李建濤 劉向榮 楊 杰 莊肅凱

(1.商洛學(xué)院化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院，726000 陜西商洛；2.陜西省尾礦綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，726000 陜西商洛；3.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，710054 西安)

0 引 言

褐煤在空氣中容易風(fēng)化，燃燒時(shí)對空氣污染嚴(yán)重，但隨著優(yōu)質(zhì)煤逐漸被采空，褐煤已成為我國主要使用的煤種之一。因此，減少褐煤利用過程中產(chǎn)生的環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)褐煤的高效清潔利用刻不容緩[1-3]。褐煤轉(zhuǎn)化利用的途徑主要有：氣化、液化、熱解和微生物降解等。其中，褐煤的氣化、液化和熱解技術(shù)成熟，但由于這幾種轉(zhuǎn)化技術(shù)需要高溫、高壓等苛刻條件，存在能耗高、對設(shè)備要求高等不足，人們渴望尋求一種工藝條件溫和、能耗低、對設(shè)備要求簡單的褐煤轉(zhuǎn)化利用技術(shù)[4-5]。20世紀(jì)80年代， FAKOUSSA[6]和COHEN et al[7]相繼報(bào)道了假單胞菌和白腐菌能夠降解煤，這一實(shí)驗(yàn)事實(shí)引起了各國研究者的極大興趣，煤的微生物降解作為煤清潔高效利用的新技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。細(xì)菌是煤降解過程中的主要作用菌之一，研究優(yōu)化其降解煤的工藝條件至關(guān)重要。

響應(yīng)曲面法(RSM)通過數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、建立模型、評估實(shí)驗(yàn)因素效果并尋求最優(yōu)化工藝參數(shù)，是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法[8]。該方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，能以較少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量和更經(jīng)濟(jì)的方式對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面研究，可以快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，廣泛地應(yīng)用于各類條件優(yōu)化實(shí)踐中，并取得了滿意的結(jié)果[9]。但響應(yīng)曲面法優(yōu)化煤的微生物降解工藝方面的報(bào)道較為鮮見。占迪等[10]采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化，得出了混合微生物菌群轉(zhuǎn)化褐煤產(chǎn)甲烷的最佳工藝及各條件對甲烷產(chǎn)量影響的顯著性。賈建軍等[11]通過曲面響應(yīng)法對熱帶假絲酵母溶煤的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，得出了培養(yǎng)基的最佳配方。王靜[12]采用響應(yīng)曲面法對多黏類芽孢桿菌降解硝酸氧化寶雞長焰煤的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。可見，響應(yīng)曲面法是微生物降解煤工藝參數(shù)和培養(yǎng)基組成等方面行之有效的優(yōu)化方法。

煤的氧化預(yù)處理有利于微生物對煤的降解，常用的方法有硝酸氧化法、雙氧水氧化法、臭氧氧化法、高溫空氣氧化法和光-氧氧化法等[13-14]。其中光-氧氧化法由于對煤原有結(jié)構(gòu)破壞程度小、氧化效率高、可操作性強(qiáng)、污染小等優(yōu)點(diǎn)，近年來有了長足的發(fā)展[15-16]。

前期菌-煤匹配實(shí)驗(yàn)篩選出降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的細(xì)菌優(yōu)勢菌株為惡臭假單胞菌，單因素實(shí)驗(yàn)確定的較優(yōu)工藝條件為：加煤量0.3 g/20 mL，接種量2.0 mL/20 mL，降解時(shí)間12 d，培養(yǎng)箱振蕩頻率160 r/min，煤樣粒度0.150 mm～0.075 mm，降解溫度30 ℃。在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對優(yōu)勢菌株惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的降解工藝進(jìn)行建模和優(yōu)化研究，旨在得出可靠的預(yù)測模型和最佳降解工藝條件，為褐煤的微生物高效轉(zhuǎn)化利用提供一定的技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 煤樣

實(shí)驗(yàn)所用煤樣為內(nèi)蒙勝利褐煤(SLH)。煤樣在60 ℃條件下，烘干3 h，經(jīng)破碎、粉磨、篩分得到粒度為0.150 mm～0.075 mm的煤樣。然后，利用自行設(shè)計(jì)加工的旋轉(zhuǎn)床光化學(xué)反應(yīng)器[17]對煤樣進(jìn)行光-氧氧化預(yù)處理，預(yù)處理?xiàng)l件為：加煤量20 g，煤樣粒度0.150 mm～0.075 mm，紫外光強(qiáng)度150 W，馬達(dá)轉(zhuǎn)速120 r/min，氧化時(shí)間42 h，通氧時(shí)間40 min[18]得到光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤(GSLH)。褐煤及光-氧氧化褐煤的工業(yè)分析和元素分析結(jié)果見表1。

表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of samples

1.2 菌株及復(fù)壯

1.2.1 菌株及培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌菌株為前期菌-煤匹配實(shí)驗(yàn)篩選的優(yōu)勢菌株惡臭假單胞菌(pseudomonasputida，PSP)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.4～7.6，固體培養(yǎng)基加15 g瓊脂。

1.2.2 菌株的活化及復(fù)壯

將斜面保藏的惡臭假單胞菌(PSP)接種至裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的試管，將試管放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，在溫度為30 ℃，振蕩頻率為160 r/min的條件下，培養(yǎng)2 d。然后在預(yù)先倒好的LB培養(yǎng)基平板上劃線，倒置于人工氣候培養(yǎng)箱，在溫度為30 ℃，相對濕度為80%條件下，培養(yǎng)2 d，觀察無雜菌后，用接種針挑少量菌體放入裝有50 mL無菌水和玻璃珠的錐形瓶中充分振蕩，用接種環(huán)蘸取一孔接種于裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，將試管放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，在30 ℃、振蕩頻率為160 r/min條件下，培養(yǎng)2 d后，用接種環(huán)蘸取一孔接種至裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，相同條件培養(yǎng)2 d，所得惡臭假單胞菌菌液作為實(shí)驗(yàn)?zāi)妇骸?/p>

1.3 降解實(shí)驗(yàn)

取試管若干，每個(gè)試管中裝LB液體培養(yǎng)基20 mL，做惡臭假單胞菌(PSP)對光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤(GSLH)的降解實(shí)驗(yàn)，設(shè)置三組平行實(shí)驗(yàn)。每只試管分別用移液槍量取1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL復(fù)壯好的惡臭假單胞菌(PSP)母菌液接種，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度為30 ℃，振蕩頻率為160 r/min，培養(yǎng)2 d，接種的培養(yǎng)基變渾濁。分別加入0.20 g，0.30 g，0.40 g粒度為0.150 mm～0.075 mm經(jīng)預(yù)處理的煤樣，放入恒溫培養(yǎng)箱，分別繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 d，12 d和18 d后，三組平行實(shí)驗(yàn)的降解產(chǎn)物分別離心(10 000 r/min，10 min)，上清液過濾，濾液再過0.22 μm微孔濾膜，以去離子水為參比，在分光光度計(jì)上檢測濾液在450 nm處的吸光度，求得三組平行實(shí)驗(yàn)的A450平均值，以此作為指標(biāo)評價(jià)惡臭假單胞菌對光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的降解效果[19-20]。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤(GSLH)效果影響較大的工藝條件(加煤量、接種量和降解時(shí)間，分別記為A，B和C)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化研究，其他條件選取單因素實(shí)驗(yàn)確定的較優(yōu)值。利用Box-Behnken設(shè)計(jì)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以A，B和C為自變量，降解液在450 nm處的吸光度A450為響應(yīng)值，表示為Y(A450)，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化研究，最終得出最佳工藝條件及響應(yīng)值Y(A450)與工藝條件取值之間的關(guān)系模型方程。實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)Table 2 Response surface design by Box-Behnken method

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及建模

利用Design Expert 8.0軟件，選擇Box-Behnken設(shè)計(jì)法進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，按照生成的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到對應(yīng)的降解液吸光度A450值。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

根據(jù)表3數(shù)據(jù)，利用軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，對所得模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，得出降解液吸光度響應(yīng)值Y(A450)對加煤量(A)，接種量(B)，降解時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)式回歸方程見公式(1)和公式(2)，其中公式(1)中的自變量為實(shí)際值，公式(2)中的自變量為代碼值。

Y(A450)=-14.862 88+69.894 25A+5.127 45B+0.711 85C-3.022 50AB-0.083 333AC+0.050 042BC-117.255 00A2-0.936 80B2-0.028 474C2

(1)

Y(A450)=5.59-0.75A+1.07B+0.62C-0.30AB-0.050AC+0.30BC-1.17A2-0.94B2-0.1.03C2

(2)

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table 3 Designed experiments and its results by Box-Behnken method

2.2 模型的可信度分析

對2.1節(jié)中擬合所得的惡臭假單胞菌降解光-氧氧化勝利褐煤(GSLH)過程的模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，回歸模型的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表4(其中，df為自由度；F為統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)值；P為顯著性檢驗(yàn)值；**表示影響非常顯著(P<0.01))。

表4 響應(yīng)曲面模型的二次回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface quadratic model

由表4還可知，在二次模型中，一次項(xiàng)A，B和C對響應(yīng)值Y(A450)的影響均非常顯著(P<0.01)；二次項(xiàng)A2，B2和C2對指標(biāo)Y(A450)的影響都非常顯著(P<0.01)；交互項(xiàng)中，AB對響應(yīng)值Y(A450)的影響較顯著(P<0.01)，AC對指標(biāo)Y(A450)的影響不顯著(P>0.05)，BC對指標(biāo)Y(A450)的影響非常顯著(P<0.01)。

圖1所示為標(biāo)準(zhǔn)曲線殘差概率與學(xué)生化殘差概率的擬合曲線。由圖1可以看出，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分布均勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的擬合性，殘差基本滿足正態(tài)分布，可用該回歸方程對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的降解效果進(jìn)行預(yù)測分析。

圖1 殘差的正態(tài)概率分布擬合曲線Fig.1 Fitting curve of normal probability distribution of residuals

2.3 工藝條件的響應(yīng)面分析及優(yōu)化

惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤工藝條件的響應(yīng)面函數(shù)模型和等高線見圖2～圖4。由此可更直觀地說明，加煤量、接種量和降解時(shí)間對降解液吸光度A450值的影響及因素間交互作用的強(qiáng)弱。其中，等高線形狀可以判斷降解過程中加煤量、接種量和降解時(shí)間兩兩之間的交互作用強(qiáng)弱，且在同一條等高線上所有降解方案都得到相同的降解液吸光度A450值。其坡度趨勢越陡則代表變化的趨勢越明顯，對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響則越大，而且通過得到的響應(yīng)曲面可以很直觀地看出指標(biāo)受各條件因素影響的程度大小[23-25]。

圖2所示為降解時(shí)間為12 d時(shí)，加煤量與接種量對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的等高線和響應(yīng)曲面。由圖2可知，當(dāng)接種量接近1.0 mL/20 mL時(shí)，隨著加煤量的增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先逐漸增大后逐漸減小。當(dāng)接種量接近3.0 mL/20 mL時(shí)，隨著加煤量的增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先逐增大后快速減?。划?dāng)加煤量接近0.20 g/20 mL，隨著接種量的增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度緩慢增大，最后趨于平緩。由此可知，加煤量和菌株接種量之間存在一定的相互影響，當(dāng)加煤量較小時(shí)，接種量增大到一定值后再持續(xù)增大，菌株對于煤的降解作用并不會增大。這是由于，當(dāng)加煤量較小時(shí)，當(dāng)細(xì)菌分泌的降解煤活性物質(zhì)(堿、酶、螯合劑和表面活性劑等)與煤結(jié)構(gòu)中對應(yīng)的活性點(diǎn)反應(yīng)以后還有過剩；當(dāng)加煤量過大時(shí)，煤漿濃度過大會對細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致細(xì)菌生長繁衍受阻，導(dǎo)致分泌的降解煤活性物質(zhì)量減少，從而降解效果變差，所以加煤量和菌株接種量要有一個(gè)合理配比，才能達(dá)到最佳降解效果。再根據(jù)F=79.11，P<0.000 1，可知加煤量與接種量的交互作用對降解液吸光度的影響顯著[21]。

圖2 加煤量和接種量對降解液吸光度的等高線和響應(yīng)曲面Fig.2 Effect of coal amount and inoculum size on contour and response surface of absorbance of degradation liquid

圖3所示為接種量為2.0 mL/20 mL時(shí)，加煤量與降解時(shí)間對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的等高線和響應(yīng)曲面。由圖3可知，當(dāng)降解時(shí)間接近6 d時(shí)，隨著加煤量增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先緩慢增大后徐徐減小，趨勢平緩；當(dāng)加煤量接近0.20 g/20 mL時(shí)，隨著降解時(shí)間延長，菌株降解煤所得降解液的吸光度緩慢增大，最后趨于平緩。由此可知，加煤量和降解時(shí)間之間存在一定的相互影響，但曲面變化趨勢較平緩，且當(dāng)降解時(shí)間延長至一定值后再持續(xù)增大，菌株對于煤的降解效果并無明顯變化。再根據(jù)F=2.16，P=0.184 7>0.05可知，加煤量與降解時(shí)間二因素間的交互作用對降解液吸光度的影響不顯著。

圖3 加煤量和降解時(shí)間對降解液吸光度的等高線和響應(yīng)曲面Fig.3 Effect of coal amount and degradation time on contour and response surface of absorbance of degradation liquid

圖4所示為加煤量為0.3 g/20 mL時(shí)，降解時(shí)間與接種量對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤降解液吸光度的等高線和響應(yīng)曲面。由圖4可知，當(dāng)接種量接近1.0 mL/20mL時(shí)，隨著降解時(shí)間延長，菌株降解煤所得降解液的吸光度先逐漸增大后逐漸減??；當(dāng)降解時(shí)間接近6 d時(shí)，隨著接種量增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先緩慢增大，最后稍有降低。結(jié)合等高線可知，當(dāng)降解時(shí)間在12 d到15 d之間，菌株接種量在2.5 mL/20 mL至3.0 mL/20 mL之間時(shí)，菌株降解煤所得的降解液吸光度可以達(dá)到較佳值。根據(jù)F=78.07，P<0.000 1可知，降解時(shí)間與接種量的交互作用對降解液吸光度的影響顯著。

圖4 接種量和降解時(shí)間對降解液吸光度的等高線和響應(yīng)曲面Fig.4 Effect of inoculum size and degradation time on contour and response surface of absorbance of degradation liquid

按照實(shí)際因素多元二次方程回歸擬合所得的模型方程，根據(jù)快速上升法，軟件給出惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的最佳工藝條件為：加煤量0.26 g/20 mL、 接種量2.71 mL/20 mL、降解時(shí)間14.50 d，對應(yīng)降解液的吸光度A450值為6.256 87。

按照最佳工藝條件，進(jìn)行三組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測得降解液的吸光度A450的平均值為5.936，與模型預(yù)測值偏差5.12%，偏差較小。因此，可認(rèn)為利用響應(yīng)曲面分析法得到的惡臭假單胞菌降解光-氧氧化勝利褐煤的模型可信度高，得到的降解工藝條件具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

按照此最佳工藝條件進(jìn)行惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的實(shí)驗(yàn)，降解率為40.98%，降解液體產(chǎn)物的正己烷萃取物中含有34種化合物，主要為酯、雜環(huán)化合物、酰胺、烷烴和烯烴，可進(jìn)一步研究從降解液中分離提取烴類燃料油和其他化學(xué)品。

3 結(jié) 論

1) 利用Design-Expert 8.0軟件，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)建立響應(yīng)曲面模型，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)二次模型的失擬項(xiàng)不顯著，復(fù)相關(guān)系系數(shù)為0.999 0，模型擬合度好、可靠性高。在二次模型三個(gè)因素中，一次項(xiàng)和平方項(xiàng)均對響應(yīng)值影響顯著；交互作用中，加煤量和接種量、接種量和降解時(shí)間之間的交互作用顯著，而加煤量和降解時(shí)間之間的交互作用不顯著。

2) 響應(yīng)曲面優(yōu)化得出的惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的最佳條件為：加煤量為0.26 g/20 mL、接種量為2.71 mL/20 mL、降解時(shí)間為14.50 d，對應(yīng)降解液的吸光度A450值為6.256 87。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)際測得降解液的吸光度A450值為5.936，模型預(yù)測值偏差5.12%，與理論值較為一致，可見該模型較好模擬了各變量因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。

3) 按照此最佳工藝條件進(jìn)行惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內(nèi)蒙勝利褐煤的實(shí)驗(yàn)，降解率為40.98%，降解液體產(chǎn)物的正己烷萃取物中含有34種化合物，主要為酯、雜環(huán)化合物、酰胺、烷烴和烯烴，可進(jìn)一步研究從降解液中分離提取烴類燃料油和其他化學(xué)品。