朱啟淦,陳麗丹,禹 樂,劉金發(fā),任紅岳,耿月華,魁國(guó)菊,孟加榕*

(1中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○九醫(yī)院,廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,漳州 363000;2中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○九醫(yī)院,廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院老年病房;*通訊作者,E-mail:mengjiarong@sina.com)

肺癌是常見的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率居各類惡性腫瘤之首,嚴(yán)重危害人群健康[1]。手術(shù)仍是早期患者的最佳治療手段,晚期肺癌的主要治療方案一直是細(xì)胞毒化療,但晚期肺癌患者的生存率及預(yù)后并不理想[2]。EGFR是一種受體型酪氨酸激酶,通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制腫瘤生長(zhǎng),與新生血管生成、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系,近10年來,針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體的酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)在臨床取得顯著療效,引領(lǐng)肺癌靶向治療的前行步伐[3,4]。靶向治療首先要明確EGFR基因狀態(tài),以便合理用藥。本實(shí)驗(yàn)采用ARMS法對(duì)廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科確診的232例肺腺癌不同標(biāo)本類型檢測(cè)EGFR基因突變,分析與患者性別、年齡以及病理類型之間的關(guān)系,進(jìn)而為肺腺癌患者個(gè)體化靶向治療提供分子病理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院2019年1-12月肺腺癌標(biāo)本行EGFR檢測(cè)232例。其中男性141例,女性91例;年齡27-89歲,中位年齡64歲。手術(shù)切除標(biāo)本16例,肺活檢標(biāo)本126例(包括肺穿刺和支氣管鏡活檢),惡性胸腔積液細(xì)胞塊標(biāo)本35例,轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本55例(包括淋巴結(jié)、骨、肝等轉(zhuǎn)移)。

1.2 試劑與儀器

GS-脫蠟液購(gòu)于哈爾濱格林標(biāo)本技術(shù)開發(fā)有限公司,石蠟包埋組織切片核酸(paraffin embedded tissue sections DNA,FFPE DNA)提取試劑盒、人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司,Amoydx-Giraffe紫外分光光度計(jì)SMA4000,美國(guó)ABI7500 Real Time PCR System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 FFPE DNA的提取

按5-10 μm的厚度對(duì)石蠟包埋組織進(jìn)行切片,取5-10片置于1.5 ml離心管中(組織面積<0.5 cm2者適當(dāng)增加切片數(shù)量),加入GS-脫蠟液1 ml[5],振蕩混勻10 s,室溫13 000g離心2 min,小心去除上清(勿吸到沉淀);加入1 ml無(wú)水乙醇,振蕩混勻10 s,室溫13 000g離心2 min,小心去除上清,室溫開蓋放置15 min或37 ℃下開蓋放置5-10 min,使乙醇充分揮發(fā),按FFPE DNA提取試劑盒操作方法及步驟進(jìn)行樣本基因組DNA提取。DNA需立即檢測(cè),或-20 ℃保存。

1.4 FFPE DNA濃度測(cè)定

應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品濃度與質(zhì)量,所提DNA濃度的OD260/280應(yīng)在1.8-2.0之間,OD260/230應(yīng)大于2。DNA稀釋濃度為2-3 ng/μl。

1.5 ARMS PCR檢測(cè)EGFR基因突變

分別向42.3 μl已稀釋為2 ng/μl待檢樣品DNA、EGFR陽(yáng)性質(zhì)控品、純化水中加入2.7 μl Taq酶,將混好的DNA樣品依次取5 μl加入8聯(lián)PCR反應(yīng)條中,離心,放入ABI7500實(shí)時(shí)PCR儀中。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個(gè)循環(huán);93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s(采集熒光),72 ℃ 20 s,31個(gè)循環(huán)。

1.6 結(jié)果判斷

EGFR基因突變29位點(diǎn)包括EGFR基因的18、19、20及21外顯子,突變包含Exon-18(G719A、G719S、G719C)、Exon-19(19-Del)、Exon-20(20-Ins、T790M、S768I)、Exon-21(L861Q、L858R)等。突變結(jié)果判斷嚴(yán)格按照試劑盒說明書提供檢驗(yàn)結(jié)果解釋進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以例數(shù)(率)表示,組間比較用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARMS法檢測(cè)結(jié)果

232例肺腺癌標(biāo)本EGFR基因突變104例,突變率為44.83%(104/232),其中19Del和L858R點(diǎn)突變分別占20.26%(47/232)和22.41%(52/232),19Del和L858R占總突變的95.19%(99/104);稀有突變?yōu)?.16%(5/232),1例L858R和T790M雙突變;1例19Del和T790M雙突變;1例G719X和L861Q雙突變;1例20-Ins突變;1例L861Q。EGFR基因擴(kuò)增曲線見圖1。

圖1 肺腺癌標(biāo)本EGFR基因擴(kuò)增曲線Figure 1 Amplification curves of EGFR gene in lung adenocarcinoma specimens

2.2 不同病理參數(shù)相互間比較

年齡≥60歲者突變率44.06%(63/143),年齡<60歲者突變率46.07%(41/89),兩者EGFR基因突變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。手術(shù)切除標(biāo)本突變率43.75%(7/16),肺活檢標(biāo)本突變率38.89%(49/126),惡性胸腔積液細(xì)胞塊標(biāo)本突變率62.86%(22/35),轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本突變率47.27%(26/55),不同標(biāo)本類型突變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。男性患者突變率36.17%(51/141),女性患者突變率58.24%(53/91),女性患者的EGFR突變率高于男性,性別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

表1 EGFR基因突變率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)

3 討論

EGFR基因位于人類7號(hào)染色體的短臂上,包括28個(gè)外顯子,其酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18-24編碼。EGFR基因是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表達(dá)產(chǎn)物,定位于細(xì)胞膜上。EGFR主要通過信號(hào)傳導(dǎo)方式進(jìn)入細(xì)胞核,可引起細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平增加,表達(dá)水平的增加可引起其下游信號(hào)傳遞過程異常,引起細(xì)胞生長(zhǎng)加快,細(xì)胞生存期延長(zhǎng),同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后以及治療反應(yīng)等相關(guān)[6]。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)是針對(duì)EGFR基因靶點(diǎn)的小分子抑制劑,多項(xiàng)臨床試驗(yàn)已證實(shí),EGFR基因突變的肺腺癌患者能從EGFR-TKIs治療中顯著獲益[7,8]。因此,對(duì)肺腺癌患者進(jìn)行EGFR基因突變狀態(tài)的檢測(cè)可預(yù)測(cè)其對(duì)EGFR-TKIs類藥物的療效。

目前,EGFR基因分型的檢測(cè)方法多種多樣,有熒光原位雜交法、高分辨率溶解曲線法[9]、羅氏Cobas系統(tǒng)實(shí)時(shí)PCR法[10]、微滴數(shù)字PCR法[11]、測(cè)序法[2]、ARMS法[2]等。各檢測(cè)方法的差異主要表現(xiàn)在所用樣本類型、腫瘤細(xì)胞含量、檢測(cè)方法靈敏度和特異性、報(bào)告時(shí)限等,而臨床上需要一種快速、靈敏、特異性高的檢測(cè)方法。本研究所用ARMS法是基于PCR平臺(tái)結(jié)合特異引物和雙環(huán)探針兩種技術(shù),以達(dá)到對(duì)EGFR基因突變類型的高檢測(cè)能力,檢測(cè)突變類型多達(dá)29種。針對(duì)EGFR基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異的突變檢測(cè)引物,保證了其高度的特異性。且ARMS法靈敏度高,對(duì)標(biāo)本腫瘤細(xì)胞DNA的含量及質(zhì)量要求較低,可檢測(cè)靈敏度低至1%的突變[12,13],因此,檢測(cè)穿刺、活檢小標(biāo)本和胸水細(xì)胞塊也得到理想的結(jié)果。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)易,結(jié)果直觀易判讀,儀器普及程度高,成本較低,目前已用于國(guó)內(nèi)臨床EGFR基因檢測(cè)。

本研究結(jié)果顯示,EGFR突變率為44.83%,在所有突變中,19Del和L858R突變率最高,占總突變率的95.19%;女性患者突變率(58.24%)明顯高于男性(36.17%);年齡>=60歲者突變率(44.06%)與<60歲者(46.07%)相近;這些與王芳等[14]報(bào)道一致。EGFR基因在不同標(biāo)本中的突變率,肺手術(shù)標(biāo)本為43.75%、肺活檢標(biāo)本為38.89%、轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本為47.27%及胸水細(xì)胞塊為62.86%均與Midha等[15]通過對(duì)全球文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)人肺腺癌EGFR突變率在27%-66%的結(jié)果基本相符。從突變情況來看35例胸水細(xì)胞塊EGFR的突變率高于肺手術(shù)標(biāo)本、肺活檢標(biāo)本及轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本,突變率雖與陳軒等[16]報(bào)道一致,但這需要更多的標(biāo)本例數(shù)去驗(yàn)證。Yatabe等[17]研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變的異質(zhì)性無(wú)論在原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶還是復(fù)發(fā)灶中都非常少見;也有研究表明腫瘤在分子水平上表現(xiàn)出異質(zhì)性,且在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中,EGFR基因狀態(tài)也極不穩(wěn)定,即轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的基因狀態(tài)常常不一致[18,19];因此轉(zhuǎn)移病灶與原發(fā)灶EGFR基因突變的一致性需要更多病例及相關(guān)研究來證實(shí)。

實(shí)驗(yàn)過程中還需注意：①甲醛對(duì)DNA有交聯(lián)作用，放置超過3個(gè)月的石蠟包埋樣本中DNA片段化和降解較為嚴(yán)重，雖紫外分光光度計(jì)測(cè)量的濃度較高，但實(shí)際加入有效DNA量并不足，需要相應(yīng)增加DNA用量。②雖然市售ARMS試劑盒可檢測(cè)EGFR基因突變多達(dá)29位點(diǎn)，但對(duì)某些稀有或未知突變可能造成漏檢，具有一定的局限性。③對(duì)于血性胸腔積液，制作細(xì)胞塊前去紅細(xì)胞處理和富集有核細(xì)胞層，可有效提高血性胸水細(xì)胞塊DNA濃度與質(zhì)量[20-22]。④對(duì)于失去手術(shù)機(jī)會(huì)的肺癌晚期患者，肺活檢標(biāo)本、轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本或胸水細(xì)胞塊標(biāo)本可替代手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)，豐富了患者基因檢測(cè)的取材途徑。

綜上所述,ARMS技術(shù)以簡(jiǎn)單、快速、靈敏度低至1%、特異性高、對(duì)樣品無(wú)污染、可用于不同標(biāo)本類型等優(yōu)點(diǎn),在評(píng)估肺腺癌EGFR突變類型方面具有較大的優(yōu)勢(shì),為臨床需要對(duì)EGFR-TKI藥物敏感性的肺腺癌患者提供可靠的檢測(cè)方法,是目前臨床較有應(yīng)用前景的檢測(cè)方法。