李錦意 張婷 柳莉丹 陳永鋒

南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院皮膚科，廣州510000

Sprouty 蛋白是1998 年Hacohen 等發(fā)現(xiàn)的Ras/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）信號通路特異性抑制蛋白［1］。各階段胚胎和成人組織廣泛表達(dá)Sprouty1、2 和4。Sprouty 蛋白可以拮抗受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）信號通路，發(fā)揮不同的功能，包括抑制人類胚胎干細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及分化。國內(nèi)外研究顯示，Sprouty 參與多種腫瘤的增殖、分化及轉(zhuǎn)移，其中Sprouty1 在多種類型的腫瘤中表達(dá)下調(diào)，包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌，尤其是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤［2?3］。而Song 等［4］用多變量分析表明Sprouty2 的表達(dá)下調(diào)與肝癌高度惡性表型如血管侵襲和晚期腫瘤分期相關(guān)。尋常型銀屑病是一種慢性炎癥性紅斑鱗屑性皮膚病，易復(fù)發(fā)，與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)。而參與銀屑病發(fā)病機(jī)制的MAPK激酶控制著各種重要功能，如細(xì)胞增殖、分化、基因表達(dá)和角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡［5?6］。我們檢測尋常型銀屑病患者中Sprouty蛋白質(zhì)和mRNA 的表達(dá)水平，探討Sprouty 在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)與銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分的相關(guān)性和臨床意義。

對象與方法

一、對象

2018 年5-11 月選擇南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院皮膚科門診就診的尋常型銀屑病患者15 例，以我院整形外科行整形手術(shù)者10 例為健康對照。所有患者取材前1 個月內(nèi)未接受過系統(tǒng)治療，2 周內(nèi)未外用銀屑病治療藥物，排除患有紅斑狼瘡、天皰瘡、皮肌炎等自身免疫性皮膚病、嚴(yán)重感染和合并肝腎及其他嚴(yán)重疾病的患者以及懷孕、哺乳期婦女。健康對照組均排除銀屑病和其他自身免疫性皮膚病，并經(jīng)組織病理學(xué)證實取材皮膚正常。本研究已經(jīng)過南方醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批號GDDHLS?20180309），所有受試者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

二氨基聯(lián)苯胺（DAB）為上?；蚩萍加邢薰井a(chǎn)品；兔抗人Sprouty1、2、4 多克隆抗體、內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）均為英國Abcam 公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT?PCR）試劑盒為日本Takara公司產(chǎn)品；二喹啉甲酸蛋白測定試劑盒為北京康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；超敏型電化發(fā)光（ECL）底物為廣東鉑西生物科技有限公司產(chǎn)品。

三、實驗方法

1.標(biāo)本處理：選取尋常型銀屑病患者軀干或四肢皮損及健康對照正常皮膚組織，各切取約1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm 組織，平均分成3 份，其中2 份分別放入標(biāo)記好的凍存管中，-80 ℃液氮凍存，用于Western 印跡和RT?PCR 檢測；1 份用4%甲醇固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

2. 免疫組化檢測Sprouty 蛋白表達(dá)：石蠟標(biāo)本切片脫蠟水化；加入烘箱脫膜液及95%乙醇高溫脫蠟，流動水中冷卻；滴入3%H2O2溶液室溫避光孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次；分別滴加抗Sprouty1（1∶100）、2（1∶400）和4（1∶500）抗體，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗3 次。滴加羊抗兔多克隆抗體，37 ℃水浴20 min，PBS 沖洗3 次。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，95%乙醇置換去水。中性樹膠封片，鏡檢，拍照。光鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)見棕黃色顆粒即Sprouty 陽性，細(xì)胞著色強(qiáng)度高于背景為非特異性染色。

3.RT?PCR檢測尋常型銀屑病皮損和對照組皮膚中Sprouty mRNA 表達(dá)：將凍存組織研磨后用Trizol?A 一步法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA 濃度和純度。本實驗選用兩管反應(yīng)體系對目的基因和內(nèi)參照進(jìn)行擴(kuò)增，建立總體積為20 μl 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄完成后，取2 μl cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，共進(jìn)行50個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后60 ℃延伸10 min，4 ℃保存。引物序列：GADPH 正向5′-AAGTATGACAACAGCCT CAAG-3′，反向3′-TCCACGATACCAAAGTTGTC-5′；Sprouty1 正 向5′-ATGGATCCCCAAAATCAAC A-3′，反向3′-CGAGGAGCAGGTCTTTTCAC-5′；Sprouty2 正向5′-CCCCTCTGTCCAGATCCATA-3′，反向3′-CCCAAATCTTCCTTGCTCAG-5′；Sprouty4正 向5′-CCCGGCTTCAGGATTTAC-3′，反 向3′-GCTGGACCATGACTGAGTTG-5′。RT?PCR反應(yīng)結(jié)束后，LightCycler II DNA擴(kuò)增儀自動分析并計算Ct值，以2-ΔΔCt為該目的基因mRNA 的相對表達(dá)量，2-ΔΔCt>1表示目的基因表達(dá)上調(diào)，反之下調(diào)。

4.Western印跡法檢測銀屑病皮損和正常對照皮膚Sprouty的表達(dá)：切除多余脂肪組織，保留表皮和真皮組織，提取皮損和正常皮膚組織蛋白，用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)10%十二烷基硫酸銨-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。將聚偏氟乙烯膜浸入5%牛血清白蛋白封閉液，于室溫置搖床平緩搖動1 h；加入抗Sprouty1（1∶1 000）、Sprouty2（1∶1 000）和Sprouty 4（1∶1 000）抗體4 ℃孵育過夜，再加入羊抗兔多克隆抗體室溫置搖床平緩搖動1 h，回收一抗和二抗后均用Tris?Buffered Saline and Tween 20（TBST）漂洗3 次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光，曝光，顯影，定影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Gel?analyzer 分析系統(tǒng)對目的顯色條帶進(jìn)行吸光度（A值）分析和掃描，觀察各實驗組目的蛋白條帶灰度，以內(nèi)參GADPH 蛋白條帶灰度作為參照，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。計量資料以±s 表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗。Sprouty 蛋白表達(dá)強(qiáng)度與PASI 評分的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)ɑ=0.05。

結(jié) 果

一、免疫組化檢測結(jié)果

見圖1。Sprouty1在對照組表皮全層細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈深棕色，在顆粒層強(qiáng)表達(dá)，在銀屑病皮損顆粒層細(xì)胞的細(xì)胞膜有少量表達(dá)，呈淺棕色。Sprouty4 在銀屑病皮損棘細(xì)胞層的細(xì)胞核膜和核仁中表達(dá)，而在對照組棘細(xì)胞層整個細(xì)胞核中表達(dá)，均呈深棕色。Sprouty2 在兩組棘細(xì)胞層的細(xì)胞膜上少量表達(dá)，呈淡黃色。

二、RT?PCR檢測結(jié)果

見表1。銀屑病皮損Sprouty1 mRNA表達(dá)強(qiáng)度低于對照組（P＜0.05），而Sprouty4 mRNA表達(dá)強(qiáng)度高于對照組（P＜0.05），Sprouty2 mRNA 表達(dá)在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

三、Western印跡法檢測結(jié)果

Western 印跡法檢測顯示，銀屑病皮損和正常對照皮膚中均有Sprouty1、2 和4 的表達(dá)，但銀屑病皮損Sprouty1 蛋白表達(dá)量低于對照組（P＜0.001），而Sprouty4 蛋白表達(dá)量高于對照組（P＜0.001），Sprouty2 蛋白表達(dá)兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P =0.201）。見表1、圖2。

圖1 免疫組化檢測Sprouty1、Sprouty4 和Sprouty2 的表達(dá)（×100） 1A、1B：Sprouty1在正常皮膚全層表達(dá)，在銀屑病皮損顆粒層弱表達(dá)；1C、1D：Sprouty4 在正常皮膚及銀屑病皮損中全層表達(dá)；1E、1F：Sprouty2 在正常皮膚及銀屑病皮損中少量表達(dá)于棘層中下部

四、銀屑病皮損Sprouty 蛋白表達(dá)量與PASI 評分的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析顯示，15 例尋常型銀屑病患者PASI 評分與Sprouty1 蛋白相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r =-0.628，P = 0.012），與Sprouty4 蛋白呈正相關(guān)（r=0.812，P ＜0.001），與Sprouty2蛋白無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（r=0.436，P=0.104）。見圖3。

討 論

RTK 信號由RAS?RAF?MEK?MAPK 級聯(lián)反應(yīng)和PI3K?AKT 通路調(diào)節(jié)，這兩個通路由負(fù)反饋環(huán)路調(diào)節(jié)。MAPK信號通路是細(xì)胞內(nèi)增殖、分化中至關(guān)重要的信號通路。Tseng等［7］研究表明，MAPK被激活后通過與血管內(nèi)皮生長因子相互作用促進(jìn)血管形成，在表皮中促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，從而參與銀屑病的發(fā)病過程。也有研究顯示，CKLF1?C19 多肽通過抑制MAPK 途徑抑制炎癥細(xì)胞浸潤和微血管細(xì)胞增殖，從而阻止銀屑病的進(jìn)展［8］。Sprouty 蛋白的表達(dá)異?？赡鼙砻鱎TK/Ras/Raf/MAPK 信號的異?；罨?］。Sprouty蛋白和關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子限制RTK 活化的強(qiáng)度和持續(xù)時間，阻礙RAS?RAF?MEK?MAPK 和PI3K?AKT 信號通路活化［10］。

本研究免疫組化顯示，Sprouty1 在正常皮膚顆粒層胞膜和胞質(zhì)高表達(dá)，而在尋常型銀屑病皮損的顆 粒 層 胞 膜 弱 表 達(dá)，與Wang 等［11］研 究 發(fā) 現(xiàn)Sprouty1 主要位于正常皮膚的顆粒層角質(zhì)形成細(xì)胞胞質(zhì)中的結(jié)果一致。我們通過RT?PCR 和Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，Sprouty1在尋常型銀屑病皮損表達(dá)減少，而Wang 等發(fā)現(xiàn)Sprouty1 可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白來抑制增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且Sprouty1 可能在表皮終末分化中起作用，提示Sprouty1 可能參與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。Sprouty1可能是正常皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚炎癥反應(yīng)中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑，增強(qiáng)Sprouty1表達(dá)可能具有增強(qiáng)抗炎作用的可能性，從而可能抑制銀屑病發(fā)病。但Sprouty1 參與銀屑病的明確機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

Sprouty4 在本文對照組皮膚和尋常型銀屑病組皮損表皮細(xì)胞胞核均高表達(dá)，RT?PCR和Western印跡檢測顯示，尋常型銀屑病組Sprouty4 mRNA 和蛋白表達(dá)增多。Shi 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，Sprouty4 介導(dǎo)MAPK通路的蛋白質(zhì)復(fù)合物磷酸化和去磷酸化，參與多種生物學(xué)功能，包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞間連接、轉(zhuǎn)錄控制、細(xì)胞遷移和信號通路調(diào)節(jié)。Xu 等［13］發(fā)現(xiàn)，Sprouty4 通過結(jié)合相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)FGFR?RAS 途徑來抑制ERK 磷酸化。Sprouty4 或許通過參與MAPK 通路相關(guān)蛋白磷酸化或去磷酸化參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等，從而參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展。但具體機(jī)制以及更多可能相關(guān)的信號通路仍需進(jìn)一步研究。而Sprouty4 與Spouty1 在角質(zhì)形成細(xì)胞分布不同，可能二者作用于不同階段角質(zhì)形成細(xì)胞，從而相輔相成促進(jìn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)性分析顯示，Sprouty1 與PASI 評分呈負(fù)相關(guān)，而Sprouty4 則呈正相關(guān)，進(jìn)一步支持Sprouty1、Sprouty4與銀屑病密切相關(guān)的觀點(diǎn)。

表1 尋常型銀屑病組皮損和對照組正常皮膚Sprouty mRNA和蛋白的表達(dá)水平（±s）

表1 尋常型銀屑病組皮損和對照組正常皮膚Sprouty mRNA和蛋白的表達(dá)水平（±s）

注：a 以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平

組別例數(shù)mRNA表達(dá)（2-ΔΔCt）蛋白表達(dá)a Sprouty1 0.972±0.105 0.844±0.169 2.143 0.043 Sprouty2 1.005±0.012 0.097±0.091-0.648 0.523 Sprouty4 0.714±0.615 1.727±1.017 2.814 0.010 Sprouty1 0.413±0.108 0.148±0.141-5.015<0.001對照組銀屑病組t值P值10 15 Sprouty2 0.148±0.141 0.292±0.154-1.316 0.201 Sprouty4 0.584±0.304 1.306±0.283 6.063<0.001

圖2 Western印跡檢測Sprouty1、Sprouty4和Sprouty2的表達(dá) 與對照組相比，Sprouty1在尋常型銀屑病皮損中表達(dá)減少，Sprouty4表達(dá)增多，Sprouty2表達(dá)無明顯差異。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖3 15例尋常型銀屑病患者Sprouty1（4A）、Sprouty4（4B）、Sprouty 2（4C）蛋白表達(dá)與銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分相關(guān)性

免疫組化、RT-PCR 和Western 印跡檢測顯示，Sprouty2 mRNA和蛋白在健康對照組和尋常型銀屑病組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Sprouty2可能與銀屑病發(fā)病發(fā)展無相關(guān)性。由于大量研究提示，Sprouty2 與腫瘤相關(guān)，Sprouty2 與銀屑病的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，在尋常型銀屑病患者皮損中Sprouty1表達(dá)下調(diào)，而Sprouty4表達(dá)上調(diào)，且二者均與PASI 評分存在相關(guān)性，提示Sprouty1 和Sprouty4在尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程可能發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步闡明銀屑病發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供新思路。但Sprouty1和Sprouty4如何通過相關(guān)蛋白或通路參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展，仍需深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突