王 麗，何 林

(1.四川省南充市中心醫(yī)院藥學(xué)部，四川 南充 637000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，藥物臨床試驗中心，四川 成都 610072)

達(dá)卡巴嗪是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的一線化療藥物[1～3]，在臨床上廣泛用于惡性黑色素瘤的治療。達(dá)卡巴嗪臨床使用中也存在一些顯著缺陷，包括劑型單一，穩(wěn)定性差，患者順應(yīng)性低，不良反應(yīng)嚴(yán)重，對腦轉(zhuǎn)移無效等[4～7]。脂質(zhì)體(Liposome，LP)是由磷脂分散在水中經(jīng)自組裝形成的雙層或多層封閉囊泡。將脂質(zhì)體用作藥物載體在腫瘤診療方面受到廣泛關(guān)注，用脂質(zhì)體包封抗腫瘤藥物，與游離藥物相比，療效增強，毒副作用減弱[8～10]。因此，針對達(dá)卡巴嗪臨床使用中的問題，我們設(shè)想將達(dá)卡巴嗪用脂質(zhì)體進行包封，以期提高達(dá)卡巴嗪的療效，降低其不良反應(yīng)。本研究于2016年7月至2017年7月，以大豆卵磷脂和膽固醇作為原料，依據(jù)實驗室條件和預(yù)實驗結(jié)果，分別選擇了逆向蒸發(fā)法和硫酸銨梯度法制備達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體，以包封率為評價指標(biāo)進行了單因素實驗和正交實驗，以篩選達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的最佳制備處方和工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器N-1200 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)；SB-1200恒溫水浴鍋(東京理化器械株式會社)；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞破碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)；Universal 320R臺式離心機(德國Hettich科學(xué)儀器公司)；UV-1700紫外分光光度儀(日本島津制作所)；BP211D電子天平(德國賽多利斯公司)；動態(tài)光散射納米激光粒度儀(Malvern Zetasizer Nano ZS90)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.2 試藥及材料達(dá)卡巴嗪(批號：c02-20161209，蘇州立新制藥有限公司)；大豆卵磷脂(批號：2016012001，成都市科龍化工試劑廠)；膽固醇(批號：2014071401，成都市科龍化工試劑廠)；乙醚(分析純，批號：2016100901，成都市科龍化工試劑廠)；甲醇(色譜純，批號：R141293，規(guī)格：4L，成都市科龍化工試劑廠)；硫酸銨(批號：2017010101，成都市科龍化工試劑廠)；MW3500透析袋(中國Bioshap公司)；Amicon? Ultra-0.5 10K 超濾管(默克密理博公司)。

1.3 方法

1.3.1紫外分光光度法測定達(dá)卡巴嗪含量 紫外吸收波長的選擇：精密稱取達(dá)卡巴嗪2.5 mg，用甲醇于25 ml棕色容量瓶定容，得0.1 mg/ml的達(dá)卡巴嗪甲醇溶液，作為儲備液。定量吸取達(dá)卡巴嗪儲備液1.6 m于10 m棕色容量瓶，用甲醇定容，得16 μg/ml達(dá)卡巴嗪甲醇溶液，在紫外光區(qū)200～400 nm作全波長掃描，確定最大吸收波長為324 nm，作為測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別取相應(yīng)體積達(dá)卡巴嗪儲備液，于10 ml容量瓶用甲醇定容，配制成濃度為20、16、10、5、2.5、1.25 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以甲醇溶液為空白，在324 nm波長下測定各濃度的紫外吸收光度值。以達(dá)卡巴嗪濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)建立達(dá)卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸，回歸方程為y=0.0529x+0.0052，R2=0.9975。

1.3.2脂質(zhì)體包封率的測定 采用超濾離心法分離脂質(zhì)體混懸液中的脂質(zhì)體和游離藥物溶液。取400 μl脂質(zhì)體混懸液于超濾離心管(濾膜孔徑為10K)中，以6000 r/min離心10 min，外管中超濾液即為未被脂質(zhì)體包封的游離藥物溶液。取30 μl超濾液，用3 ml甲醇溶解稀釋，用紫外分光光度法測定其達(dá)卡巴嗪濃度，即為脂質(zhì)體混懸液中的游離藥物濃度；取等體積(30 μl)脂質(zhì)體溶液，3 ml甲醇溶解破乳，同法測定藥物濃度，即為脂質(zhì)體混懸液中的藥物總濃度。按公式1計算包封率，按公式2計算載藥量。

(公式1)

(公式2)

1.3.3逆向蒸發(fā)法制備工藝 精密稱取大豆卵磷脂和膽固醇于圓底燒瓶中，用乙醚溶解，加入達(dá)卡巴嗪水溶液，用細(xì)胞破碎儀超聲5 min使其乳化，然后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20 min除去乙醚，逐漸形成凝膠，加入適量磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，繼續(xù)旋蒸20 min，使器壁上的凝膠完全脫落，形成濃度適宜的脂質(zhì)體混懸液，再次用細(xì)胞破碎儀超聲，即制得得粒徑均勻的達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體混懸液。

1.3.4單因素實驗 以脂質(zhì)體包封率為指標(biāo)，用逆向蒸發(fā)法制備達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體，固定其他因素不變，分別考察藥物與磷脂質(zhì)量比、磷脂與膽固醇質(zhì)量比、內(nèi)水相體積、有機相內(nèi)水相體積比，以及磷脂濃度等處方因素比對包封率的影響，找出影響包封率的主要因素。

1.3.5正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計正交實驗。以包封率為指標(biāo)，對實驗結(jié)果進行極差分析，所得最佳因素水平組合，即為逆向蒸發(fā)法制備達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的最佳處方。

1.3.6硫酸銨梯度法制備工藝 精密稱取大豆卵磷脂30 mg，膽固醇5.1 mg，加入3 ml乙醚溶解，47 ℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)成膜后，加入4 ml 0.2 mol/L硫酸銨溶液，47 ℃旋蒸將脂質(zhì)膜水化成脂質(zhì)體混懸液，將混懸液用細(xì)胞破碎儀探頭超聲(2 s，2 s，5 %，5 min)，即得空白脂質(zhì)體。將空白脂質(zhì)體置于透析袋(MW3500)中于400 ml超純水中透析，形成硫酸按梯度。向空白脂質(zhì)體中加入處方量達(dá)卡巴嗪，47 ℃水浴條件下孵育20 min，即得達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體混懸液。

1.3.7實驗篩選處方工藝 本部分實驗每組實驗數(shù)據(jù)均是平行條件下同時制備3份樣品所測得的平均值。①磷脂膽固醇比的影響：固定其他因素不變，研究磷脂膽固醇摩爾比分別為1∶1，2：1，3∶1時脂質(zhì)體包封率的變化。②藥脂比及硫酸銨濃度的影響：固定其他因素不變，研究硫酸銨濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L和藥物磷脂質(zhì)量比分別為1∶30、1∶15、1∶10、1∶7.5時脂質(zhì)體包封率的變化。③透析液種類的影響：保持其他條件不變，分別研究以純化水，10%蔗糖溶液，磷酸鹽緩沖液(PBS7.4)，0.9% NaCl溶液，5%葡萄糖溶液作為透析液時脂質(zhì)體包封率的變化。④透析時間的影響：以5%葡萄糖溶液為透析液，固定其他條件不變，研究透析時間長短對脂質(zhì)體包封率的影響。⑤孵育溫度和時間的影響：保持其他實驗條件不變，在溫度分別為37 ℃、47 ℃、57 ℃水浴條件下孵育10、20、30、40 min進行載藥，測定包封率，確定最佳孵育溫度和時間。

1.3.8達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的性質(zhì)表征 采用負(fù)染法處理樣品，用透射電子顯微鏡觀察達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的微觀形態(tài)。應(yīng)用馬爾文動態(tài)光散射納米激光粒度儀測定卡巴嗪脂質(zhì)體的粒徑、分布及Zeta電位值。

2 結(jié)果

2.1 逆向蒸發(fā)法制備達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體

2.1.1單因素實驗 實驗結(jié)果顯示影響包封率的主要因素有藥物磷脂質(zhì)量比，藥物膽固醇比，有機相與內(nèi)水相比以及磷脂濃度等4個因素。

2.1.2正交實驗 4個因素分別設(shè)置三個水平，見表1。采用L9(34)正交表設(shè)計正交實驗，見表2，逆向蒸發(fā)法制備達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的最佳處方見表3。經(jīng)三次重復(fù)驗證實驗，測得該處方制得的脂質(zhì)體包封率為(28.02±3.11)%，載藥量為(2.71±0.32)%。

表1 正交設(shè)計的因素和水平表

表2 正交設(shè)計實驗結(jié)果

表3 逆向蒸發(fā)法最佳處方(n=3)

2.2 硫酸銨梯度法制備達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體

2.2.1磷脂膽固醇比的影響 磷脂膽固醇摩爾比由1∶1增大到3∶1，包封率由35.50%增加到42.90%。若繼續(xù)增大磷脂膽固醇摩爾比，考慮到膽固醇比例過低可能會影響脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，故確定硫酸銨梯度法制備脂質(zhì)體的最終磷脂膽固醇摩爾比為3：1。見圖1。

圖1 磷脂膽固醇摩爾比對包封率的影響

2.2.2藥脂比及硫酸銨濃度的影響 隨著硫酸銨濃度由0.1 mol/L逐漸增加到0.3 mol/L，脂質(zhì)體包封率呈增大趨勢，當(dāng)硫酸銨濃度增加為0.4 mol/L，包封率下降，因此確定0.3 mol/L作為硫酸銨梯度法的最佳硫酸銨濃度。在藥物磷脂比的各個水平，隨著藥脂比增大，包封率逐漸下降，在藥脂比為1：10時，包封率最低，藥脂比繼續(xù)增大為1：7.5時，包封率開始回升，但繼續(xù)增大藥脂比，包封率并未繼續(xù)增大。綜合考慮載藥量因素后，選擇藥脂比1∶7.5作為最終藥脂比。見圖2。

圖2 硫酸銨濃度及藥物磷脂質(zhì)量比對包封率的影響

2.2.3透析液種類的影響 10%蔗糖溶液與5%葡萄糖溶液作透析液的脂質(zhì)體包封率較高，兩者效果相當(dāng)?？紤]到配制的容易性，選擇了5%葡萄糖溶液作為透析溶液。見圖3。

2.2.4透析時間的影響 隨著透析時間延長，脂質(zhì)體包封率逐漸增大，透析時間為8小時時，包封率最高，當(dāng)透析時間增加為10小時，包封率反而降低。故確定透析時間為8 h。見圖4。

圖3 透析液種類對包封率的影響

圖4 透析時間對包封率的影響

2.2.5孵育溫度和時間的影響 在37、47或57 ℃水浴條件下孵育10、20、30或40 min，脂質(zhì)體包封率無明顯差異。綜合考慮到達(dá)卡巴嗪對熱的不穩(wěn)定性，最終選擇40 ℃作為孵育溫度，20 min作為孵育時間。見圖5。

圖5 孵育時間和溫度對包封率的影響

根據(jù)實驗結(jié)果確定硫酸銨梯度法制備達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的最終處方工藝見表4，經(jīng)三次重復(fù)驗證實驗，測得其包封率為(63.67±2.04)%，載藥量為(7.25±0.23)%。綜上，硫酸銨梯度法處方工藝制備的達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體包封率和載藥量均顯著優(yōu)于逆向蒸發(fā)法的最佳處方，故將其作為達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的最終處方工藝。

2.3 達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的性質(zhì)表征外觀及形態(tài)：制得的達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體混懸液質(zhì)地均勻，呈半透明乳白色混懸液，有藍(lán)色乳光，無分層，無沉淀。透射電子顯微鏡下脂質(zhì)體形態(tài)如圖6，單個達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體呈規(guī)則的球形，外觀圓整，大小均勻。粒徑分布及Zeta電位：脂質(zhì)體粒徑呈近似正態(tài)分布，平均粒徑142.2 nm，多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)為0.214，測得其Zeta電位值為-50.4 mV。見圖7。

表4 硫酸銨梯度法的最終處方工藝(n=3)

圖6 透射電鏡下脂質(zhì)體形態(tài)

圖7 達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體粒徑分布

3 討論

有文獻報道達(dá)卡巴嗪是脂溶性化合物[11，12]，但實驗顯示其不溶于氯仿、二氯甲烷，乙醚等有機溶劑，達(dá)卡巴嗪為親水性化合物。親水性化合物不易被脂質(zhì)體包封，制得的脂質(zhì)體包封率普遍偏低，包封率是其處方工藝難點，因此本實驗選取包封率為考察指標(biāo)。

達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體制備預(yù)實驗中，首先嘗試使用薄膜分散法，其包封率始終在10%左右。有文獻報道，逆向蒸發(fā)法適用于包裹水溶性藥物和大分子生物活性物質(zhì)如各種抗生素、胰島素、免疫球蛋白、核酸等[13]，因此嘗試了逆相蒸發(fā)法制備達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體，逆向蒸發(fā)法是將含藥水溶液(水相)加入到溶有脂材的有機相中進行混合、超聲，形成穩(wěn)定的 W/O 型乳劑，然后減壓旋蒸除去有機相，形成脂質(zhì)體混懸液。對逆向蒸發(fā)法進行單因素考察，設(shè)計正交實驗，獲得最高包封率為(28.02±3.11)%，包封率依然偏低。分析原因可能是在進行減壓旋蒸發(fā)形成脂質(zhì)體混懸液的過程中，含藥水相部分分成了脂質(zhì)體外水相和內(nèi)水相兩部分，外水相中的藥物占絕大部分，被脂質(zhì)體包封于內(nèi)水相中的藥物只占小部分，所以包封率低。

達(dá)卡巴嗪難溶于純水，易溶于酸性水溶液，為弱堿性化合物。將制備方法更換為pH梯度法，結(jié)果顯示pH梯度法各處方工藝下制備的脂質(zhì)體包封率均在10%～30%。硫酸銨梯度法是pH梯度法的衍生方法，適用于弱堿性藥物[14～16]，它是利用硫酸銨水溶液作為水相，然后通過透析使脂質(zhì)體內(nèi)水相中的硫酸銨濃度遠(yuǎn)大于外水相中硫酸銨濃度。由于 NH4 +解離成 H+和 NH3，NH3跨膜外溢速度遠(yuǎn)大于 H+，造成內(nèi)水相 H+濃度增加，pH 值下降，形成 pH 梯度，產(chǎn)生藥物主動裝載驅(qū)動力，使弱堿性藥物主動進入脂質(zhì)體內(nèi)水相中，使脂質(zhì)體包封率較高。將pH梯度法更換為硫酸銨梯度法，包封率有顯著增加，達(dá)到了(63.67±2.04)%。

制備高包封率的達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體是課題后續(xù)實驗的前提和基礎(chǔ)，找到硫酸銨梯度法后，通過逐步單因素優(yōu)化使包封率明顯提高，鑒于時間關(guān)系，為了不影響后續(xù)實驗部分的開展而沒有對硫酸銨梯度法進行正交實驗，這是本實驗的一個缺失和遺憾，正交實驗的開展可能使達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體包封率進一步提高。

對達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的穩(wěn)定性也進行了簡單考察，在 4 ℃冰箱冷藏條件下脂質(zhì)體放置一周后，混懸液外觀無明顯改變，包封率由63.67%下降為52.14%，放置兩周后混懸液的光澤度和通透性下降，包封率進一步下降為46.95%。

綜上，本文以包封率為指標(biāo)，對比研究逆向蒸發(fā)法和硫酸銨梯度法兩種方法制備達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體，最終確定硫酸銨梯度法為達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體的制備方法，篩選出最佳制備工藝，制得的達(dá)卡巴嗪脂質(zhì)體包封率為(63.67±2.04)%，載藥量為(7.25±0.23)%，為后續(xù)制備達(dá)卡巴嗪長循環(huán)脂質(zhì)體及進一步的藥動學(xué)和藥效學(xué)研究創(chuàng)造了前提。