李俊平，張愛武，張芳

內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，呼和浩特 010059

氟尿嘧啶(5-FU)作為臨床常用抗癌藥，對胃癌、結直腸癌、乳腺癌等有很好的療效。但5-FU會引起較強的不良反應，其中免疫損傷以及骨髓造血功能抑制最為常見，主要表現(xiàn)為免疫功能降低、外周血細胞數(shù)量減少。因此，盡可能減少5-FU帶來的不良反應已成為當前研究的熱點[1]。蛹蟲草又名北冬蟲夏草，屬蟲草菌屬，與名貴藥材冬蟲夏草是同屬異種。蛹蟲草含有多種生物活性成分，包括蟲草多糖、多肽、蟲草酸、蟲草素等，其藥用和保健價值廣泛，可發(fā)揮降糖、調脂、保肝、護腎、抗腫瘤等功效[2～4]。蟲草多糖作為蛹蟲草的活性成分之一，具有免疫調節(jié)和抗腫瘤活性的作用[5]。然而蛹蟲草多糖對5-FU引起的骨髓損傷的影響還不明確。因此，本研究使用5-FU處理大鼠，使用蛹蟲草多糖對其進行保護性干預，評估該藥對5-FU處理大鼠骨髓功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 蛹蟲草菌種由內蒙古醫(yī)科大學藥學院制藥工程實驗室提供。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切成1 cm3小塊，加水沸煮30 min，8層紗布過濾，加入20 g葡萄糖，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。Wistar大鼠40只，雄性，體質量(210±10)g，購自內蒙古醫(yī)科大學動物實驗中心。5-FU注射液(規(guī)格：0.25 g×10 mL)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；人IFN-γ ELISA試劑盒、人IL-4 ELISA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。CFX96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad；Multiskan FC酶標儀購自美國Thermo；7020全自動生化分析儀購自日本HITACHI。

1.2 蛹蟲草多糖的制備

1.2.1 菌種培養(yǎng) 采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法。取蛹蟲草斜面1支，將菌絲體刮入50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d得到種子培養(yǎng)液，以10%的接種量接種至500 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d得到發(fā)酵液，鏡檢觀察菌體。

1.2.2 蛹蟲草多糖的提取 發(fā)酵液過濾得到菌絲體，凍干機凍干，微粉粉碎機粉碎破壁。蛹蟲草多糖的提取采用水溶醇沉法。取蛹蟲草細粉100 g，加入1 L純水混勻，40 kHz超聲提取30 min。80 ℃加熱回流1 h，趁熱過濾，濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至200 mL。攪拌下加入2 L乙醇沉淀多糖，靜置30 min，過濾，乙醇洗滌沉淀。加適量水全溶沉淀，加4倍量乙醇再沉淀，過濾，乙醇洗滌沉淀。60 ℃烘干，得到蛹蟲草多糖粗品5.62 g，得率為5.62%。

1.2.3 蛹蟲草多糖的精制 ①蛋白質的去除。使用Sevag法去除蛋白質。氯仿和正丁醇按5∶1的比例混勻配制Sevag液，粗多糖濃縮液與Sevag液按4∶1的體積混合，劇烈震蕩30 s后離心，取上清液，反復用Sevag液處理5次，收集上清液。②DEAE-52分離。使用DEAE-52裝柱，多糖上樣，依次用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的NaCl溶液洗脫，各洗脫150 mL，流速0.5 mL/min。收集洗脫液，每管5 mL，苯酚—硫酸法490 nm下檢測洗脫液OD值。只有水洗脫出峰，其余NaCl溶液均未洗脫出峰。水洗脫得到一個主峰，合并主峰洗脫液，旋蒸濃縮。另有少量雜峰，由于含量較低，不做收集。③Sephadex G-100分離。使用Sephadex G-100裝柱，將DEAE-52分離出的多糖上樣，水洗脫，流速0.5 mL/min，收集洗脫液，每管5 mL，苯酚—硫酸法檢測洗脫液OD值，得到一個主峰，合并主峰洗脫液，旋蒸濃縮，得到多糖純品，其余雜峰不做處理。④HPLC法檢測。使用HPLC法檢測Sephadex G-100分離得到的多糖純品。流動相為5%的甲醇水溶液，流速1 mL/min，示差折光檢測器檢測，得到一個對稱單一峰，保留時間10.03 min。

1.3 動物分組與給藥 將40只雄性Wistar大鼠隨機分為4組，分別為對照組、模型組、蛹蟲草多糖低劑量組、蛹蟲草多糖高劑量組，每組10只。除對照組外，其余各組腹腔注射15 mg/(kg·d)的5-FU溶液，對照組給予同等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥6 d。造模結束后，蛹蟲草多糖低、高劑量組分別給予20、60 mg/kg的蛹蟲草多糖粗品灌胃，3次/d，連續(xù)給藥3周，其余組給予同等體積的生理鹽水。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠一般情況觀察 在給藥的第0、3、6、9、12、15、18、21天測定并觀察大鼠體質量、毛發(fā)、腹瀉的發(fā)生等情況。

1.4.2 外周血細胞數(shù)量檢測 給藥完成后，取血，處死大鼠。將大鼠血液保存于含有抗凝劑的采血管內，采用全自動血細胞分析儀檢測外周血紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(Hb)。

1.4.3 外周血IFN-γ、IL-4水平測定 取大鼠全血，10 000 r/min離心20 min，取上層血清，ELISA法測定血清IFN-γ和IL-4。以IFN-γ/IL-4代表Th1/Th2。

1.4.4 骨髓DNA含量測定 取大鼠股骨，用0.005 mol/L CaCl2沖洗骨髓至離心管中，4 ℃放置30 min，1 000 r/min離心15 min，棄上清。用0.2 mol/L HClO4懸浮沉淀，震蕩混勻，90 ℃水浴15 min，冷卻。2 000 r/min離心10 min，保留上清，以0.2 mol/L HClO4為空白。酶標儀于268 nm波長處測定OD值，DNA含量=OD值×稀釋倍數(shù)。

2 結果

2.1 各組一般情況觀察結果 與對照組相比，模型組大鼠毛發(fā)有脫落現(xiàn)象，出現(xiàn)集體腹瀉，且體質量下降。與模型組相比，蛹蟲草多糖低劑量組和高劑量組大鼠體質量有所改善，但由于大鼠間個體差異較大，組間比較并未表現(xiàn)出差異，毛發(fā)脫落現(xiàn)象也無明顯改善。各組體質量比較見表1。

表1 各組體質量比較

2.2 各組外周血細胞含量比較 結果見表2。

2.3 各組血清IFN-γ、IL-4水平比較 結果見表3。

表2 各組外周血細胞含量比較

表3 各組血清IFN-γ、IL-4水平比較

2.4 各組骨髓DNA含量比較 對照組、模型組、蛹蟲草多糖低劑量組、蛹蟲草多糖高劑量組骨髓DNA含量分別為7.08±0.86、2.58±0.47、4.65±0.97、5.84±0.73，模型組較對照組低(P<0.01)，蛹蟲草多糖低劑量組、蛹蟲草多糖高劑量組較模型組高(P<0.05或<0.01)。

3 討論

由放化療所導致的免疫抑制以及骨髓損傷是腫瘤治療過程中難以避免的嚴重副作用。骨髓是人體重要的免疫和造血器官，由骨髓產(chǎn)生的造血干細胞可分化成紅細胞、白細胞、血小板、淋巴細胞等發(fā)揮生物學功能，使用化療藥物后，骨髓受損，造成血細胞數(shù)量和免疫功能的降低。Th1/Th2是反映機體免疫功能的重要指標。Th1和Th2細胞由輔助T細胞產(chǎn)生，正常情況下Th1和Th2細胞處于動態(tài)平衡中，且兩種細胞相互抑制。當機體免疫功能受到抑制時，Th2占據(jù)優(yōu)勢，Th1/Th2比值降低，相反，其比值越高，免疫應答水平越顯著[6,7]。Th1表達IFN-γ，IFN-γ能刺激B細胞，介導體液免疫，產(chǎn)生抗體；Th2表達IL-4，IL-4屬于抑炎因子，能夠抑制炎癥的發(fā)生。Th1/Th2的平衡是機體免疫平衡的重要標志[8,9]。骨髓DNA含量是造血干細胞數(shù)量的體現(xiàn)。DNA是遺傳信息的載體，細胞中的DNA會在損傷因素的作用下斷裂，斷裂的DNA則會進一步降解，細胞中DNA含量的減少會導致細胞增殖減緩[10]。因此，骨髓DNA含量的降低會造成骨髓造血干細胞數(shù)量的減少。本研究檢測大鼠外周血細胞含量、Th1/Th2、骨髓DNA含量，觀察了蛹蟲草多糖灌胃對5-FU處理大鼠骨髓功能的影響。

基于中醫(yī)的辨證施治理論，對于免疫損傷的治療采取補氣、補血、健脾、補腎類藥物[11～14]。蟲草屬包括冬蟲夏草、蛹蟲草、秦山蛹蟲草、香棒蟲草、蒙山蟲草等在內的多種真菌，具有相似的化學成分[15,16]。其中以傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草研究最多，大量的研究表明，冬蟲夏草的多糖組分具有調節(jié)機體免疫功能、抗腫瘤、抗氧化等功效，然而價格昂貴，限制其廣泛應用[17,18]。蛹蟲草價格低廉、易培養(yǎng)，已被認為是冬蟲夏草的替代品[4]。研究表明，蛹蟲草多糖可提高小鼠的免疫力和抗氧化能力[19]，并能增強巨噬細胞RAW246.7的吞噬功能[20,21]。本研究前期通過水溶醇沉法獲得蛹蟲草多糖粗品，得率為5.62%，使用DEAE-52和Sephadex G-100進一步對粗品進行提純，獲得蛹蟲草多糖純品用于后續(xù)實驗。本研究大鼠腹腔注射5-FU建立模型，給予蛹蟲草多糖灌胃干預，結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠外周血RBC、WBC、PLT、Hb減少，骨髓DNA含量減少，Th1/Th2明顯降低；與模型組相比，蛹蟲草多糖高劑量組大鼠外周血RBC、WBC、PLT、Hb增加，骨髓DNA含量增加，Th1/Th2升高。表明蛹蟲草多糖能夠有效緩解由5-FU所致的大鼠骨髓功能損傷。

綜上可見，蛹蟲草多糖灌胃可改善5-FU處理大鼠骨髓功能，但該藥能否用于減輕臨床化療藥物帶來的毒性反應還有待進一步研究。