(yǎng)基中、在厭氧條件下并不能生長，因此，本研究未能檢測原出發(fā)菌株AUH-JLC108 在化學(xué)限定培養(yǎng)基中產(chǎn)脯氨酸能力。

圖2 化學(xué)限定培養(yǎng)基中脯氨酸含量檢測的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC elution profiles of proline detected in the pure chemically defined cultural medium

2.3 耐氧突變株脯氨酸產(chǎn)生動態(tài)

由于接種用種子液中含有一定濃度的脯氨酸，因而，在接種后0 h 能檢測到1 mmol/L 左右的脯氨（見圖3），但隨著菌體開始生長，培養(yǎng)液中脯氨酸的量不斷增加。接種后0 ～9 h 為細(xì)菌對數(shù)生長期，接種后9 h，培養(yǎng)液中脯氨酸的量達到一個高值，之后6 h 有所下降?？傮w看，脯氨酸產(chǎn)量的變化趨勢和細(xì)菌生長曲線大致吻合。

本實驗室前期研究結(jié)果表明，與原出發(fā)菌株AUH-JLC108 相比，在相同接種條件下，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 在有氧下的生長速度比原出發(fā)菌株在厭氧條件下明顯加快，生物量是原出發(fā)菌株在厭氧條件下的2 ～3 倍。通過本研究發(fā)現(xiàn)，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 在有空氣氧條件下生長時產(chǎn)脯氨酸能力明顯加強，且脯氨酸產(chǎn)量變化與細(xì)菌生長曲線相吻合，故推測脯氨酸在耐氧突變株快速生長和生物量成倍增加中可能發(fā)揮著重要作用。

圖3 耐氧突變株 Aeroto-AUH-JLC108 脯氨酸產(chǎn)生動態(tài) Fig.3 Kinetics study of proline produced by the oxygentolerant mutant strain Aeroto-AUH-JLC108

2.4 脯氨酸的抗氧化活性檢測

2.4.1 DPPH 自由基清除能力 將不同濃度脯氨酸（0.1、0.2、0.4、0.5 和1.0 mmol/L）與DPPH 自由基避光反應(yīng)，于不同時間（1、24、48 和72 h）測定其對DPPH 自由基的清除效果（圖4）。由圖4 可以看出，不同濃度的脯氨酸對DPPH 自由基均有一定的清除作用，且在相同反應(yīng)時間內(nèi)，隨脯氨酸濃度的增加，其對DPPH 自由基的清除能力明顯增強。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，隨反應(yīng)時間的延長，相同濃度的脯氨酸對DPPH 自由基的清除能力亦明顯提高，濃度為 1.0 mmol/L 的脯氨酸在1 、24、48 和72 h 時的清除率分別為13.48%、34.86%、44.07%和45.41%。

圖4 不同濃度脯氨酸在不同反應(yīng)時間對DPPH 自由基的清除能力Fig. 4 DPPH free radical-scavenging activity of different concentrations of proline under different reaction periods

2.4.2 抗氧化脅迫能力 ①不同濃度的外源H2O2對耐氧突變株有氧生長的影響。本研究將耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 培養(yǎng)在外源添加不同濃度（1、2.5、5、7、8、9、10 mmol/L）H2O2的培養(yǎng)基中，對數(shù)生長末期取樣測其OD600，結(jié)果如圖5A 所示。由圖5A 可以看出，當(dāng)外源添加的H2O2濃度范圍在1 ～7 mmol/L 時，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108在有空氣氧條件下生長的OD 值幾乎不受影響；當(dāng)外源添加的H2O2濃度增至8 mmol/L 時，耐氧突變株的生長明顯受到抑制，當(dāng)H2O2濃度增至10 mmol/L 時，則完全受到抑制。

圖5 外源添加不同濃度的H2O2 對耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 有氧生長的影響Fig. 5 Influence of different concentrations of H2O2 added in the cultural medium on growth of the oxygen-tolerant mutant strain Aeroto-AUH-JLC108 when grown under aerobic conditions

②添加脯氨酸對耐氧突變株有氧生長的保護作用。由上述外源H2O2氧化脅迫影響試驗，發(fā)現(xiàn)濃度為8 mmol/L 的外源H2O2對耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 在有空氣氧條件下的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用（圖5A）。為探索脯氨酸的抗氧化脅迫能力，本研究將耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 接種在同時含有外源添加H2O2（8 mmol/L）和脯氨酸（2 mmol/L）的BHI 培養(yǎng)基中，測定外源添加物對耐氧突變株生物量（OD600）的影響（圖5B）。 由圖5B可以看出，與無外源脯氨酸添加的對照相比，培養(yǎng)基中添加2 mmol/L 的脯氨酸能明顯緩解H2O2（8 mmol/L）對耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 有氧生長的抑制作用。該研究結(jié)果表明，耐氧突變株Aeroto-AUHJLC108 在有空氣氧條件下生長時，菌體產(chǎn)生的脯氨酸可緩解H2O2對耐氧突變株生長的抑制作用。

③脯氨酸對抗氧化酶活性的保護作用。培養(yǎng)基中添加一定濃度脯氨酸可緩解H2O2對耐氧突變株有氧生長的抑制作用，但經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，無論是耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 的菌體細(xì)胞，還是單純的脯氨酸，對H2O2的直接清除能力甚微。據(jù)報道，外源脯氨酸可通過提高抗氧化酶（過氧化氫酶和過氧化物酶）的活性，來減輕鹽脅迫對煙草BY-2 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響。本實驗室前期研究結(jié)果表明，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 不產(chǎn)生過氧化氫酶，但具有較高的NADH 氧化酶活性。因此，本研究分別檢測了對照組、H2O2組以及H2O2+proline 組中耐氧突變株產(chǎn)生的過氧化物酶和NADH 氧化酶活性（見圖6）。結(jié)果表明，與對照相比，H2O2組NADH 氧化酶活性顯著降低，而H2O2+proline 組該酶活性雖顯著低于對照，但同時也明顯高于H2O2組。該研究結(jié)果表明，耐氧突變株產(chǎn)生的脯氨酸可有效保護抗氧化酶NADH 氧化酶的活性。

圖6 H2O2 脅迫下脯氨酸對耐氧突變株NADH 氧化酶活性的影響Fig. 6 Influence of proline on NADH oxidase activity produced by the oxygen-tolerant mutant strain under H2O2 stress

3 結(jié)論與討論

游離脯氨酸的功能通常與活性氧（ROS）平衡的調(diào)節(jié)相關(guān)［18］。據(jù)報道，脯氨酸除能直接清除某些類型的活性氧外，還能保護多種抗氧化酶的穩(wěn)定性，激活其他的解毒途徑［19］。關(guān)于脯氨酸本身的抗氧化活性，以前報道較多的是關(guān)于其對超氧陰離子（）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2）的清除能力，表明脯氨酸體外是有效的1O2和·OH 清除劑［20-24］。但目前也有一些不同的說法：Kaul 等報道脯氨酸不抑制鄰苯三酚的自氧化［25］，這是一種涉及超氧自由基（O2·-）產(chǎn)生的反應(yīng)；Signorelli 等證明脯氨酸不能淬滅水緩沖液中的1O2［26］，從而引起脯氨酸對1O2抗氧化作用的反思。DPPH 是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，廣泛用于抗氧化成分的體外抗氧化性評價，但尚未見用于脯氨酸抗氧化的報道。本研究經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，低濃度的脯氨酸即對DPPH 自由基具有顯著的清除活性，但脯氨酸對H2O2的體外清除能力甚微，這與之前的報道一致［15，21］。

目前已表征了大量與ROS 清除相關(guān)的酶類，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、過氧化物酶、NADH 氧化酶（NOX）、烷基氫過氧化物酶等。其中，NADH 氧化酶是一種能催化NADH 氧化為NAD，并消耗氧氣的氧化還原酶，根據(jù)產(chǎn)物的不同分為H2O2型和H2O 型，前者主要分布于需氧菌和部分兼性厭氧菌中，后者則主要存在于厭氧菌和部分兼性厭氧菌中［27］。近年研究發(fā)現(xiàn)，NADH 氧化酶與細(xì)菌的抗氧化能力密切相關(guān)［28-30］，如大部分乳酸菌有氧生長過程中均會表現(xiàn)出該酶的活性，催化氧氣變成水分子，進而減少氧氣誘發(fā)的ROS 毒害［28］；乳酸乳球菌（L. lactis）的NADH 氧化酶在光滑球擬酵母和釀酒酵母中的異源表達均發(fā)現(xiàn)可有效降低有氧發(fā)酵條件下的 ROS 水平［31-32］；Kang 等發(fā)現(xiàn)NADH 氧化酶-NADH 過氧化物酶系統(tǒng)是Lactobacillus panis PM1 主要的抗氧化應(yīng)激機制［33］?，F(xiàn)有研究結(jié)果證實，在不同脅迫條件下，脯氨酸對植物中多種抗氧化酶，如抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)酶、過氧化氫酶和過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性的保護或增強作用［17，34，35］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，在氧化脅迫條件下，脯氨酸對耐氧突變株產(chǎn)生的NADH氧化酶活性具有保護作用。

已報道在動植物和微生物中，ROS 可作為一種信號分子，直接或間接地作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等［16］。NADH氧化酶除可以保護細(xì)胞免受自由基形成的損害外，其另一個重要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+的比率，從而改變菌體的代謝路徑［27］。耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC108 具有較強的NADH 氧化酶活性，推測該菌株在有空氣氧條件下生長時，脯氨酸可能通過影響NADH 氧化酶的活性來發(fā)揮其作用，如通過影響ROS 的產(chǎn)生與清除或通過影響NADH/NAD+的比率，進而影響細(xì)菌生長和增殖，具體機制還有待進一步研究。