楊吉平,費 琳,鐘鈺西,余 蕾,茍興春*

(1西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室,西安 710021;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科;*通訊作者,E-mail:447962736@qq.com)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一,通過溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)支架術(shù)使心肌組織恢復(fù)血流供應(yīng)的同時常常合并出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)[1]。如何避免或減輕IRI已成為AMI治療研究中的難點,心肌IRI是一個極其復(fù)雜的病理生理過程,其機(jī)制尚不完全清楚,主要包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng),以及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死等[2-4]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為,壞死是被動的、不可逆的細(xì)胞死亡。然而,最近研究發(fā)現(xiàn)了一種可受調(diào)控的程序性細(xì)胞壞死(necroptosis)途徑,通過阻斷這種細(xì)胞壞死通路,可以明顯縮小心肌梗死的面積,改善心功能[5]。褪黑素(melatonin,MLT)是由松果體產(chǎn)生的一種內(nèi)源性吲哚類激素,近年來的研究表明,MLT是保護(hù)心肌組織缺血性損傷很有潛力的藥物[6],但是MLT抗心肌缺血的機(jī)制尚未完全闡明,成為限制其進(jìn)一步研發(fā)和臨床應(yīng)用的瓶頸[7]。為此,本研究從程序性細(xì)胞壞死信號通路為切入點,探討MLT在H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷中的保護(hù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

H9c2細(xì)胞為大鼠胚胎心肌細(xì)胞株,購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,CCK-8細(xì)胞增殖和毒性檢測試劑盒購自上海睿時生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性檢測試劑盒購自廣州偉伯科技有限公司;MLT和碘化丙啶(propidium iodide,PI)購自美國Sigma公司;受體相互作用蛋白激酶3(receptor interaction protein kinase 3,RIPK3)抑制劑GSK-872購自北京百奧萊博科技有限公司;兔抗RIPK3多克隆抗體購自美國Milipore公司,兔抗磷酸化鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶(phosphorylated Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase,p-CaMK)Ⅱ多克隆抗體購自上海Cell Signaling Technology公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;SpectraMax iD3酶標(biāo)儀購自上海美谷分子儀器公司,Western blot成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.3 分組及藥物干預(yù)

將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、H/R組、MLT組、RIPK3抑制劑GSK-872組。根據(jù)參考文獻(xiàn)[8],將細(xì)胞置于37 ℃,95%N2,5%CO2的培養(yǎng)箱中缺氧處理4 h,然后,在20%O2,5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧6 h,建立H/R模型。MLT組和GSK-872組細(xì)胞在H/R前2 h分別給予MLT(終濃度100 μmol/L)和GSK-872(終濃度5 μmol/L)預(yù)處理。對照組是用DMEM培養(yǎng)液在正常條件下培養(yǎng),不進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

細(xì)胞處理結(jié)束后,先將培養(yǎng)液吸棄,用0.01 mol/L PBS洗3次,加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液100 μl及CCK-8檢測液10 μl,在37 ℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測吸光度(450 nm)。

1.5 培養(yǎng)液中LDH活性檢測

測定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性來判斷心肌細(xì)胞損傷的情況。各組細(xì)胞處理結(jié)束后,收集培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液,嚴(yán)格按照廣州偉伯科技有限公司試劑盒說明書方法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性。

1.6 碘化丙啶(PI)染色觀察細(xì)胞壞死情況

各組細(xì)胞處理結(jié)束后,棄掉培養(yǎng)液,用0.01 mol/L PBS洗3次,加入終濃度為5 μmol/L的碘化丙啶(propidium iodide,PI)及Hoechst 33342(5 mg/L),37 ℃,避光孵育30 min,用PBS洗3次,每次5 min;4%多聚甲醛固定10-15 min;激光共聚焦顯微鏡觀察拍照,并比較各組壞死細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 Western blot檢測RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白的表達(dá)量

細(xì)胞處理結(jié)束后立即吸去培養(yǎng)液,用冰PBS洗滌2次,棄去PBS并吸干殘液,加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100 μl,收集細(xì)胞于離心管中,在冰上超聲裂解20 min,4 ℃離心,12 000 r/min,15 min;將上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中,用BCA法進(jìn)行蛋白定量,每孔取30 μg總蛋白上樣,SDS-PAGE電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉1 h,TBST漂洗3次,分別加入RIPK3抗體(1 ∶400)、p-CaMK Ⅱ抗體(1 ∶800)和β-actin抗體(1 ∶2 000),4 ℃過夜,TBST漂洗后,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔的二抗(1 ∶3 000),室溫孵育2 h;TBST漂洗3次,每次10 min,ECL發(fā)光,蛋白表達(dá)條帶應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

以上數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計,多組間的比較采用單因素方差分析,以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞活力檢測結(jié)果

與對照組相比,H/R處理后,倒置顯微鏡下觀察到H9c2心肌細(xì)胞明顯皺縮,胞體變短,密度減小,細(xì)胞活力顯著下降(P<0.01)。與H/R組相比,MLT組大多數(shù)細(xì)胞呈長梭形,死亡的細(xì)胞明顯減少,密度增大,細(xì)胞活力顯著提高(P<0.01);GSK-872組細(xì)胞密度也顯著增大,呈梭形,與MLT組相比細(xì)胞活力沒有明顯變化(P>0.05,見圖1)。

2.2 MLT對H/R處理后H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響

與對照組相比,H/R組H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高(P<0.05)。與H/R組相比,MLT組H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯降低(P<0.01)。GSK-872組LDH活性與MLT組相比無顯著差異(P>0.05,見圖2)。

與對照組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01圖2 MLT對H/R處理后H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響 (n=6)Figure 2 Effect of MLT on LDH activity in cell culture medium after H/R treatment (n=6)

2.3 MLT對H/R處理的H9c2心肌細(xì)胞壞死數(shù)量的影響

用PI染色觀察各組細(xì)胞壞死的情況,與對照組比較,H/R組H9c2心肌細(xì)胞PI陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)。與H/R組相比,MLT組H9c2心肌細(xì)胞PI陽性細(xì)胞顯著減少(P<0.01);GSK-872組PI染色陽性細(xì)胞數(shù)與MLT組相比無顯著差異(P>0.05,見圖3)。

與對照組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01圖3 MLT對H/R處理的H9c2心肌細(xì)胞壞死數(shù)量的影響 (n=6)Figure 3 Effect of MLT on number of necrotic H9c2 cells after H/R treatment (n=6)

2.4 MLT對H/R處理的H9c2心肌細(xì)胞RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比,H/R組H9c2心肌細(xì)胞RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白的表達(dá)均顯著增加(P<0.01)。與H/R組相比,MLT組H9c2心肌細(xì)胞RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01);而GSK-872組RIPK3和p-CaMK Ⅱ的表達(dá)與MLT組相比無顯著差異(P>0.05,見圖4)。

與對照組比較,**P<0.01;與H/R組比較,##P<0.01圖4 各組H9c2心肌細(xì)胞中RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白表達(dá)水平的比較 (n=3)Figure 4 Expressionof RIPK3 and p-CaMK Ⅱ proteins in H9c2 cells after different treatment (n=3)

3 討論

治療急性缺血性心臟病的核心是快速疏通堵塞或狹窄的冠狀動脈,恢復(fù)心肌血液供應(yīng),但缺血的心肌組織在血供恢復(fù)的同時,常常伴有IRI,反而加重心肌損傷,這是AMI患者治療后出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥,甚至死亡的主要原因[9]。本研究選用大鼠胚胎期H9c2心肌細(xì)胞作為實驗對象,先將細(xì)胞缺氧處理4 h,然后再復(fù)氧6 h以模擬體內(nèi)心肌IRI,結(jié)果顯示H/R組H9c2細(xì)胞活力明顯下降,細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH釋放量明顯增加,PI染色陽性細(xì)胞數(shù)較對照組顯著增加,表明經(jīng)過H/R處理后,細(xì)胞壞死的數(shù)量明顯增多,而Western blot檢測顯示,H/R組細(xì)胞的RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白表達(dá)水平較對照組顯著增加,表明這種細(xì)胞死亡是由RIPK3/CaMK Ⅱ信號通路介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死,這與文獻(xiàn)報道一致[10]。

在心肌IRI中,細(xì)胞的死亡方式有兩種,即細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。近年研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的細(xì)胞壞死方式,稱之為“程序性細(xì)胞壞死”,它是可以被調(diào)控的,當(dāng)“死亡信號”被激活或細(xì)胞凋亡被抑制時,受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)與RIPK3發(fā)生結(jié)合,并促使RIPK3磷酸化,進(jìn)而激活下游信號,如混合譜系激酶域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL),形成壞死小體,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11,12],并可誘發(fā)明顯的炎癥反應(yīng),進(jìn)一步加重心肌損傷[13]。隨著程序性壞死信號通路研究的不斷深入,針對其關(guān)鍵分子的干預(yù)策略在心肌損傷與重構(gòu)中逐漸被人們所關(guān)注。

MLT是松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素,目前研究發(fā)現(xiàn)MLT在心血管系統(tǒng)的多種病理模型中具有明確的調(diào)節(jié)作用,尤其是其具有明顯的抗心肌IRI作用,并且由于其屬于內(nèi)源性物質(zhì),幾乎沒有毒副作用,因此,MLT在心血管疾病中的應(yīng)用將是一個極有前途的研究領(lǐng)域。另有研究結(jié)果表明,MLT可降低大鼠心肌IRI的梗死面積,是與其減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡有關(guān)[14],但MLT保護(hù)心肌的分子機(jī)制尚未完全闡明,成為限制其臨床應(yīng)用的瓶頸。本研究結(jié)果顯示:MLT可顯著升高經(jīng)H/R處理的H9c2心肌細(xì)胞的活力,降低細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH釋放量,減少壞死細(xì)胞的數(shù)量,這表明MLT對H/R處理的H9c2心肌細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。Wesern blot結(jié)果顯示,MLT顯著下調(diào)H/R處理的H9c2細(xì)胞中RIPK3和p-CaMK Ⅱ蛋白的表達(dá),提示MLT減少細(xì)胞壞死可能與其抑制RIPK3/CaMK Ⅱ信號通路有關(guān)。

最近有研究表明,在心肌組織中,CaMK Ⅱ是RIPK3的下游分子,RIPK3可直接與CaMK Ⅱ結(jié)合,并使其磷酸化,這是心肌細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的關(guān)鍵[15]。GSK-872是RIPK3的一種特異性抑制劑,能高親和力結(jié)合RIPK3激酶的結(jié)構(gòu)域[16]。本研究將GSK-872預(yù)處理的H9c2心肌細(xì)胞作為陽性參照,以探討MLT對H9c2心肌細(xì)胞H/R損傷的分子機(jī)制和保護(hù)效果,結(jié)果顯示GSK-872可顯著增加H/R組細(xì)胞的活力,減低LDH的釋放,減少壞死細(xì)胞的數(shù)量,并下調(diào)H/R處理后p-CaMK Ⅱ蛋白的表達(dá)。

綜上所述,本研究用MLT作用于H/R處理的H9c2心肌細(xì)胞,研究結(jié)果顯示MLT可通過抑制RIPK3/CaMK Ⅱ信號通路,從而減少細(xì)胞壞死的發(fā)生。然而,MLT在H/R損傷中保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞的CaMK Ⅱ下游機(jī)制仍然不清楚,是否能通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開放,降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載,有待進(jìn)一步研究。