王智宇，劉東，劉俠，楊衛(wèi)麗

海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199

紫毛野牡丹(Melastoma genicillatumNaud.)歸屬于野牡丹科(Melastomaceae)野牡丹屬(Melastoma)，《中國(guó)植物志》記載其國(guó)內(nèi)僅分布于海南省，國(guó)外菲律賓亦有分布[1]。現(xiàn)有研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其同科屬的植物具有一定的藥用開發(fā)價(jià)值[2-7]，例如野牡丹屬中的野牡丹等植物具有治療霍亂、腹瀉、持續(xù)性發(fā)熱、痢疾、白帶、創(chuàng)傷、皮膚病等作用；在金色葡萄球菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌及溶血性鏈球菌等微生物的藥敏試驗(yàn)中，顯示出顯著地抑制作用。紫毛野牡丹作為野牡丹屬植物之一，其藥理作用未見報(bào)道，故本文對(duì)其提取物抑菌作用進(jìn)行初步的研究，為紫毛野牡丹及其同屬植物的研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 植株于2017 年5 月采自海南省屯昌縣，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確為野牡丹屬植物紫毛野牡丹。晾干，40℃鼓風(fēng)干燥，粉碎，過60 目篩，用密封袋包裝扎緊，干燥器貯藏，備用。白假絲酵母菌(Candida albicans，Ca)、熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis，Ct)、光滑假絲酵母菌(Candida glabrata，Cg)、克柔假絲酵母菌(Candida kruseis，Ck)、近平滑假絲酵母菌(Candida parapsilosis，Cp)，由海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 儀器 YJ-VS 型超凈工作臺(tái)，CASCADA LS MK2 型超純水系統(tǒng)，SPR2NG-R30 型臺(tái)式可掛壁純水器，HH·CP-01型二氧化碳培養(yǎng)箱，GR60DR型全自動(dòng)立式高壓滅菌器，Tanon-4100型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，SynergyHTX 型多功能酶標(biāo)儀，DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，賽多利斯BS210S型電子天平，HYQ-2121型渦旋混勻器。

1.3 提取方法 稱取藥材粉末100 g，超純水1 000 mL浸泡2 h，加沸石數(shù)粒，煮沸2 h，過濾，濾渣加500 mL超純水，煮沸2 h，過濾，合并濾液，蒸干，得干膏，計(jì)算得率，干膏置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫涣碓俜Q取藥材粉末100 g，70%乙醇1 000 mL浸泡2 h，加沸石回流2 h，過濾，濾渣再次加入500 mL 70%乙醇，回流2 h，過濾，合并濾液，回收至干膏，干膏置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MH 瓊脂培養(yǎng)基的制備 稱取MH 瓊脂36.0 g，溶解于1 000 mL 超純水中，121℃高壓滅菌15 min，冷至50℃～60℃，傾入無菌培養(yǎng)皿，放冷置4℃冰箱保存?zhèn)溆?；另?0.0 g 葡萄糖與MH 瓊脂一同溶解于1 000 mL超純水中，121℃高壓滅菌15 min，冷至50℃～60℃，傾入無菌培養(yǎng)皿，制成含2%葡萄糖的MH瓊脂培養(yǎng)基，放冷置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 工作用菌的準(zhǔn)備 取各供試菌菌種，劃線于2%葡萄糖的MH瓊脂培養(yǎng)基平面第一次活化，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后刮取單菌落劃菌于2%葡萄糖的MH 瓊脂培養(yǎng)基平面進(jìn)行二次活化，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)48 h后作為工作用菌，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 菌懸液的配制 采用麥?zhǔn)媳葷岱ǎ咳?%硫酸溶液4.9 mL和0.5%氯化鋇溶液0.1 mL，分別加入試管充分混勻，制成0.5#麥?zhǔn)媳葷峁?，用時(shí)新制；刮取工作用菌落，加無菌生理鹽水配制成與0.5#麥?zhǔn)媳葷峁軡岫认嘟娜芤?，即得近似濃度?.5×108CFU/mL的菌懸液，用時(shí)新制。配制均在無菌條件下進(jìn)行。

1.7 紙片擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)

1.7.1 試液的準(zhǔn)備 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，稱取水提干膏和70%乙醇提干膏，分別溶解于40.0 mL 超純水中搖勻，配制成按原藥量計(jì)算濃度為0.25 mg/mL的藥液，作為各提取的抑菌溶液，置于4℃冰箱中貯存，備用。再精密稱取氟康唑0.025 0 g 置10 mL 容量瓶中，超純水溶解并定容，得2.5 mg/mL 的氟康唑?qū)φ掌匪幰海?℃冰箱貯存，備用。

1.7.2 紙片的制備 將粗濾紙制成直徑6 mm 的圓型紙片，置西林瓶中，封口121℃高壓滅菌20 min，干燥，密封保存。

1.7.3 試驗(yàn)內(nèi)容 試驗(yàn)分為四組，分別為氟康唑溶液陽(yáng)性對(duì)照組、超純水空白組、紫毛野牡丹水提取物組、紫毛野牡丹70%乙醇提取物組。無菌條件下，取MH瓊脂培養(yǎng)基加菌懸液300μL，涂布均勻，吸出多余菌液，放置片刻，夾取圓形紙片，展平，置于培養(yǎng)皿中央，輕輕按壓，吸取藥液10μL 滴加于紙片中央，蓋上培養(yǎng)皿，做好標(biāo)記，37℃培養(yǎng)，48 h 后觀察并記錄抑菌圈直徑，每組三個(gè)平行樣。

1.8 微量稀釋法抑菌試驗(yàn)

1.8.1 RPMI-1640 培養(yǎng)基的制備 分別稱取10.4 g RPMI-1640，34.5 g MOPS，2.0 g NaHCO3，置1 000 mL 容量瓶中，加超純水適量使溶解，以1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 至7.0±0.1，超純水定容至刻度。無菌條件下，以0.22μm 微孔濾膜濾過，置4℃冰箱中保存，備用。

1.8.2 試液的準(zhǔn)備 用時(shí)新制，分別精密稱取紫毛野牡丹水提物干膏及70%乙醇提取物干膏，按生藥量計(jì)算，分別以超純水配制成4 096μg/mL的藥液，高壓滅菌后分別用RPMI-1640 液體培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)倍稀釋配制，得濃度分別為2 048 μg/mL、1 024 μg/mL、512 μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL 的藥液；再精密稱取氟康唑?qū)φ掌芬猿兯渲瞥蓾舛葹? 024μg/mL的藥液，高壓滅菌后用RPMI-1640 液體培養(yǎng)基對(duì)倍稀釋得濃度分別為512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL的氟康唑藥液，放入離心管架中，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8.3 試驗(yàn)內(nèi)容 菌懸液分兩步稀釋1 000 倍作為試驗(yàn)用菌液，試驗(yàn)設(shè)置分為氟康唑陽(yáng)性對(duì)照組、水提物組、70%乙醇提取物組、空白組及陰性對(duì)照組，無菌條件下，取96 孔板按組別分別加入相應(yīng)溶液，其中氟康唑組、水提物組及乙醇提取物組分別加入先前配制好的相應(yīng)藥液100μL及100μL試驗(yàn)用菌液，空白組加入200μL RPMI-1640液體培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組加入100μL RPMI-1640液體培養(yǎng)基及100μL試驗(yàn)用菌液，加好藥液和菌液后，適度振搖均勻，多功能酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm 測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)為空白吸光度，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后再進(jìn)行測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)為培養(yǎng)48 h后吸光度，計(jì)算MIC值。

1.8.4 最低抑菌濃度(MIC)以培養(yǎng)48 h 后各孔吸光度減去對(duì)應(yīng)空白板各孔吸光度得差值，將陰性對(duì)照組的平均差值計(jì)為100%的生長(zhǎng)率，其值的1/2 計(jì)為50%的抑制率，實(shí)驗(yàn)組中平均差值最接近50%抑制率的對(duì)應(yīng)濃度計(jì)為該藥液的MIC值。

2 結(jié)果

2.1 紙片法抑菌試驗(yàn)結(jié)果 紙片法考察紫毛野牡丹水提取物及70%乙醇提取物的對(duì)各供試菌的抑制作用，所得結(jié)果見表1。紙片法試驗(yàn)結(jié)果表明，紫毛野牡丹水提取物及70%乙醇提取物對(duì)五種假絲酵母菌均具有敏感性，對(duì)Ck表現(xiàn)出中度敏感性，對(duì)其他四種酵母菌(Ca、Ct、Cg、Cp)表現(xiàn)為低敏感性；而其70%乙醇提取物對(duì)Cg及Cp表現(xiàn)出了高度敏感性，對(duì)另外三種酵母菌(Ca、Ct、Ck)表現(xiàn)為中度敏感性。

2.2 微量稀釋法試驗(yàn)結(jié)果 微量稀釋法考察紫毛野牡丹水提取物及70%乙醇提取物的對(duì)各供試菌的MIC值，所得結(jié)果見表2。微量稀釋法試驗(yàn)結(jié)果表明，紫毛野牡丹水提物對(duì)五種假絲酵母菌均具有抑制作用，其中對(duì)Ca及Cg的MIC值為32 μg/mL，對(duì)Ct及Cp的MIC值為128μg/mL，而對(duì)Ck的MIC 值為256μg/mL；而其70%乙醇提取物對(duì)五種假絲酵母菌亦具有抑制作用，其中對(duì)Ca及Cg的MIC 值為32 μg/mL，對(duì)Ct的MIC 值為64μg/mL，而對(duì)Ck及Cp的MIC值為128μg/mL。

表1 紙片法抑菌試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑：mm)

表2 紫毛野牡丹水提物的MIC值(g/mL)

3 討論

目前念珠菌屬作為常見的真菌感染類型，臨床治療主要使用化學(xué)藥品進(jìn)行治療，但這往往會(huì)產(chǎn)生耐藥性、不良反應(yīng)多等問題，使真菌感染的治療變得越來越困難[6-9]。

從藥用植物中尋找抗菌藥物已有多年的歷史[10-12]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)紫毛野牡丹采用水和70%乙醇兩種溶劑進(jìn)行提取，分別對(duì)提取物進(jìn)行了體外抗念珠菌屬實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了本次實(shí)驗(yàn)需要的藥液濃度。在抑菌活性分析時(shí)采用紙片法，參照《微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)》判定結(jié)果，抑菌圈直徑小于10 mm 為鈍敏，10～15 mm 為低度敏感，15～20 mm 為中度敏感，20 mm 以上為高度敏感。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)紫毛野牡丹水提取物及70%乙醇提取物對(duì)五種假絲酵母菌均具有敏感性，水提取物對(duì)Ck表現(xiàn)出中度敏感性，對(duì)其他四種酵母菌(Ca、Ct、Cg、Cp)表現(xiàn)為低敏感性；70%乙醇提取物對(duì)Cg及Cp表現(xiàn)出了高度敏感性，對(duì)另外三種酵母菌(Ca、Ct、Ck)表現(xiàn)為中度敏感性。從微量稀釋法結(jié)果可知，紫毛野牡丹水提物和70%乙醇對(duì)Ca及Cg的菌株具有劑量依賴性敏感；與已有的研究成果對(duì)比，紫毛野牡丹提取物對(duì)念珠菌屬真菌的抑制效果顯著[13-16]。野牡丹屬植物有關(guān)研究中顯示，其屬主要含有的黃酮類和鞣酸類成分為其屬植物的特征性成分及活性成分[17]，而紫毛野牡丹化學(xué)成分研究未見報(bào)道，故在未來的研究中會(huì)對(duì)其主要抑菌活性成分及抑菌機(jī)制進(jìn)一步研究，從而闡明其抑制真菌機(jī)制及活性成分，為該植物的研究開發(fā)奠定一定基礎(chǔ)。