王楠楠,蘇 凱,崔憶旋,陶 露,時宗芬,陳曉芬,翟麗倩,馬士崟,趙 報

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:mashiyinent@sina.com;#共通訊作者,E-mail:Zhaobao86@126.com)

鼻咽癌發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁,是一種頭頸部常見的惡性腫瘤。其病因與遺傳、環(huán)境以及EB病毒等有關(guān)。好發(fā)于中年男性,但可發(fā)于任何年齡組。發(fā)病位置隱蔽,臨床癥狀不明顯,常常因廣泛侵潤周圍組織及發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移后才發(fā)現(xiàn),故診斷較困難,且預(yù)后較差。與T1-2期鼻咽癌患者相比,T4期患者的5年局部控制率較差,預(yù)后不良,因此臨床治療鼻咽癌的關(guān)鍵為有效降低腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率,提高晚期腫瘤患者的局部控制率[1]。二甲雙胍(metformin)是一種有效的口服降血糖藥物,近年來研究發(fā)現(xiàn),該藥能降低糖尿病患者的腫瘤罹患率,抑制腫瘤細(xì)胞的生長[2];已有研究表明二甲雙胍能顯著提高非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌患者生存率。它能夠激活A(yù)MPK通路,抑制細(xì)胞有氧呼吸,從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3-9]。還有多項研究證實(shí)二甲雙胍可以提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長及侵襲、遷移能力,為惡性腫瘤治療提供了新的研究方向。已有研究證明壞死性凋亡是一種可調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡方式,目前的研究表明,壞死性凋亡是由RIPK3(receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3)以及其底物MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)共同介導(dǎo),對于機(jī)體的生長發(fā)育和組織器官的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。此外,對腫瘤耐藥細(xì)胞株的研究證實(shí),在規(guī)避腫瘤多藥耐藥方面壞死性凋亡誘導(dǎo)劑具有“廣譜性”[10-14]。紫草素(shikonin)是從紫草中提取的一種萘醌類物質(zhì)。丙酮酸脫氫酶作為糖酵解的關(guān)鍵酶,已有研究表明,紫草素不僅可以通過抑制其亞型PKM2從而抑制糖酵解,還可以通過抑制PKM2誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡[15]。本研究旨在探討二甲雙胍和紫草素聯(lián)用對于鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的作用形式及其可能分子機(jī)制,為鼻咽癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z購自美國ATCC公司,培養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(含EDTA)購自公司美國Hyclone公司,胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司,MTT試劑、雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ FITC/PI)、BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天公司,Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3蛋白抗體購自美國CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的CNE-2Z接種入96孔板,調(diào)整每孔培養(yǎng)液為100 μl,細(xì)胞數(shù)為7 000。將細(xì)胞分為4組:空白組、二甲雙胍組、紫草素組、二甲雙胍+紫草素組。待細(xì)胞貼壁后,空白組不做處理,二甲雙胍組加入濃度為40 mmol/L的二甲雙胍藥液,紫草素組加入濃度為3 μmol/L的紫草素藥液,二甲雙胍+紫草素組加入濃度為40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L的紫草素混合藥液,放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24,48,72 h,每孔加入15 μl濃度為5 g/L的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,去上清,每孔加入150 μl DMSO,37 ℃孵育30 min,檢測吸光度值(OD490)。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD490/對照組OD490×100%。取平均值繪制藥物劑量效應(yīng)曲線,計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 藥物協(xié)同作用Isobologram分析

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得到不同濃度二甲雙胍、紫草素對CNE-2Z細(xì)胞的IC50,分別設(shè)為M和S,標(biāo)于橫坐標(biāo)軸和縱坐標(biāo)軸上,連接M、S兩點(diǎn)的直線為相加線。同時根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,求得不同濃度二甲雙胍與低濃度紫草素(3 μmol/L)聯(lián)用時的IC50濃度b,若Q(a,b)點(diǎn)在MS連線上,則表示兩藥聯(lián)用為相加作用;在該連線以下,表示兩藥聯(lián)用為協(xié)同作用;在該連線以上,表示兩藥聯(lián)用為拮抗作用[16]。

1.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

選對數(shù)期生長狀態(tài)良好的CNE-2Z細(xì)胞,接種于6孔板(3×105個/孔),將細(xì)胞分為4組:空白組、二甲雙胍組、紫草素組、二甲雙胍+紫草素組。待細(xì)胞貼壁后,空白組不做處理,二甲雙胍組加入濃度為40 mmol/L的二甲雙胍藥液,紫草素組加入濃度為3 μmol/L的紫草素藥液,二甲雙胍+紫草素組加入濃度為40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L的紫草素混合培養(yǎng)液。放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞,600g離心5 min,用PBS清洗2次,其中空白組分為4份,分別為空白對照組、Annexin Ⅴ-FITC組、PI組以及對照組。每組加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液,加入2.5 μl的Annexin Ⅴ-FITC染色液,4 ℃避光冰浴15 min加入5 μl PI染色液,繼續(xù)4 ℃避光冰浴5 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲遷移能力

將按1 ∶4稀釋好的matrigel鋪于Transwell小室濾膜上，置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜凝膠。取對數(shù)期生長的CNE-2Z細(xì)胞以每孔30×104接種于6孔板，貼壁后細(xì)胞分為4組：空白組、二甲雙胍組、紫草素組、二甲雙胍+紫草素組，分別加入2 ml培養(yǎng)液、濃度為40 mmol/L的二甲雙胍藥液、濃度為3 μmol/L的紫草素藥液、濃度為40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L的紫草素混合藥液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h吸除培養(yǎng)液，PBS清洗2次，消化離心細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/ml。每組取100 μl細(xì)胞懸液分別加入含有matrigel和不含matrigel的Transwell小室中，向24孔板下室加入500 μl含血清的完全培養(yǎng)液，將接種好的24孔板放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h吸去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，吸去多聚甲醛，用棉簽輕輕擦去matrigel及小室內(nèi)的細(xì)胞，用結(jié)晶紫避光染色15 min，PBS洗3次，晾干后于顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞集落形成能力

取對數(shù)期生長的CNE-2Z細(xì)胞以每孔3×105個接種于6孔板,待貼壁后吸去上清并分別加入2 ml培養(yǎng)液、濃度為40 mmol/L的二甲雙胍藥液、濃度為3 μmol/L的紫草素藥液濃度為40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L的紫草素混合藥液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h。吸去培養(yǎng)液,用PBS洗2次,消化離心細(xì)胞，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/ml。取30 μl細(xì)胞懸液種于6孔板中，每孔加入2 ml培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)6 d。每個處理組細(xì)胞設(shè)置2個復(fù)孔,待培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的克隆后,吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，吸去多聚甲醛，每孔加入1 ml結(jié)晶紫染液,避光染色15 min，PBS洗3次，晾干后于顯微鏡下計數(shù)。

1.8 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3、MMP9蛋白表達(dá)水平

取對數(shù)期生長良好的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z細(xì)胞，以每孔3×105接種于6孔板，PBS洗2次，加入60 μl含有PMSF的裂解液，4 ℃過夜，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，計算出每組樣本所需上樣量。將蛋白總量相同的樣本加入到蛋白凝膠內(nèi)，90 V恒壓待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部后終止。80 V恒壓將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫?fù)u床下用快速封閉液封閉15 min，使用TPBS洗滌5 min，重復(fù)3次。按1 ∶1 000的比例分別稀釋β-actin、Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3、MMP-9一抗，搖床搖晃1 h，4 ℃過夜。用TPBS按照1 ∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG孵育2 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間差異采用多因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍和紫草素聯(lián)用對CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示,二甲雙胍與紫草素聯(lián)合作用于細(xì)胞48 h,細(xì)胞抑制率顯著強(qiáng)于二者單藥作用(見圖1),與單藥組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外,通過Isobologram分析發(fā)現(xiàn),40 mmol/L二甲雙胍及其與3 μmol/L紫草素聯(lián)用對CNE-2Z細(xì)胞的IC50坐標(biāo)(3,40)落在M(二甲雙胍IC50)與S(紫草素IC50)相加線左下方(見圖2),表明40 mmol/L二甲雙胍和3 μmol/L紫草素聯(lián)用具有協(xié)同作用,所以選用40 mmol/L的二甲雙胍和3 μmol/L紫草素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 Isobologram分析二甲雙胍與紫草素聯(lián)用的協(xié)同作用Figure 2 Isobologram analysis of the synergistic effect of metformin combined with shikonin

與其他三組比較,*P<0.05圖1 不同處理方式對CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effects of metformin and shikonin on proliferation of CNE-2Z cells

2.2 二甲雙胍和紫草素聯(lián)用對CNE-2Z細(xì)胞凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FITC雙染結(jié)果顯示,空白組凋亡率為9.79%±0.7%,二甲雙胍組細(xì)胞凋亡率為21.82%±0.5%,紫草素組細(xì)胞凋亡率為22.05%±0.5%,二甲雙胍+紫草素組細(xì)胞的凋亡率為55.8%±0.3%。二甲雙胍、紫草素都可以促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞凋亡,且聯(lián)合效果更加顯著,與單藥組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

圖3 不同處理方式對CNE-2Z細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effects of metformin and shikonin on apoptosis of CNE-2Z cells

2.3 二甲雙胍和紫草素聯(lián)用對CNE-2Z細(xì)胞侵襲遷移能力的影響

檢測結(jié)果表明,與單藥相比,二甲雙胍和紫草素聯(lián)用能明顯抑制CNE-2Z細(xì)胞的侵襲遷移能力,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

2.4 二甲雙胍和紫草素聯(lián)用對CNE-2Z細(xì)胞克隆形成能力的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,二甲雙胍+紫草素組細(xì)胞集落數(shù)明顯低于二甲雙胍組、紫草素組,與單藥組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

與其他三組比較,*P<0.05圖4 不同處理方式對CNE-2Z細(xì)胞侵襲遷移能力的影響Figure 4 Effects of metformin and shikonin on invasion and migration of CNE-2Z cells

圖5 不同處理方式對CNE-2Z細(xì)胞克隆形成的影響Figure 5 Effects of metformin and shikonin on the colony formation of CNE-2Z cells

2.5 二甲雙胍和紫草素聯(lián)用對CNE-2Z細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及MMP-9、RIP1、RIP3表達(dá)的影響

檢測結(jié)果表明,二甲雙胍和紫草素聯(lián)用可下調(diào)Bcl-2和MMP-9的表達(dá)和上調(diào)Bax、RIP1和RIP3的表達(dá),與單藥組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。

與其他三組比較,*P<0.05圖6 不同處理方式對CNE-2Z細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effects of metformin and shikonin on expression of apoptosis-related proteins in CNE-2Z cells

3 討論

鼻咽癌是我國高發(fā)惡性腫瘤之一,且近年來發(fā)病人群有逐漸擴(kuò)大的趨勢,腫瘤細(xì)胞由于其快速生長的特點(diǎn),并且腫瘤組織的血管結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致供血減少,故缺氧是腫瘤細(xì)胞普遍存在的狀態(tài),因此糖酵解在腫瘤細(xì)胞中代謝活躍。二甲雙胍抗腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡作用是近幾年的研究熱點(diǎn),它作為降糖藥物最重要的機(jī)制便是AMPK依賴的降糖機(jī)制。它能特異性地抑制細(xì)胞中的線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ,下調(diào)丙酮酸脫氫酶表達(dá),引起線粒體有氧呼吸功能減弱、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生成減少,AMP/ATP的比例升高,從而激活A(yù)MPK,抑制糖質(zhì)新生、脂肪生成和蛋白質(zhì)合成,因此,AMPK同樣可以通過此途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3]。丙酮酸激酶作為糖酵解的限速酶,其亞型PKM2在腫瘤細(xì)胞里特異、高度表達(dá),紫草素作為一種萘醌類物質(zhì)普遍認(rèn)為是PKM2的抑制劑,其抗腫瘤機(jī)制研究已取得一定進(jìn)展,它通過抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)不足從而抑制其增殖[17],除此之外,紫草素還能夠通過調(diào)控受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIPK1)/受體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3,RIPK3)的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。

凋亡蛋白Bcl-2和Bax的作用機(jī)制是通過線粒體途徑介導(dǎo)cyt-c等物質(zhì)的釋放、改變線粒體外膜的通透性、改變線粒體形態(tài)、影響膜間隙蛋白釋放及caspase級聯(lián)活化等途徑影響細(xì)胞凋亡過程而調(diào)控細(xì)胞凋亡[18-21],二甲雙胍和紫草素聯(lián)合作用時Bcl-2活性下調(diào),Bax活性上調(diào)且較單藥作用更明顯,說明聯(lián)合用藥可能調(diào)控線粒體凋亡途徑促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞凋亡且較單藥作用更強(qiáng)。

MMP9能夠?qū)Ｒ唤到饣ぶ械蘑粜湍z原蛋白,從而使腫瘤細(xì)胞失去阻隔作用,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。壞死性凋亡是紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式之一,RIP1和RIP3是壞死性凋亡的關(guān)鍵蛋白,RIP1通過激酶依賴性和非依賴性功能調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和炎癥,RIP1和RIP3最后通過磷酸化的方式形成復(fù)合體,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。當(dāng)二甲雙胍和紫草素聯(lián)合作用于CNE-2Z細(xì)胞時,MMP9活性較單藥明顯降低,RIP1和RIP3活性較單藥明顯增高,表明聯(lián)合用藥可抑制腫瘤細(xì)胞基膜降解并協(xié)同促進(jìn)紫草素誘導(dǎo)的壞死性凋亡作用。

綜上,二甲雙胍聯(lián)合紫草素作用于鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞具有協(xié)同作用,可通過激活線粒體凋亡途徑[23,24]、促進(jìn)細(xì)胞壞死性凋亡來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,及降低MMP9活性從而抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的侵襲轉(zhuǎn)移。