劉文晗 謝曉冬 殷 敏 陳 楠

1（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所中國科學(xué)院微觀界面物理與探測重點實驗室 上海201800）

2（中國科學(xué)院大學(xué) 北京100049）

3（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 上海200234）

貴金屬（如金、銀、鉑等）納米材料具有獨特的物 理、化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，因而被廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感、生物檢測和醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域［1-7］。貴金屬納米材料之所以能在腫瘤成像和靶向放射治療中發(fā)揮作用［5，8-9］，是因為實體腫瘤組織普遍具有提高滲透滯留（Enhanced Permeability and Retention，EPR）效應(yīng)，納米顆粒容易在腫瘤部位發(fā)生富集［10］。由于貴金屬納米粒子具有較高的原子序數(shù)和X 射線吸收系數(shù)，所以可作為腫瘤體內(nèi)成像的造影劑以及放射治療的增敏材料［11-12］。納米貴金屬能夠有效地吸收X射線并與輻射相互作用，發(fā)射二次電子，這些二次電子既可以直接造成DNA的損傷［13-15］，又可以在細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基，增加腫瘤細胞對輻射的敏感性，從而實現(xiàn)以較低的劑量射線獲得良好的放療效果［16-17］。

貴金屬納米材料還具有局域表面等離子體共振（Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR）效應(yīng)。研究人員基于其LSPR 效應(yīng)開發(fā)了一系列傳感器，這些傳感器具有實時和高靈敏等特點，且無需標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)和生物檢測。雖然電化學(xué)傳感和基于框架核酸的新型檢測手段等在多種疾病的診斷中發(fā)揮了重要作用，但是成像學(xué)的方法，在對腫瘤細胞進行檢測和診斷時具有高靈敏性和實時性等優(yōu)勢［18-20］?；诩{米貴金屬的LSPR 效應(yīng)所制備的等離子體納米探針（Plasmonic Nanoprobes，PNPs）具有明顯區(qū)別于生物組織的散射光顏色和光譜信號，可以利用暗場顯微鏡（Dark Field Microscope，DFM）進行觀測［21-23］。與熒光探針相比，PNPs具有更高的靈敏性和特異性，且不容易發(fā)生光漂白，暗場成像過程也避免了激光直接照射細胞所產(chǎn)生的毒性，特別適合用來對活細胞進行觀測。對于PNPs 在細胞內(nèi)動態(tài)行為的研究，則為更好地理解細胞生命活動的過程提供了可能［24-25］。此外，等離子體納米探針的LSPR效應(yīng)對于其周圍的介電常數(shù)非常敏感，能夠?qū)崟r反映觀測過程中環(huán)境的變化，因而具有更快的響應(yīng)速度和更高的檢測靈敏度［26］。除了單個PNP 的形貌對于其LSPR 效應(yīng)的影響，兩個或多個納米探針相互靠近，會顯著改變其局部電荷分布，最終導(dǎo)致散射光譜的紅移，這種效應(yīng)被稱作等離子體耦合（Plasmon Coupling）?；谠撔?yīng)所設(shè)計的納米等離子尺等探針體系，使得實時監(jiān)測生物分子動態(tài)過程中的距離變化成為可能［27-28］。

本文綜述了國內(nèi)外基于暗場成像的PNPs 的最新進展，重點介紹其在細胞成像方面的應(yīng)用；總結(jié)了利用PNPs觀測細胞膜表面受體、原位檢測細胞內(nèi)的生物分子和實時追蹤胞內(nèi)轉(zhuǎn)運途徑等方面的應(yīng)用，并展望了這一領(lǐng)域的發(fā)展前景。

1 等離子體納米探針與暗場顯微成像技術(shù)

1.1 等離子體納米探針

具有LSPR 效應(yīng)的納米顆粒被用作等離子體納米探針，對生物分子和細胞結(jié)構(gòu)進行標(biāo)記、檢測和實時成像。就化學(xué)組成而言，PNPs 包括納米金（Gold Nanoparticles， AuNPs） 、 納 米 銀 （Silver Nanoparticles，AgNPs） 、 納 米 鉑 （Platinum Nanoparticles，PtNPs）和包含這些貴金屬成分的復(fù)合納米顆粒等。PNPs 的化學(xué)組分和尺寸決定其光學(xué)性質(zhì)。例如，粒徑為40 nm 單顆粒球形AuNPs 探針在暗場下呈現(xiàn)綠色光斑，而相同大小的AgNPs則具有藍色散射光信號。對于球形PNPs，其散射吸收可以用Mie理論［29］解釋，隨著粒徑增大，球形PNP的散射光強度增強。此外，納米顆粒的形貌也會對其LSPR 光學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。隨著納米顆粒的合成技術(shù)日趨成熟，多種具有復(fù)雜形貌結(jié)構(gòu)的PNPs 被合成，如：球形、棒狀、二維多邊形、三維多邊體、分枝狀、復(fù)雜型和空心結(jié)構(gòu)等［30］。其中，由于其化學(xué)惰性和優(yōu)異的生物兼容性，各種形貌的納米金探針被制備和應(yīng)用于細胞標(biāo)記及成像分析。在最近的一項研究 中 ，Chakkarapani 等［31］根 據(jù) 納 米 金 棒（Gold Nanorods，AuNRs）各向異性的光學(xué)特性，利用集成光片成像的超分辨顯微鏡實時觀察了單個PNP 在聚集體中的三維取向，獲得了低至64 nm 的軸向分辨率和28 nm 的空間分辨率（圖1（a））。Zhang 等［32］利用DNA 介導(dǎo)的定向自組裝技術(shù)制備了等離子體性質(zhì)可調(diào)的海參狀金納米晶（Gold Nanocrystals，AuNCs）。時域有限差分（Finite-difference Timedomain，F(xiàn)DTD）方法的計算結(jié)果表明：等離子體共振峰的變化與合成的AuNCs的尺寸、形貌的精確變化是一致的；該AuNCs 具有良好生物相容性，可以用于光熱治療和成像分析（圖1（b））。如圖1（c）所示，Shen 等［33］借助Poly-A30寡核苷酸鏈對納米金的表面生長過程進行控制，得到了一系列粒徑約50 nm的帶“刺突”的納米金星結(jié)構(gòu)，隨刺突的長度和粗細比（δ）增大，其對應(yīng)的LSPR 散射光信號顏色從暗綠色逐步變化至橙紅色，相應(yīng)的散射光譜也從560 nm紅移至660 nm左右。該方法得到了超多元化的PNPs，其對應(yīng)的特征光譜種類超過了傳統(tǒng)熒光探針的多色極限。研究者們借助該探針，實現(xiàn)了單個細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的標(biāo)記和實時定量成像。此外，這類帶有突刺結(jié)構(gòu)的PNPs，由于尖端的電荷分布更為密集，其LSPR 性質(zhì)對于周圍環(huán)境的敏感性也比球形對稱結(jié)構(gòu)的納米探針要高。因此，利用各種手段，如DNA納米技術(shù)，實現(xiàn)對PNPs形貌的設(shè)計和調(diào)控，從而制備超多色和超靈敏的生物探針成為了新的發(fā)展趨勢。

圖1 多種形貌的納米等離子探針(a)納米金棒的光片三維成像[31]，(b)海參狀納米金探針[32]，(c)形貌可控的多色納米金星探針[33]Fig.1 Plasmonic probes with varied shapes(a)3D light sheet imaging with nanorods[31],(b)The trepang-like Au nanocrystals[32],(c)The tunable multiplex gold nano-star probes[33]

1.2 暗場顯微成像技術(shù)

暗場顯微成像技術(shù)是檢測單個納米顆粒散射光信號的有效手段。暗場顯微鏡可以觀測到粒徑在20～200 nm的PNPs 的信號，并可檢測到探針粒子間僅數(shù)納米的距離改變，突破了普通光學(xué)顯微鏡約200 nm 的空間分辨率限制［34］。暗場顯微鏡成像和采集光譜的原理如圖2（a）所示，鹵素?zé)艋虬准す獍l(fā)出的入射光通過裝配有暗場環(huán)的暗場聚光鏡之后，形成環(huán)形光，斜照射在樣品上，在樣品下方使用一個數(shù)值孔徑小于聚光鏡的物鏡，收集樣品的散射光，并將光學(xué)信號通過顯微鏡鏡片系統(tǒng)傳遞至暗場成像感光電荷耦合元件（Charge-coupled Device，CCD），然后透過狹縫到達光譜儀中，從而分別獲得樣品的暗場圖像和散射光譜。這類暗場光譜儀通過狹縫采集單顆粒PNP 的高精度光譜，適合于構(gòu)建生化體系中的超靈敏探針［35］。如果需要同時采集視野內(nèi)多個探針的光譜，就需要利用高光譜暗場顯微成像系統(tǒng)，基于狹縫型的高光譜速度較慢，如El-Khoury 等［36］對44 μm×59 μm面積內(nèi)的數(shù)百個納米銀顆粒采集高光譜，需要大約30 s。之后Kirchner 等［37］研發(fā)了一種“快照型”設(shè)備，可以同時采集圖像和視野內(nèi)所有粒子的光譜，整個視野的光譜掃描時間縮短至1 ms，且光譜的分辨率仍能保持0.21 nm，如圖2（b）所示，樣品的信號通過分光鏡后，同時進入成像系統(tǒng)和光譜掃描系統(tǒng)。光譜采集不是通過狹縫，而是直接使用透射光柵片，使光線發(fā)生平行衍射，在CCD 上形成光譜條紋。這一系統(tǒng)要求樣品中探針的分布比較稀疏，否則掃描得到的單顆粒光譜信號的拉伸條紋會互相重疊。

圖2 暗場光譜采集裝置(a)彩色CCD、光譜CCD和狹縫光譜儀耦合的暗場顯微鏡示意圖[35]，(b)快照型暗場高光譜光路示意圖[37]Fig.2 Setups of dark-field spectroscopies(a)Dark-field microscope coupled with color CCD,spectro-CCD and a slit-spectrometer[35],(b)Snapshot hyperspectral imaging setup[37]

2 等離子體納米探針與細胞成像研究

2.1 用于研究細胞膜表面受體的PNPs

細胞膜表面存在多種多樣的受體蛋白，它們能識別、結(jié)合特異的配體分子，從而激活和啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)途徑，調(diào)控細胞內(nèi)的生理過程發(fā)生相應(yīng)的變化［38-39］。研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，受體在細胞膜表面的運動和聚集常常是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟。因此，針對細胞膜表面受體的分布和聚集進行研究，有助于理解其生理功能［40-42］。將PNPs 與識別膜受體的特異性抗體進行偶聯(lián)，使之能夠結(jié)合和標(biāo)記活細胞表面受體，便于在暗場顯微鏡下對其進行實時觀察。這種基于等離子體納米探針的暗場成像方式，不會對細胞造成侵入性損傷，且探針不易發(fā)生光漂白，適合進行長時間觀測。更重要的是，當(dāng)膜受體發(fā)生聚集時，探針粒子間距離的改變會造成其散射光譜和暗場圖像顏色的改變（圖3（a））。例如，Wang等［43］利用抗體標(biāo)記的納米金探針，對于跨膜蛋白ErbB1 和ErbB2在不同種類癌細胞表面的分布進行了成像分析（圖3（a））。隨著受體密度增大，納米金探針間的距離縮短，當(dāng)顆粒間的距離小于顆粒表面等離子體耦合發(fā)生的距離（＜5 nm）時，散射光波長會發(fā)生明顯的紅移，并伴隨散射光強的增加。此外，Wang等［44］先根據(jù)不同聚集程度的納米銀探針?biāo)鶎?yīng)的暗場散射光譜，將團聚的納米銀分為4類，然后用修飾有表皮生長因子（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）抗體的30 nm 納米銀探針與A431細胞進行孵育后，根據(jù)探針的分布和對應(yīng)的暗場散射光譜，定量描述了細胞膜表面EGFR的表達、密度和空間分布（圖3（b））。另外，該研究組還利用修飾有EGFR 抗體的粒徑為40 nm 的納米金觀察到了EGFR 在細胞偽足結(jié)構(gòu)上的富集分布，并用掃描電鏡（Scanning Electronic Microscopy，SEM）成像結(jié)果印證了這一發(fā)現(xiàn)［44］。在近期的一項研究工作中，Guo等［45］利用抗體修飾的納米金探針對于細胞膜表面的人表皮生長因子受體2（HER2）進行了原位暗場成像（圖3（c）），他們設(shè)計了一對非對稱的納米金探針，1號探針（Au1）修飾有HER2抗體和炔基，2號探針（Au2）修飾有疊氮基和能夠起始滾環(huán)復(fù)制擴增（Rolling Circle Amplification，RCA）的DNA 鏈。在銅離子存在下，銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)引發(fā)納米金探針的聚集和光譜的紅移，而RCA反應(yīng)則進一步增強了紅移效應(yīng)。這一策略將RCA 引入暗場顯微成像分析，為利用暗場顯微鏡在活細胞水平觀測多種生物分子提供了可能。

2.2 用于對細胞內(nèi)生物分子進行原位觀測的PNPs

納米金、納米銀等探針可以被大多數(shù)類型的細胞所攝取，通過對內(nèi)吞進入細胞的PNPs進行成像和示蹤，可以實現(xiàn)對于生物分子的檢測和分析。

PNPs可以與細胞內(nèi)的小分子發(fā)生相互作用，在此過程中探針的光散射信號發(fā)生改變，反映出目標(biāo)分子空間分布和局部濃度的變化。例如，Xiong等［46］發(fā)展了一種以核殼結(jié)構(gòu)的Au@Ag復(fù)合納米棒為探針，通過單粒子暗場散射光譜，對活細胞中內(nèi)源性的硫化氫進行原位檢測的成像技術(shù)。由于硫化物對于銀的刻蝕作用，在探針表面形成Ag2S，誘導(dǎo)光譜發(fā)生紅移，因此通過檢測光譜變化的動力學(xué)，能間接測定局部硫化物濃度及其波動（圖4（a））。

PNPs也可用于蛋白酶活力的測定。Tajon等［28］構(gòu)建了一種納米等離子體“尺子”，包含兩個多層核殼結(jié)構(gòu)的Zn0.4Fe2.6O4@SiO2@Au納米顆粒，兩個顆粒以一段可以被蛋白酶caspase-3 特異性識別和切割的肽鏈連接。Caspase-3 是細胞激活凋亡過程的標(biāo)志性蛋白酶，細胞凋亡發(fā)生時，caspase-3 活性上升，將兩個納米顆粒中間的連接序列切斷，由于等離子體耦合作用的消失，散射光的強度發(fā)生明顯下降（圖4（b））。通過暗場顯微鏡對納米等離子體“尺子”的光強進行成像和定量分析，研究者們在藥物處理的慢性白血病細胞K562 細胞中檢測到了2～4 倍的caspase-3活性上調(diào)。該探針為實現(xiàn)可視化的高通量藥物篩選提供了全新的可能。

最近，Wang等［47］利用等離子體納米探針實現(xiàn)了對于單個細胞內(nèi)表觀遺傳信息的定位和定量表征。如圖4（c）所示，納米金和納米銀顆粒分別被修飾了針對不同胞嘧啶修飾形式的抗體，由于探針間距離靠近會引起光譜紅移，利用高光譜暗場顯微成像實現(xiàn)了單個細胞內(nèi)染色質(zhì)胞嘧啶羧基修飾（5-carboxylcytosine，5caC）的定量和空間定位，還得到了局部的修飾基團密度。研究者們通過比較不同細胞周期的成像結(jié)果，證明5caC這種表觀遺傳修飾在細胞周期中仍能保持穩(wěn)定。

圖3 暗場成像檢測細胞表面受體分布(a)納米金免疫標(biāo)記ErbB跨膜蛋白[43]，(b)納米銀標(biāo)記EGFR受體蛋白分布密度[44]，(c)納米金RCA反應(yīng)原位標(biāo)記HER2蛋白分布[45]Fig.3 Cell membrane receptors distribution detection by dark-field microscopy(a)ErbB transmembrane protein immunolabeled by AuNP[43],(b)EGFR receptor density mapped by AgNP probes[44],(c)In situ labeling of HER2 proteins by RCA reaction with AuNP probes[45]

等離子體納米探針在核酸成像分析方面也得到了廣泛應(yīng)用。Lee 等［48］在粒徑為40 nm 的納米金表面分別修飾了兩條DNA單鏈，它們能夠與乳腺癌易發(fā)基因（Breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）的兩段外顯子（exon8和exon12）對應(yīng)的mRNA序列互補結(jié)合。如圖5 所示，對于正常細胞內(nèi)的BRCA1剪切形式，exon8和exon12相隔較遠，結(jié)合的納米金探針不容易發(fā)生耦合；而對于一些突變致癌類型的mRNA，由于exon9、exon10、exon11在mRNA剪接的過程中丟失，exon8和exon12序列相鄰，結(jié)合的納米金探針距離靠近，引起LSPR 光譜發(fā)生紅移。這一方法實現(xiàn)了對于不同形式mRNA 剪接中間體的可視化，高靈敏的分辨。在最近的一項研究工作中，Li等［49］使用一對修飾有兩段非對稱DNA序列的、粒徑為20 nm 的納米金探針，這兩個探針能夠識別和結(jié)合同一mRNA分子的相鄰序列。單個20 nm的納米金的LSPR 散射光強度不足以被暗場顯微鏡捕捉，從而降低了游離探針的背景信號。當(dāng)目標(biāo)mRNA分子存在時，兩個納米金探針結(jié)合形成的納米金二聚體發(fā)生等離子體耦合，散射光強度大大提高。研究者們成功地利用該探針在腫瘤細胞中檢測到了單個mRNA分子。

2.3 用于觀察細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程的PNPs

等離子體納米探針具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性，特別適合活細胞實時成像，被應(yīng)用于納米顆粒的攝取和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程的研究。Qian 等［50］依托活細胞暗場成像系統(tǒng)，對攝取了納米金探針（30 nm）的細胞進行了長達數(shù)十個小時的連續(xù)觀察，捕捉到了修飾有核定位信號肽（Nuclear Localization Signal，NLS）的納米金進入細胞核的動態(tài)過程，并觀測了完整的細胞分裂周期過程中PNPs 的分布變化。納米顆粒進入細胞后，普遍會發(fā)生團聚，聚集狀態(tài)會對其生物學(xué)功能（如載藥、光熱治療等）產(chǎn)生影響［51-52］。傳統(tǒng)的熒光探針很難對納米顆粒的聚集狀態(tài)進行精確的分析。PNPs發(fā)生團聚時，聚集體內(nèi)的粒子數(shù)與其散射光譜的波長存在相關(guān)性，這一特性被用來區(qū)分探針在細胞內(nèi)的團聚程度。為了更準(zhǔn)確地對暗場圖像進行識別，研究人員將暗場圖像從常用的紅綠藍（RGB）三色模型轉(zhuǎn)換為包含有色度（Hue，H）、飽和度（Saturation，S）、亮度（Brightness，B）的HSB 顏色模型，后者能夠更加準(zhǔn)確地表現(xiàn)光譜特征［53］。借助于HSB 模型，Wang 等［54］對于納米金聚集引起的顏色變化進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)暗場圖像中信號的亮度和色度的比值與聚集體中包含的顆粒數(shù)目具有良好的相關(guān)性（圖6（a））。基于這一發(fā)現(xiàn)，該研究組進一步利用截面暗場顯微鏡對于細胞內(nèi)納米金探針的聚集狀態(tài)進行了成像和分析［25］。結(jié)果表明：細胞內(nèi)的納米金探針可以根據(jù)其團聚程度分為4 類（N=1～3、N=4～6、N=7～12、N≥12）。為了實時地追蹤納米金在細胞內(nèi)運輸和聚集的過程，Liu等［55］發(fā)展了暗場和熒光聯(lián)用的顯微成像系統(tǒng)，通過納米金表面修飾帶有熒光的DNA 鏈，構(gòu)建了同時具有LSPR 散射光信號和熒光信號的雙標(biāo)納米金探針（fPlas-gold），通過表達融合熒光蛋白的方式，對細胞內(nèi)的微管結(jié)構(gòu)和內(nèi)涵體、溶酶體等細胞器進行了熒光標(biāo)記，結(jié)合熒光和暗場兩個通道的成像信息，研究者們實時動態(tài)地觀測了納米金顆粒被細胞攝取、在胞內(nèi)沿著微管轉(zhuǎn)運并不斷聚集的過程（圖6（b）），并首次揭示了聚集體大小對其運動速率的影響。

圖4 暗場成像檢測活細胞內(nèi)分子(a)Au@Ag復(fù)合納米棒實時監(jiān)測胞內(nèi)硫化氫[46]，(b)納米等離子尺子監(jiān)測細胞凋亡過程[28]，(c)抗體修飾AuNP和AgNP等離子納米探針檢測染色質(zhì)胞嘧啶羧基修飾[47]Fig.4 Intracellular molecule real-time monitoring by dark-field microscopy(a)Intracellular sulphide sensing with Au@Ag core-shell nanorod[46],(b)Apoptosis detected by plasmon ruler[28],(c)Chromatin 5caC modification probed by immunolabeled AuNPs and AgNPs[47]

細胞在暗場成像時容易產(chǎn)生較為嚴(yán)重的散射光背景，通過使用甘油、蔗糖等介質(zhì)提高樣品的折射率等手段能夠減弱細胞背景［56］，但這種方法并不適用于活細胞樣品的觀察。為了實現(xiàn)胞內(nèi)PNPs 信號的高通量自動化分析，使用偏置模糊聚類算法（Biasmodified Fuzzy C-means algorithm，BM-FCM）［57］在減少彌散性的散射背景干擾方面取得了較好的效果［58］。然而，該方法并不能有效地過濾一些由細胞內(nèi)的囊泡或者脂肪滴所形成的點狀散射光斑。目前，對于暗場圖片中細胞內(nèi)的等離子體探針信號，仍然需要對暗場粒子光斑的形狀和顏色進行人工判斷，或通過采集光譜的方法來進行準(zhǔn)確的鑒定。

3 總結(jié)與展望

研究納米材料與細胞的相互作用，對于促進多種納米載體、納米探針和診療制劑的臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。作為一種與熒光成像互補的技術(shù)，暗場顯微成像在活細胞的可視化研究方面具有獨特的優(yōu)勢。近期，研究者們在等離子體納米探針的優(yōu)化和暗場成像系統(tǒng)的改進方面取得許多進展，促進了活細胞暗場成像的應(yīng)用。本文介紹了等離子體納米探針的最新進展，分三個方面總結(jié)了等離子體納米探針在細胞成像中的應(yīng)用。目前，在熒光成像領(lǐng)域，已有許多成熟而高效的軟件系統(tǒng)可以進行圖像的自動化處理和數(shù)據(jù)分析，而暗場的圖像和數(shù)據(jù)分析手段較為滯后，常常依賴于有經(jīng)驗的研究者進行手動分析，亟需開發(fā)相應(yīng)的自動化數(shù)據(jù)分析工具。相信隨著等離子體納米探針的進一步優(yōu)化，暗場顯微成像技術(shù)會對細胞研究產(chǎn)生更為深遠的影響。

圖5 納米金探針耦合檢測細胞質(zhì)中的mRNA剪接[48]Fig.5 Detection of mRNA splicing based on plasmon coupling of AuNPs[48]

圖6 納米金聚集與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(a)納米金聚集體暗場和對應(yīng)的SEM圖像[49]，(b)fPlas-gold探針被細胞攝取和在胞內(nèi)的運動與聚集[55]Fig.6 AuNP aggregation and intracellular trafficking(a)The correlative dark-field images and SEM images of aggregates with increasing number of AuNPs[49],(b)The internalization and trafficking of fPlas-gold[55]