張新帥，阮 瑤，劉武康，陳 倩，顧麗紅，郭愛(ài)玲,2,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.國(guó)家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢 430070）

溶菌酶因其溶菌作用而得名，是一種序列保守、無(wú)毒無(wú)副作用的抗菌蛋白，在生物體的天然免疫系統(tǒng)中起重要作用。該酶廣泛存在于高等動(dòng)植物組織和分泌物中，在微生物和噬菌體中也有分布，蛋清中溶菌酶含量最為豐富。雞蛋清溶菌酶是C-型溶菌酶的典型代表，也是研究溶菌酶結(jié)構(gòu)和功能的基本模型，并且已投入商品化生產(chǎn)[1]。100多年前，英國(guó)細(xì)菌學(xué)家亞歷山大·弗萊明第一個(gè)觀察到溶菌酶的溶菌作用[2]。溶菌酶的溶菌性質(zhì)主要?dú)w因于其能夠有效水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，其水解位點(diǎn)是N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM）和N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine，NAG）間的β-1,4-糖苷鍵。現(xiàn)已證明，溶菌酶的活性位點(diǎn)通過(guò)6 個(gè)子位點(diǎn)（A～F）與6 個(gè)連續(xù)糖單體結(jié)合，之后結(jié)合到D子位點(diǎn)的催化基團(tuán)谷氨酸（Glu）35，并和E位點(diǎn)的天冬氨酸（Asp）52通過(guò)一個(gè)雙取代反應(yīng)水解β-1,4-糖苷鍵[3-4]（圖1）。肽聚糖幾乎是所有細(xì)菌細(xì)胞壁的組分，它賦予細(xì)胞壁一定的機(jī)械強(qiáng)度，使細(xì)胞能夠抵抗細(xì)胞質(zhì)與外部環(huán)境之間組成差異造成的滲透壓，并維持細(xì)菌的特定形狀（球形、棒形、螺旋形等）[5]，一旦肽聚糖層受到破壞，細(xì)菌就會(huì)因處于高滲環(huán)境而快速裂解、死亡。另外，細(xì)胞壁肽聚糖的合成和精細(xì)結(jié)構(gòu)是多樣的，同時(shí)肽聚糖也是高度動(dòng)態(tài)更新的高分子，這個(gè)過(guò)程需要相關(guān)酶和蛋白質(zhì)的精確協(xié)調(diào)和控制[6-7]。

革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁肽聚糖含量存在很大差異，革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁由多達(dá)40 層的肽聚糖以及磷壁酸（wall teichoic acid，WTA）組成，而革蘭氏陰性菌通常只有不含WTA的單層肽聚糖，并夾在內(nèi)膜和含脂多糖的外膜之間，這些差異解釋了革蘭氏陽(yáng)性菌通常對(duì)溶菌酶敏感，而非革蘭氏陰性菌[5,7]。然而，這種屏障可被動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)的組分破壞，例如乳鐵蛋白、防御素和導(dǎo)管素，其都能使革蘭氏陰性菌的外膜透化[1]。溶菌酶基于酶活性的裂解機(jī)制已經(jīng)被廣泛接受，但越來(lái)越多的研究表明溶菌酶的胞壁酶活性不是體外或體內(nèi)細(xì)菌殺滅所必需的，溶菌酶作為一種陽(yáng)離子抗菌蛋白，可以在帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜上穿孔而形成有規(guī)則的離子孔道，從而引起胞內(nèi)大量的K+和內(nèi)容物外流，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[8-10]。因此，溶菌酶的酶活性和陽(yáng)離子特性都與抗菌活性有關(guān)。

目前，溶菌酶由于其獨(dú)特的生物學(xué)作用，在食品工業(yè)、生物工程、抗菌藥物、醫(yī)療診斷等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。在食品工業(yè)，溶菌酶主要用于水產(chǎn)類(lèi)制品、肉類(lèi)、乳制品、果蔬及飲料的防腐保鮮，其有效性已被廣泛證明[11-12]，同時(shí)被很多國(guó)家批準(zhǔn)使用，我國(guó)已經(jīng)頒布溶菌酶作為食品添加劑的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.257—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 溶菌酶》。溶菌酶雖然有良好的抗菌性，但其抑菌譜和抑菌效力具有局限性，因此目前的研究集中在將不同的生物防腐劑與溶菌酶進(jìn)行不同比例的復(fù)配。Marianna等[13]將溶菌酶、Nisin和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）進(jìn)行復(fù)配，有效抑制了單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和大部分肉類(lèi)腐敗菌的生長(zhǎng)。陳賽等[14]通過(guò)溶菌酶、殼聚糖和茶多酚復(fù)合保鮮液成功延緩了冷藏過(guò)程中草魚(yú)肌肉質(zhì)量的降低。另外，研究表明將溶菌酶固定到銀納米粒子，協(xié)同提高了對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）的抗菌活性[15]。開(kāi)發(fā)抗菌作用強(qiáng)、抑菌譜廣的復(fù)合生物防腐劑以及結(jié)合其他防腐保鮮措施將是未來(lái)的研究趨勢(shì)。

鑒于溶菌酶的廣泛分布和有效抗菌活性，致病菌已經(jīng)通過(guò)突變、變異等進(jìn)化出逃避或破壞溶菌酶殺滅的機(jī)制，一旦逃脫，致病菌將長(zhǎng)期存活并可能造成感染，這將對(duì)食品安全、疾病治療和人體健康造成一定的威脅。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)溶菌酶的生物活性和保鮮應(yīng)用研究較多，但對(duì)致病菌抵抗溶菌酶的研究較少。因此，本文對(duì)致病菌抵抗溶菌酶的機(jī)制和抗性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)進(jìn)行了闡述，以期為相關(guān)研究、新型食品抗菌劑的開(kāi)發(fā)以及臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

圖 1 溶菌酶的作用機(jī)制Fig. 1 Mechanism of action of lysozyme

1 致病菌抵抗溶菌酶的機(jī)制

具有引發(fā)疾病潛力的細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制來(lái)逃避溶菌酶的殺滅，主要通過(guò)肽聚糖修飾和產(chǎn)生溶菌酶抑制劑兩種途徑，如圖2所示。

1.1 肽聚糖修飾

1.1.1N-脫乙?；?/p>

溶菌酶的活性位點(diǎn)與肽聚糖主鏈上乙酰基之間的相互作用促進(jìn)了有效的水解活性，為限制這些相互作用，致病菌進(jìn)化出對(duì)肽聚糖單體殘基進(jìn)行脫乙?；揎椀幕?，以降低對(duì)溶菌酶的敏感度。肽聚糖的N-脫乙?；侵冈诿傅淖饔孟率筃AM或NAG的C2殘基脫去乙?；▓D2B），該反應(yīng)在60多年前被Roseman[16]首次證明。該修飾主要存在革蘭氏陽(yáng)性菌中，不同細(xì)菌中脫乙?；壤煌?，目前，鑒定到含有N-脫乙酰化肽聚糖的革蘭氏陰性菌只有幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori）和福氏志賀菌（Shigella flexneri）[17-18]。

肽聚糖去乙酰化的基因首先在肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）中被鑒定出來(lái)，被命名為肽聚糖N-脫乙酰酶（peptidoglycanN-acetylglucosamine deacetylase A，PgdA），PgdA屬于碳水化合物酯酶家族CE-4，其作用于NAG的C2殘基使其脫乙酰化，有助于提高溶菌酶抗性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)pgdA基因敲除體對(duì)溶菌酶體外殺傷更敏感，體內(nèi)毒力較小，基于此，pgdA被鑒定為毒力因子基因[19]。動(dòng)物病原體豬鏈球菌（Streptococcus suis）也有類(lèi)似的表型，pgdA基因敲除體與野生型豬鏈球菌相比，有著更低的去乙酰化水平，對(duì)溶菌酶更加敏感，更容易被中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)清除，其體內(nèi)毒性更小[20]。隨后在其他細(xì)菌中也鑒定到pgdA同源物，包括糞腸球菌（Enterococcus faecalis）[21]、幽門(mén)螺桿菌[18]、單核細(xì)胞增生李斯特菌[22]、艱難梭菌（Clostridium difficile）（pdaV）[23]、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）（Rv1096）[24]、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）（pdi）[25]、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）（Bc1974）[26]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（pgdA、pdaC）[27]，pdaV、Rv1096等毒力因子基因都能增強(qiáng)細(xì)菌自身對(duì)溶菌酶的體外抗性或增加細(xì)菌體內(nèi)存活率。而革蘭氏陰性菌幽門(mén)螺桿菌和福氏志賀菌由于外膜的存在，pgdA敲除體在體外僅在添加膜破壞劑（如乳鐵蛋白）時(shí)對(duì)溶菌酶敏感，而在宿主體內(nèi)其存活率也降低[16-17]。鑒于它們?cè)谟绊懠?xì)菌毒力中的重要性，肽聚糖修飾酶開(kāi)發(fā)新抗菌藥物的研發(fā)將是一個(gè)重要的發(fā)展方向，開(kāi)發(fā)肺炎鏈球菌PgdA抑制劑的可行性已經(jīng)得到證明[28-29]。

枯草芽孢桿菌PgdA是第一個(gè)被測(cè)定生化活性和結(jié)構(gòu)的細(xì)菌肽聚糖脫乙酰酶，該酶的NodB同源結(jié)構(gòu)域?yàn)椋é?α）8桶狀折疊結(jié)構(gòu)，含有大部分CE-4家族保守殘基，兩個(gè)保守的組氨酸（His）聚集在活性位點(diǎn)的底部[30]。隨后，又有相關(guān)研究報(bào)道了肺炎鏈球菌PgdA的晶體結(jié)構(gòu)，其含有3 個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，作為一種金屬酶，在不同金屬離子中酶的活性大小不同，EDTA能使其失活。該酶使用His-His-Asp鋅結(jié)合三聯(lián)體，以3 個(gè)連續(xù)的NAG（GlcNAc3）作為底物，鄰近保守的Asp和His分別催化堿和酸反應(yīng)，去除中間NAG的N-乙?；鵞31]。Bhattacharjee等[29]通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)手段研究幽門(mén)螺桿菌脫乙?；笍哪Ｐ偷孜颪AG去除乙?；姆磻?yīng)機(jī)理。最近，Giastas等[26]首次通過(guò)X射線(xiàn)衍射報(bào)道了N-脫乙?；疊c1974-(GlcNAc)3配合物的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了NodB結(jié)構(gòu)域中活性位點(diǎn)環(huán)（MT4）存在兩種不同的構(gòu)象，同時(shí)提出Bc1974的催化機(jī)制（水或氫氧根離子對(duì)N-乙?；腃＝O的碳原子進(jìn)行親核攻擊）。

1.1.2O-乙?；?/p>

肽聚糖的O-乙酰化是指向大多數(shù)細(xì)菌中NAM的C6羥基上添加乙?；▓D2C），通過(guò)空間位阻阻止溶菌酶與肽聚糖的結(jié)合[32]，一些乳桿菌和芽孢桿菌中也存在NAG的乙?；揎梉33-34]。NAM殘基的O-乙?；壤S菌株、培養(yǎng)時(shí)間和生長(zhǎng)條件而變化，通常在20%～70%[35]。

在過(guò)去的10 年中，已經(jīng)在多種致病菌中鑒定出負(fù)責(zé)乙?；揎椀幕颉Ｆ渲械谝粋€(gè)鑒定到的是革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的O-乙酰轉(zhuǎn)移酶（O-acetyltransferase A，OatA），其在C6位置乙?；疦AM，O-乙?；碾木厶欠€(wěn)定性更高，同時(shí)提高了體外溶菌酶的抗性和體內(nèi)細(xì)菌的存活率[32]。后續(xù)又在其他幾種革蘭氏陽(yáng)性菌中發(fā)現(xiàn)了oatA的同源物，單核細(xì)胞增生李斯特菌（oatA）[22]、肺炎鏈球菌（adr）[36]以及炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）（oatB）[33]中O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的喪失使得這些細(xì)菌對(duì)溶菌酶敏感，但前提是它們也缺乏pgdA或具有完全N-乙酰化肽聚糖。糞腸球菌就需要多種溶菌酶抗性因子的缺失才能觀察到溶菌酶敏感性，包括pgdA和oatA[21]。在分子水平上對(duì)OatA還知之甚少，預(yù)測(cè)oatA基因編碼假定的跨膜整合蛋白，由N末端跨膜整合結(jié)構(gòu)域連接C末端胞質(zhì)外結(jié)構(gòu)域組成，N末端結(jié)構(gòu)域從細(xì)胞質(zhì)中獲取乙?；缓髮⑵滢D(zhuǎn)移穿過(guò)內(nèi)膜，胞質(zhì)外C末端結(jié)構(gòu)域接受乙?；⒋呋阴；D(zhuǎn)移用以修飾NAM的C6羥基，C末端結(jié)構(gòu)域中富含賴(lài)氨酸（Lys）的區(qū)域被假定為催化活性位點(diǎn)，對(duì)預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行更密切的分析表明它具有SGNH/GDSL水解酶的折疊結(jié)構(gòu)，使用Asp-His-絲氨酸（Ser）殘基形成的催化三聯(lián)體轉(zhuǎn)移乙?；?，但至今其晶體結(jié)構(gòu)仍然未知[35,37]。

革蘭氏陰性菌不編碼OatA或OatB的同源物，其肽聚糖的O-乙?；枰环N雙組分蛋白（peptidoglycanO-acetyltransferases A，PatA）和（peptidoglycanO-acetyltransferases B，PatB），預(yù)測(cè)PatA像OatA或OatB一樣發(fā)揮作用，轉(zhuǎn)移乙酰基穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜，之后周質(zhì)中的PatB轉(zhuǎn)移乙?；罭AM的C6羥基，進(jìn)而修飾產(chǎn)生溶菌酶抗性[38]。該蛋白最初在病原體腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）和淋病奈瑟球菌（Neisseria gonorrhoeae）中被鑒定到，但最近研究發(fā)現(xiàn)patA基因的缺失不影響淋病奈瑟菌對(duì)溶菌酶的敏感性，除非細(xì)胞膜完整性也受到影響，而且并未增加其對(duì)人體中性粒細(xì)胞殺傷的敏感性[39]。在幽門(mén)螺桿菌和空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）中，在乳鐵蛋白存在下patA基因的缺失增加了細(xì)菌對(duì)溶菌酶的敏感性，而且空腸彎曲桿菌patA突變體對(duì)體外巨噬細(xì)胞的殺傷更敏感，體內(nèi)定植腸道的能力降低[40-41]。

圖 2 肽聚糖的不同修飾Fig. 2 Different modifications on peptidoglycan

目前，提取純化肽聚糖和液質(zhì)聯(lián)用分析是肽聚糖N-脫乙酰化和O-乙?；芯恐械闹匾侄危袝r(shí)從細(xì)菌中分離的肽聚糖純度無(wú)法得到保證，這使得研究具有挑戰(zhàn)性，無(wú)論是肽聚糖的結(jié)構(gòu)與功能分析還是具體抗性機(jī)制的研究，肽聚糖片段的體外化學(xué)合成研究將對(duì)此領(lǐng)域產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用[37]。另外，由于技術(shù)手段和提取修飾酶的難度和純度的限制，只有少數(shù)酶的晶體結(jié)構(gòu)已知。更多致病菌中的肽聚糖修飾基因及其結(jié)構(gòu)、N-脫乙?；蚈-乙?；木唧w催化途徑等問(wèn)題都有待深入研究，同時(shí)，肽聚糖修飾酶的細(xì)菌生理學(xué)功能目前仍不明確。

1.1.3 其他修飾

WTA對(duì)溶菌酶抗性也有一定的貢獻(xiàn)。金黃色葡萄球菌中WTA與NAM的C6羥基共價(jià)偶聯(lián)（圖2D），類(lèi)似于O-乙酰化，形成的空間位阻有助于抵抗溶菌酶的水解活性，但更進(jìn)一步的研究表明每9 個(gè)NAM殘基僅連接一個(gè)WTA，而O-乙?；壤^高，因此WTA僅充當(dāng)一個(gè)輔助功能，當(dāng)O-乙酰化修飾完全缺失時(shí)，雖然存在WTA修飾，但由于豐度低，溶菌酶仍然可以水解肽聚糖[42]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)WTA通過(guò)調(diào)節(jié)青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBP）4定位來(lái)控制肽聚糖交聯(lián)水平，進(jìn)而影響溶菌酶對(duì)其底物的可利用性來(lái)增加溶菌酶抗性[43]。同樣肺炎鏈球菌中murMN操縱子敲除體具有較低的肽聚糖交聯(lián)水平，并且對(duì)溶菌酶以及非酶促陽(yáng)離子抗菌肽更敏感[44]。最近，在新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）中發(fā)現(xiàn)莖桿細(xì)胞肽聚糖具有更多的LD-轉(zhuǎn)肽作用（m-DAP與m-DAP交聯(lián)），相比DD-交聯(lián)（m-DAP與D-Ala交聯(lián)）的細(xì)胞體肽聚糖具有更高的溶菌酶抗性[45]。

陽(yáng)離子抗菌蛋白質(zhì)高度結(jié)合細(xì)菌帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，這種相互作用對(duì)于有效殺滅細(xì)菌很重要。因此，將凈負(fù)電荷降低至中性電荷的修飾，可減少溶菌酶以及其他陽(yáng)離子抗菌蛋白的結(jié)合。在金黃色葡萄球菌中，MurT/GatD酰胺基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物在肽聚糖肽鏈的第二個(gè)位置將谷氨酸酰胺化為谷氨酰胺（圖2E），降低了肽聚糖的凈負(fù)電荷，增加完整細(xì)菌和純化肽聚糖對(duì)溶菌酶的抗性[46]。最近，肺炎鏈球菌的MurT/GatD復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和具體的酰胺化反應(yīng)機(jī)制已經(jīng)被證明[47]。dlt操縱子對(duì)WTA的D-丙氨?；步档土思?xì)胞膜的凈負(fù)電荷[7]。在其他致病菌也有發(fā)現(xiàn)WTA的D-丙氨?；揎梉48-51]。

1.2 溶菌酶抑制因子

一些革蘭氏陰性菌（銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和大腸桿菌）對(duì)溶菌酶具有內(nèi)在抗性，但這些細(xì)菌缺乏肽聚糖修飾。Monchois等[52]在2001年在研究大腸桿菌ykfE基因表達(dá)和編碼蛋白的功能特征時(shí)發(fā)現(xiàn)ykfE基因產(chǎn)物是同源二聚體，位于周質(zhì)空間，是有效的C-型溶菌酶抑制劑（Ki≈1 nm），之后將此基因更名為ivy（inhibitor of vertebrate lysozyme）。之后，在腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enteritidis）、大腸桿菌和銅綠假單胞菌中鑒定出了與Ivy無(wú)關(guān)的新型周質(zhì)和膜結(jié)合溶菌酶抑制劑，將其命名為MliC/PliC（membrane bound/periplasmic lysozyme inhibitors of c-type lysozyme）[53]，

還鑒定出命名為PliG（periplasmic lysozyme inhibitors of g-type lysozyme）和PliI（periplasmic lysozyme inhibitors of g-type lysozyme）的G-型和I-型溶菌酶的周質(zhì)抑制劑[54-55]。此外，在卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）中發(fā)現(xiàn)了溶菌酶抑制劑LipA和LipB[56]。最近，在奈瑟氏菌屬（Neisseria）中鑒定出黏附素復(fù)合蛋白（adhesin complex protein，ACP）以及在淋病奈瑟球菌中鑒定出一種由開(kāi)放閱讀框ngo1063編碼的新型表面暴露C-型溶菌酶抑制劑，將其命名為SliC（surface-exposed lysozyme inhibitor of C-type lysozyme）[57-59]。

目前的溶菌酶抑制劑家族僅在革蘭氏陰性菌中被發(fā)現(xiàn)，主要在變形菌門(mén)中，但不能排除革蘭氏陽(yáng)性溶菌酶抑制劑家族的存在。不同家族的溶菌酶抑制劑在一級(jí)序列水平上顯示出很低的相似性，兩種MliC和PliC僅有32%和27%，SliC與不同細(xì)菌中MliC的同一性最高僅為27.27%。但它們具有相同的特異性并具有特定的序列基序和相似的結(jié)構(gòu)拓?fù)?，MliC和PliC都含有相對(duì)保守的COG3895結(jié)構(gòu)域，SliC含有假定的MliC結(jié)構(gòu)域以及與溶菌酶作用的保守殘基S89和K103[57]。目前一些抑制劑家族的3D結(jié)構(gòu)以及一些抑制劑-溶菌酶復(fù)合物的3D結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)或核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）揭示。Ivy中心部分由5 個(gè)反平行β-折疊片和4 個(gè)α-螺旋構(gòu)成，抑制作用是通過(guò)Ivy中一個(gè)突出保守的CKPHDC環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該環(huán)中心的His殘基（H60）與負(fù)責(zé)溶菌酶酶活性的3 個(gè)殘基中的兩個(gè)（D52和E35）形成氫鍵，通過(guò)這樣的鎖鍵機(jī)制阻斷溶菌酶的活性位點(diǎn)[60]。PliC和MliC家族都折疊成一個(gè)八股反平行的β桶狀結(jié)構(gòu)，復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示MliC的關(guān)鍵保守區(qū)（COG3895結(jié)構(gòu)域殘基86-92和97-104）插入溶菌酶的活性位點(diǎn)裂縫中，具體通過(guò)殘基Ser89和溶菌酶Asp52之間的氫鍵以及殘基Lys103和溶菌酶Asp52與Glu35之間的離子鍵來(lái)緊密結(jié)合，并通過(guò)丙氨酸（Ala）取代證實(shí)了這一結(jié)果[61]。而PliI由兩個(gè)β-折疊片和一個(gè)α-螺旋構(gòu)成，定點(diǎn)誘變表明PliI的抑制作用是通過(guò)將含有保守SGxY基因序列的環(huán)插入I-型溶菌酶的活性中心實(shí)現(xiàn)的[62]。PliG家族由兩個(gè)β-折疊片構(gòu)成，與MliC/PliC和PliI家族共享高度保守的SG（x）xY序列基序，但發(fā)現(xiàn)該基序不參與G-型溶菌酶的抑制[63]。

溶菌酶抑制劑最直接的功能是保護(hù)細(xì)菌免受動(dòng)物宿主中溶菌酶的影響，因此對(duì)細(xì)菌定植或毒力有著重要作用。遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）中ivy和mliC是宿主感染所必需的毒力因子基因，鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）mliC基因的敲除減少了在巨噬細(xì)胞中的存活率，而淋病奈瑟球菌SliC在雌性淋病小鼠模型感染過(guò)程中對(duì)生殖道黏膜的定植起著關(guān)鍵作用[53,57,64]。細(xì)菌溶菌酶抑制劑另一個(gè)可能的功能是控制內(nèi)源性裂解性轉(zhuǎn)糖基酶，假單胞菌屬中表達(dá)的兩種Ivy蛋白已被證明不抑制溶菌酶活性，而是內(nèi)源性裂解性轉(zhuǎn)糖基酶的有效抑制劑。目前，該酶在肽聚糖代謝中的作用已經(jīng)確立，但它們的調(diào)節(jié)機(jī)制尚無(wú)定論[65]。

未來(lái)，溶菌酶抑制劑可能成為抗菌藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)有吸引力的新靶點(diǎn)，但目前仍存在一些尚未解決的問(wèn)題。是否存在革蘭氏陽(yáng)性菌溶菌酶抑制劑家族；溶菌酶抑制劑是否在細(xì)菌-宿主相互作用中存在其他功能；動(dòng)物中不同類(lèi)型溶菌酶抑制劑和不同類(lèi)型溶菌酶的表達(dá)復(fù)雜性以及是否存在特異性。這些問(wèn)題的解決將為相關(guān)研究和潛在應(yīng)用產(chǎn)生積極的促進(jìn)作用。

2 溶菌酶抗性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

雖然肽聚糖的修飾以及抑制劑的分泌等可以增加溶菌酶的耐受性，但也可能降低致病菌本身的環(huán)境適應(yīng)性，如肺炎鏈球菌就存在此種情況[42]。因此，細(xì)菌常常使用多種機(jī)制來(lái)調(diào)控抗性因子基因的表達(dá)水平，以更好地在溶菌酶等不良環(huán)境中存活，例如，糞腸球菌僅在溶菌酶環(huán)境中發(fā)生NAG的去乙?；揎梉66]。

2.1 胞質(zhì)外功能性sigma因子

胞質(zhì)外功能性σ因子（extracytoplasmic function sigma factors，ECFs）在細(xì)菌對(duì)各種環(huán)境應(yīng)激的應(yīng)答中起重要作用，是細(xì)菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的“第三支柱”。已知模式生物枯草芽孢桿菌中編碼7 種已知的ECFs（σM、σW、σV、σX、σY、σZ、σYlaC），其中σV被溶菌酶強(qiáng)烈且特異性地誘導(dǎo)，σV的活化是通過(guò)溶菌酶與抗σ因子RsiV的結(jié)合，進(jìn)而信號(hào)肽酶啟動(dòng)蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)切割降解RsiV和激活σV[67]，σM、σX和σV三者協(xié)同調(diào)控溶菌酶抗性，其中σV調(diào)控多個(gè)操縱子，通過(guò)激活兩種細(xì)胞壁修飾途徑賦予溶菌酶抗性：OatA催化肽聚糖的O-乙?；蚫ltABCDE操縱子對(duì)WTA的D-丙氨?；硗釶bpX可能對(duì)枯草桿菌的溶菌酶抗性也有貢獻(xiàn)，這是目前枯草芽孢桿菌中鑒定到的3 種機(jī)制[49,68]。

其他革蘭氏陽(yáng)性菌中也鑒定到σV系統(tǒng)。艱難梭菌至少編碼3 種σ因子，σT、σU和σV，編碼這些σ因子基因的表達(dá)是由細(xì)胞外應(yīng)激而激活的，包括抗菌肽或溶菌酶。在艱難梭菌中溶菌酶誘導(dǎo)csfV的表達(dá)，其編碼σV是溶菌酶抗性所必需的，進(jìn)一步通過(guò)微陣列和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析，發(fā)現(xiàn)σV使編碼脫乙酰酶pdaV基因的表達(dá)上調(diào)了17 倍，進(jìn)一步增加了NAG的去乙酰化比例，進(jìn)而增加溶菌酶的耐受性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)csfV敲除體在倉(cāng)鼠感染模型中毒性嚴(yán)重減弱。另一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)艱難梭菌σV也調(diào)控dlt操縱子，并且該途徑同樣影響體內(nèi)毒力，這些都表明σV是艱難梭菌的重要毒力因子[23,50]。在糞腸球菌中σV作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由溶菌酶和其他細(xì)胞壁應(yīng)激物誘導(dǎo)表達(dá)，僅顯著正調(diào)節(jié)pgdA，不直接調(diào)控oatA或dlt操縱子，但sigV/oatA/dltA三基因敲除體顯示出最低的溶菌酶抗性，表明三者在糞腸球菌的溶菌酶抗性中有著未知的協(xié)同作用，在小鼠模型中sigV敲除的糞腸球菌定植和維持感染能力受到顯著影響[69]?？梢钥闯觯@3 種不同的革蘭氏陽(yáng)性菌通過(guò)不同的策略來(lái)響應(yīng)溶菌酶。

2.2 雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)

雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是細(xì)菌應(yīng)對(duì)各種環(huán)境變化的重要機(jī)制，其基本結(jié)構(gòu)為一個(gè)組氨酸蛋白激酶和一個(gè)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白。雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)GraRS誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌中dlt操縱子的表達(dá)，并協(xié)同oatA增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)溶菌酶的抗性，GraRS由特定的陽(yáng)離子抗菌肽激活，但這種激活的機(jī)制仍有待研究[8]。許多其他細(xì)菌也具有類(lèi)似的雙組分系統(tǒng)，單核細(xì)胞增生李斯特菌中VirR正向調(diào)節(jié)dlt操縱子，并且virR基因敲除體在小鼠體內(nèi)的毒力減弱，故virR鑒定為prfA調(diào)節(jié)子后的第二個(gè)關(guān)鍵毒力調(diào)節(jié)子[70]。卡他莫拉菌中響應(yīng)調(diào)節(jié)器mesR基因的敲除上調(diào)了溶菌酶抑制劑編碼基因lipA和lipB的表達(dá)[56]。豬鏈球菌中vraSR基因敲除體對(duì)氧化劑和溶菌酶的敏感性更高，小鼠感染模型證實(shí)菌株毒力也大大降低[71]。

2.3 最新轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

最近研究還發(fā)現(xiàn)一些新型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來(lái)調(diào)控溶菌酶耐受性。單核細(xì)胞增生李斯特菌的degU和rli31基因敲除體對(duì)溶菌酶極其敏感，并且在體內(nèi)感染期間毒性減弱，pgdA和pbpX基因在degU和rli31基因敲除體中mRNA豐度降低，而pgdA的上調(diào)恢復(fù)了rli31敲除體的溶菌酶抗性，但rli31和degU如何調(diào)節(jié)pgdA和pbpX還有待闡明[48]。SpoVG是一種保守的RNA結(jié)合蛋白，與非編碼RNA Rli31相互作用，通過(guò)不確定的機(jī)制負(fù)調(diào)節(jié)單核細(xì)胞增生李斯特菌的溶菌酶抗性、毒力和群集運(yùn)動(dòng)能力[72]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂蛋白GpsB影響單核細(xì)胞增生李斯特菌的溶菌酶抗性，gpsB基因敲除體的溶菌酶抗性增加，生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溶菌酶抗性增加是依賴(lài)于PgdA而非OatA，GpsB通過(guò)雙功能PBP A1對(duì)PgdA發(fā)揮作用[73]。Gogos等[74]在化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）中發(fā)現(xiàn)Rgg2/3群體感應(yīng)系統(tǒng)在所有測(cè)序分離株中都是保守的，其誘導(dǎo)帶正電荷的分泌蛋白StcA表達(dá)，該系統(tǒng)的激活將導(dǎo)致生物膜的形成和溶菌酶抗性的增加，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明StcA蛋白可能與細(xì)胞表面的負(fù)電荷結(jié)構(gòu)域發(fā)生離子締合以幫助細(xì)菌逃避溶菌酶殺傷，這是有關(guān)溶菌酶抗性的一種新機(jī)制。來(lái)自腸外致病性大腸桿菌的O-特異性多糖是脂多糖介導(dǎo)抑制溶菌酶殺菌活性所必需的，并且單獨(dú)的O-特異性多糖也能夠通過(guò)與溶菌酶直接相互作用來(lái)抑制溶菌酶的水解活性[75]。

3 結(jié) 語(yǔ)

溶菌酶作為宿主防御外源微生物的重要物質(zhì)，一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，溶菌酶和入侵微生物之間的不斷競(jìng)爭(zhēng)，使致病菌進(jìn)化出多種機(jī)制來(lái)阻止溶菌酶的殺滅。溶菌酶作為一種有效抑菌的天然生物防腐劑，在食品工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，食品一旦污染了具有溶菌酶抗性的致病菌，由于溶菌酶的抑菌作用減弱，致病菌將大量生長(zhǎng)繁殖，這將造成重大食品安全隱患，因此抗溶菌酶機(jī)制的研究對(duì)更有效、更全面食品防腐劑的開(kāi)發(fā)有著積極作用。

溶菌酶抗性明顯代表一種致病菌發(fā)病機(jī)理的常見(jiàn)機(jī)制，因?yàn)槿芫该舾型蛔凅w的毒力在多種感染模型中嚴(yán)重減弱，溶菌酶抗性基因也常被鑒定為毒力因子，因此這可以成為未來(lái)抗菌劑開(kāi)發(fā)和臨床治療的方向。其中肽聚糖修飾位點(diǎn)可以成為有利靶點(diǎn)，部分肽聚糖修飾酶抑制劑的可行性已經(jīng)得到證明，即使這些酶的抑制劑體外活性較低，它們也可以通過(guò)弱化肽聚糖使其易受宿主攻擊而提供與先天免疫系統(tǒng)協(xié)同作用的機(jī)會(huì)。另外，可以通過(guò)干擾溶菌酶-抑制劑相互作用的抑制分子來(lái)增加細(xì)菌的溶菌酶敏感性，并因此降低其致病性，因而對(duì)不同抑制劑與同源溶菌酶的分子相互作用機(jī)制的研究將是開(kāi)發(fā)有效抑制分子的先決條件。

多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，但仍然存在很多空白。更多物種肽聚糖修飾酶的鑒定、結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制以及溶菌酶抗性之外可能的生理功能，仍待認(rèn)識(shí)的溶菌酶抑制劑、現(xiàn)有抑制劑與溶菌酶之間的作用模式以及可能的生物學(xué)功能，調(diào)節(jié)溶菌酶抗性因子所涉及的因素以及具體調(diào)控機(jī)制等，都將是未來(lái)研究的方向。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展也將為相關(guān)研究提供新思路，新物種的全基因組測(cè)序序列可以通過(guò)比對(duì)工具BLAST等鑒定與已知溶菌酶抗性基因序列或蛋白質(zhì)序列相似度較高的序列并進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，溶菌酶處理下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也可以發(fā)現(xiàn)未知的調(diào)節(jié)基因，之后進(jìn)行特定基因的功能驗(yàn)證，這些為更多未知功能基因的挖掘提供了一個(gè)全新的途徑。