徐 冰 張玉修 曹勝男 孫建楠△

(1濟寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，濟寧 272013；2濟寧市中醫(yī)院，濟寧 272027)

烏頭堿，新烏頭堿等二萜類生物堿是烏頭類藥材的主要的藥效成分，具有鎮(zhèn)痛消炎的良好功效[1-4]，但毒性很強，用藥不當易造成中毒[5]。經(jīng)炮制后，其中的烏頭堿類化合物可轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿，單酯型生物堿具有良好的藥理活性，且毒性遠遠低于雙酯型生物堿[6]，所以烏頭類藥材常不直接藥用，而是將其炮制之后降低毒性。

目前，中成藥烏頭堿類成分的檢測主要使用高效液相色譜法[7-10]。該方法檢測靈敏度高，對于微量檢測有著重要作用；重復(fù)性好，應(yīng)用廣泛，常用于大批量檢測。本實驗采用超聲提取結(jié)合高效液相色譜法方法，對市售烏頭類中藥和中成藥中的烏頭堿類物質(zhì)進行測定，為安全用藥提供依據(jù)和參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SHIMADZU LC-2OAT雙泵高效治相色譜儀(日本鳥津公司)；GZY-P20-B超純水儀(湖南科爾頓水務(wù)有限公司)；FA2104N電子天平(上海菁海儀器有限公司)；FW-100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；SB25-12DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試劑及樣品

烏頭堿對照品(批號140303，北京恒元天啟標準品有限公司)；新烏頭堿對照品(批號AB664W，天津一方科技有限公司)；川烏，附子(濟寧廣聯(lián)醫(yī)藥公司)，附子理中丸(批號19013455、18011765，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)，桂附地黃丸(批號190313、181201，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)，傷濕止痛膏(批號191209、181101，湖南杏林春藥業(yè)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 烏頭堿、新烏頭堿的提取

2.1.1標準品儲備液制備 準確稱取烏頭堿和新烏頭堿固體標準品，以甲醇作為溶劑，溶解、定容至10ml，制得濃度分別為3.8μg/ml和5.6μg/ml的烏頭堿和新烏頭堿標準儲備液。

2.1.2樣品處理 根據(jù)藥材和中成藥不同的形態(tài)分別處理。附子和川烏為塊狀干藥材，直接用粉碎機粉碎，全部過60目篩備用；附子理中丸為大蜜丸，將其剪碎，研缽研細備用；桂附地黃丸為黑棕色濃縮丸，研缽研細備用；傷濕止痛膏為片狀橡膠膏，除去蓋襯，剪成小塊備用。

2.1.3供試液的制備 取按照2.1.2項處理的樣品2g左右，精密稱定，置錐形瓶中，加入25ml pH=2的鹽酸水溶液，確保沒過樣品上端，用保鮮膜封住錐形瓶口防止溶劑在超聲過程中揮發(fā)，于25 ℃下超聲60min，對提取液進行過濾，過濾后棄去固體，濾液室溫(30 ℃)下過夜揮至近干，殘渣以流動相比例混合溶液復(fù)溶至2ml，用于隨后的HPLC分析。

2.1.4影響萃取效率的單因素實驗 為了獲得最佳萃取效率，本實驗以附子樣品為基質(zhì)，對可能影響萃取效率的多個因素，包括提取溶劑的種類、超聲時間和超聲溫度等進行了優(yōu)化，確定了最佳的提取條件。

1)提取溶液。本研究分別用甲醇、乙腈、pH=2的鹽酸水溶液、pH=10的三乙胺水溶液進行超聲提取，控制超聲時間為45min，超聲溫度為25℃，酸性條件下提取效果最優(yōu)。見圖1。

圖1 提取溶劑的優(yōu)化

2)超聲時間。超聲時間會影響萃取效率，本實驗分別考察了超聲15min、30min、45min、60min時的萃取效率，提取效果隨著超聲時間的延長而增加[11]，結(jié)果顯示為60min為最優(yōu)超聲時間。見圖2。

圖2 超聲時間的優(yōu)化

3)提取溫度。本實驗探究了提取溫度對萃取效率的影響。結(jié)果表明，25℃為最佳提取溫度(見圖3)。這可歸因于待測物質(zhì)對熱不穩(wěn)定，超聲溫度過高易導(dǎo)致分解[12]。

圖3 提取溫度的優(yōu)化

2.2 烏頭堿、新烏頭堿含量的測定

2.2.1測定波長的選擇 以標準溶液進液相分析，以SPD-M20A檢測器對烏頭堿和新烏頭堿在200～700 nm范圍內(nèi)進行全波段掃描，發(fā)現(xiàn)烏頭堿(圖4a)和新烏頭堿(圖4b)均在196nm、230nm處出現(xiàn)兩個較大吸收峰，考慮到196nm處產(chǎn)生紫外吸收的物質(zhì)較多，易對樣品測定產(chǎn)生較大基質(zhì)干擾，最終選擇230nm為烏頭堿和新烏頭堿的檢測波長。

圖4 烏頭堿和新烏頭堿標準溶液紫外-可見光譜掃描圖

2.2.2色譜條件的優(yōu)化 僅以標準溶液進樣時，乙腈和0.03%三乙胺水溶液(pH=8)以體積比85∶15(v/v)的混合溶液能將新烏頭堿與烏頭堿二者較好地分離。但應(yīng)用于實際樣品時，因中藥材成分復(fù)雜，分離效果不理想。因此更換流動相比例，選擇乙腈和0.03%三乙胺水溶液(pH=8)以體積比60∶40(v/v)的混合溶液為流動相時，樣品能實現(xiàn)較好的分離。見圖5、6。

注：1為新烏頭堿，2為烏頭堿

注：1為新烏頭堿，2為烏頭堿

2.2.3檢出限和線性關(guān)系考察 吸取烏頭堿、新烏頭堿濃度分別為3.8μg/ml、5.6μg/ml的混合標準溶液，稀釋至合適濃度，按照1.1色譜條件上機測定，以三倍信噪比所對應(yīng)的濃度為檢出限。見表1。

以甲醇為溶劑，分別配制烏頭堿濃度為3.8μg/ml,7.6μg/ml,15.2μg/ml,30.4μg/ml,60.8μg/ml，新烏頭堿濃度為5.6μg/ml,11.2μg/ml,22.4μg/ml,44.8μg/ml,89.6μg/ml的混合標準溶液。以1.1描述的儀器條件進HPLC檢測，記錄峰面積。以標準品的濃度為橫坐標(μg/ml)，以峰面積為縱坐標，得到線性方程(表1)。

表1 檢出限及線性關(guān)系

2.2.4日內(nèi)精密度 吸取烏頭堿濃度為15.2μg/ml，新烏頭堿濃度為22.4μg/ml的混合標準溶液10μl，在24h內(nèi)，每隔1h進樣1次，連續(xù)進樣6次，計算6次峰面積的平均值及RSD值。見表2。

2.2.5日間精密度 選取配制好的烏頭堿濃度為3.8μg/ml，新烏頭堿濃度為5.6μg/ml的混合標準溶液，兩星期內(nèi)選取3d，每天平行測定3次，計算三日峰面積的平均值及RSD值，見表2。

表2 精密度

2.2.6穩(wěn)定性 取按照2.1.3制備的桂附地黃丸樣品供試液，按照確定的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h測定各成分的峰面積，記錄各化合物的峰面積并計算相對標準偏差。烏頭堿和新烏頭堿峰面積的RSD值為4.8%和4.5%。供試液可在1d內(nèi)保持基本穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性 取5份同一批次桂附地黃丸樣品，按照2.1.3方法制備供試液，將供試液進HPLC分析，記錄峰面積并計算RSD值。烏頭堿和新烏頭堿峰面積的RSD值分別為4.6%和4.2%。

2.2.8加標回收率 依據(jù)桂附地黃丸(批號181201)中烏頭堿和新烏頭堿含量的80%，100%，120%，加適量對照品到桂附地黃丸樣品中，按照2.1.2和2.1.3的步驟進行提取，每個樣品平行進樣3次，計算加標回收率。烏頭堿和新烏頭堿在低、中、高3個濃度范圍內(nèi)，加標回收率均控制在99.84%～103.28%，該方法準確可靠。見表3。

表3 加標回收率

2.2.9實際樣品分析 將購買的川烏和附子兩種中藥，兩個批次的3種常見含附子類藥材的中成藥，按照樣品處理步驟處理后，進HPLC分析，每個樣品測定3次，利用3次峰面積平均值計算每種藥物中烏頭堿和新烏頭堿的含量，檢測結(jié)果如表4、5所示。

表4 中藥材中烏頭堿及新烏頭堿測定結(jié)果(μg/g)

表5 中成藥中烏頭堿及新烏頭堿測定結(jié)果(μg/g)

2.3 用藥安全分析

查閱《中華人民共和國藥典》(2015版)可知，制川烏中所允許存在的雙酯型生物堿最大濃度為0.40mg/g，根據(jù)小鼠灌胃的LD50推算，雙酯型生物堿LD50為1.01mg/kg，若以一個60kg體重的成年人的服用劑量計算，結(jié)果顯示附子理中丸、桂附地黃丸未超過服用計量；通過傷濕止痛膏攝入的烏頭堿含量也低于LD50的劑量，但是沒有經(jīng)過炮制的川烏、附子含量較高，不宜直接服用。

3 結(jié)論

本實驗建立的超聲提取結(jié)合高效液相色譜法，能準確測定原藥材和相關(guān)中成藥中烏頭堿與新烏含量。所建立的方法準確、高效、可靠，可為中成藥類的用藥安全和質(zhì)量評估提供依據(jù)和參考。