陸茂 冉玉平 代亞玲 歐美 吳紅梅 羅媛元

1四川大學華西醫(yī)院皮膚科，成都610041；2成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院皮膚科610500陸茂現(xiàn)在成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院皮膚科，成都610500

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種臨床常見的慢性、復發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病。近年來微生物定植（包括細菌、真菌等）在AD 發(fā)病中的作用逐漸得到重視，但既往對微生物的研究僅集中在其中少數(shù)幾種，多采用分離培養(yǎng)法來確定微生物與AD 的關(guān)系，未從宏觀上兼顧微生物協(xié)作共生的角度分析，缺乏對微生物群落整體分布和結(jié)構(gòu)的研究。目前對AD患者皮膚微生物多樣性研究主要集中于細菌群落［1?3］，而對皮膚真菌群落多樣性研究的報道很少。我們在AD 患者面部、上肢和背部皮損區(qū)和健康人相應區(qū)域采樣，提取樣品DNA，應用真菌通用引物內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）1 和ITS2 進行PCR 擴增，通過MiSeq 高通量測序及生物信息學研究，分析AD 患者皮膚真菌群落多樣性及其與臨床特征的相關(guān)性。

對象與方法

一、對象

10 例入選的AD 患者來自2015 年9- 10 月成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院皮膚科門診，符合AD 的診斷標準［4］，且每例患者皮損均累及面部、上肢和背部。男5 例，女5 例；年齡2～12（7.30 ± 3.89）歲。10例健康對照來自成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院工作人員子女，男6例，女4例；年齡3～14（6.90±3.54）歲。受試者2周內(nèi)無使用抗真菌藥物和糖皮質(zhì)激素史，采樣前24 h內(nèi)不能在采樣部位使用任何清潔用品（包括水洗）或藥物，不伴有其他皮膚病，不伴有腫瘤或其他嚴重疾患。對AD 患者病情嚴重程度進行評分，參照濕疹面積及嚴重度指數(shù)（eczema area and severity index，EASI）評分法［5］，<7 分為輕度，7～21 分為中度，> 21 分為重度［6］，10 例AD 患者EASI評分為（16.51±14.71）分（范圍3.0～55.2 分），其中輕度3 例，中度4 例，重度3例。本研究通過成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（批件號2018CYFYHEC?BA?40），所有受試者的監(jiān)護人均簽署知情同意書，對有能力做出同意參加臨床試驗決定的兒童，還征得其本人同意。

二、方法

1.主要試劑和儀器：醫(yī)用無菌棉簽（成都市新津事豐醫(yī)療器械有限公司），E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（美國Omega Bio?Tek 公司），ITS1、ITS2 引物（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），ABI GeneAmp?9700型PCR 儀（美國Thermo 公司），QuantiFluor??ST 藍色熒光定量系統(tǒng)（美國Promega 公司），F(xiàn)R?200A 凝膠成像系統(tǒng)（上海復日科技有限公司），Nanodrop 3300熒光分光光度計（美國Thermo公司），Miseq測序儀（美國Illumina公司）。

2.采樣：采樣部位為AD患者面部、上肢和背部皮損區(qū)以及健康對照的相應區(qū)域，AD 患者皮損區(qū)為慢性或消退期無滲出皮損。采樣時室溫26 ℃左右。采樣方法：在采樣部位選取一處約3 cm×3 cm區(qū)域；將醫(yī)用無菌棉簽在生理氯化鈉溶液中潤濕，在選定區(qū)域內(nèi)來回涂擦50 次，持續(xù)時間約45 s；用無菌鑷子取下棉簽頭并放置在1.5 ml 無菌EP 管中，-80 ℃保存。健康對照樣本按面部、上肢、背部順序依次編為1～30 號，AD 患者依次編為31～60號。

3.樣本DNA 的提取、PCR 擴增及MiSeq 測序：所有樣本送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 提取皮膚樣本DNA。利用ITS1引物（5′?CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA?3′）、ITS2引物（5′?GCTGCGTTCTTCATCGATGC?3′）進行PCR 擴增。擴增體系為20 μl，包括10 × 緩沖液2 μl、2.5 mmol/L dNTPs 2 μl、5 μmol/L 上游和下游引物各0.8 μl、rTaq聚合酶0.2 μl、DNA模板2 μl，牛血清白蛋白0.2 μl，補ddH2O 至20 μl。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。利用Illumina MiSeq 技術(shù)測序平臺，完成擴增子測序。

4.生物信息分析：對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控過濾，得到優(yōu)化序列。然后在去除嵌合體序列后進行序列可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的劃分聚類分析，并對OTU 的代表序列作分類學分析?；贠TU 聚類分析結(jié)果進行多樣性指數(shù)分析、主成分分析，基于OTU 分類學信息結(jié)果進行物種組成分析。采用Shannon 指數(shù)計算微生物群落多樣性，其數(shù)值越大說明群落多樣性越高。

5.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，兩兩組間多重比較采用LSD?t 檢驗，P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、測序結(jié)果

原始測序數(shù)據(jù)為1 773 637×2條reads，經(jīng)質(zhì)控過濾后得到2 652 101 條優(yōu)化（有效）序列，平均長度242.77 bp。所有序列經(jīng)過聚類，60 個樣本共得到4 312 個有效OTU。其中10 例AD 患者的30 份標本有3 357個有效OTU，10例健康對照的30份標本有2 956個有效OTU，兩者共有2 001個相同的有效OTU。

二、多樣性指數(shù)分析

AD 患者組總樣本和面部、上肢、背部樣本Shannon 指數(shù)均高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05 或0.01），見表1。AD 患者組3 個部位Shannon 指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（F=0.51，P > 0.05），健康對照組差異也無統(tǒng)計學意義（F =0.42，P>0.05）。

三、物種組成分析

1.總樣本真菌群落結(jié)構(gòu)分析：所有樣本中超過99%的真菌來自擔子菌門（58.50%）和子囊菌門（40.92%）。其中擔子菌門的馬拉色菌屬在各樣本中均占主要地位，在AD 患者組總樣本中豐度為42.59%，健康對照組為49.34%，兩組高于0.1%的屬均為88 個，除馬拉色菌屬外其他屬的豐度都<10%，豐度>1%的主要真菌屬見表2。AD患者組念珠菌屬、曲霉屬豐度高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t 值分別為3.515、2.137，均P<0.05），其余各主要真菌屬豐度比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2. 不同部位真菌屬構(gòu)成分析：見圖1，兩組馬拉色菌屬均占主要地位（豐度近50%）。AD 患者組、健康對照組面部皮膚豐度高于0.1%的屬分別有87 個、82 個，上肢均為86 個，背部分別為85 個、86 個，豐度> 1%的主要真菌屬見表3。兩組面部各主要真菌屬（豐度>1%）豐度差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）；AD患者組上肢念珠菌屬豐度高于健康對照組（t=3.186，P<0.05），其余各主要真菌屬豐度差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。AD 患者組背部曲霉屬豐度高于健康對照組（t = 2.736，P<0.05），其余各主要真菌屬豐度差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。兩組面部、上肢和背部樣本之間主要真菌屬（豐度>1%）豐度差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 特應性皮炎患者組與健康對照組皮膚樣本真菌Shannon指數(shù)比較（±s）

表1 特應性皮炎患者組與健康對照組皮膚樣本真菌Shannon指數(shù)比較（±s）

組別患者組健康對照組t值P值例數(shù)10 10總樣本4.04±2.80 3.21±0.99 4.45<0.01面部4.11±0.28 3.42±0.77 2.67 0.02上肢3.98±0.34 3.04±1.14 2.37 0.04背部4.05±0.19 3.14±0.84 3.34 0.01

表2 特應性皮炎患者組和健康對照組皮膚樣本總樣本豐度>1%的真菌屬

3.AD 患者樣本真菌屬構(gòu)成分析：輕、中、重度AD 患者組均以馬拉色菌屬占主要地位（近50%），見圖2。輕、中、重度AD患者組豐度高于0.1%的屬分別有81、82 和84 個，豐度>1%的主要真菌屬見表4。輕、中、重度AD患者組各主要真菌屬豐度差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。

圖1 特應性皮炎（AD）患者和健康對照面部、上肢和背部皮膚樣本真菌群落結(jié)構(gòu)柱形圖

圖2 輕中重度特應性皮炎（AD）患者皮膚樣本真菌群落結(jié)構(gòu)柱形圖

4.馬拉色菌屬結(jié)構(gòu)分析：AD患者組共有（5.37±1.94）個馬拉色菌菌種，健康對照組（4.10±1.42）個，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=2.885，P<0.05）。

AD患者組與健康對照組馬拉色菌菌種構(gòu)成見表5，球形馬拉色菌、限制馬拉色菌豐度較高，兩者合計約為80%。球形馬拉色菌在AD患者組樣本中占41.19% ± 34.17%，在健康對照組中占35.70% ±29.42%，兩組差異無統(tǒng)計學意義（t = 0.828，P >0.05）；限制馬拉色菌在AD 患者組占40.07% ±28.71%，在健康對照組占42.07%±36.54%，兩組差異亦無統(tǒng)計學意義（t=-0.409，P>0.05）；其余各馬拉色菌菌種在兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P >0.05）。

表3 特應性皮炎（AD）患者和健康對照面部、上肢和背部皮膚樣本主要真菌屬（豐度>1%）

5.念珠菌屬結(jié)構(gòu)分析：AD 患者組共有（5.77±3.01）個念珠菌菌種，健康對照組有（4.90 ± 2.09）個，兩組差異無統(tǒng)計學意義（t = 1.294，P > 0.05）。兩組念珠菌菌種構(gòu)成見表6，近平滑念珠菌豐度較高，占比均>75%。各念珠菌菌種在兩組間的比例差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表4 輕中重度特應性皮炎患者皮膚樣本主要真菌屬（豐度>1%）

表5 特應性皮炎患者與健康對照皮膚馬拉色菌菌種構(gòu)成

四、AD 患者組各部位皮膚真菌群落主成分分析

見圖3，AD患者組面部、上肢、背部皮膚真菌群落未按病情嚴重程度聚類。

討 論

早期的皮膚微生物多樣性研究主要采用分離培養(yǎng)來識別微生物群落的結(jié)構(gòu)特征，而大量微生物因生長條件苛刻不能或不易分離培養(yǎng)［7］，因此難以全面認識皮膚微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，在皮膚原位取樣進行高通量測序，在分子水平基于序列分析成為研究皮膚微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)特征的主流方法［8］。不少研究者使用此方法研究皮膚細菌的群落特征，但針對皮膚真菌的研究則很少。2013年，美國學者［9］首次報道用高通量測序技術(shù)研究健康人皮膚真菌群落多樣性的方法和結(jié)果，即使用棉簽收集10例18～40歲健康人14個部位的皮膚樣本，利用ABI3730xl和羅氏454 測序平臺，對樣本中的ITS1 區(qū)進行測序分析。結(jié)果顯示，樣本中真菌均來自擔子菌門和子囊菌門，擔子菌門的馬拉色菌屬在除足部的其他11個部位占主要地位，其真菌群落多樣性主要表現(xiàn)在馬拉色菌各個菌種的分布，其中外耳道、耳后和眉間以限制馬拉色菌為主，中上背、枕部和腹股溝以球形馬拉色菌為主，鼻孔、肘窩、前臂屈側(cè)和小魚際以球形馬拉色菌、限制馬拉色菌和合軸馬拉色菌為主，而足部的3個部位真菌群落多樣性非常高，約有80種真菌。Zhang 等［10］采用高通量測序技術(shù)研究9 例AD 患者面部皮損和10 例健康對照相同區(qū)域的真菌群落多樣性，結(jié)果顯示：①AD患者組中馬拉色菌屬占主要地位（68.7%），非馬拉色菌酵母菌占19.9%，霉菌占12.3%，健康對照組中馬拉色菌屬也占主要地位（79.2%），非馬拉色菌酵母菌占12.8%，霉菌占8.1%；②球形馬拉色菌和限制馬拉色菌是AD 患者組和健康對照組的主要菌種；③共檢測到15個非馬拉色菌酵母菌屬，排在前3位的是念珠菌屬、枝孢屬和隱球菌屬，AD患者非馬拉色菌酵母菌菌種多樣性顯著高于健康對照；④共檢測到16 個霉菌屬，排在前3 位的是鏈格孢屬、Apioplagiostoma和曲霉屬，AD 患者霉菌菌種多樣性與健康對照無顯著差異。

表6 特應性皮炎患者與健康對照皮膚樣本念珠菌菌種構(gòu)成

圖3 輕中重度特應性皮炎患者皮膚樣本真菌群落主成分分析圖 3A：面部；3B：上肢；3C：背部

本研究中AD患者組和健康對照組各部位皮膚真菌物種分布以擔子菌門的馬拉色菌占主要地位，總體豐度約占50%，而美國健康人皮膚真菌多樣性研究結(jié)果顯示，相同部位馬拉色菌的相對豐度接近100%［9］，日本研究結(jié)果顯示，AD患者面部皮損馬拉色菌的相對豐度為68.7%，健康對照為79.2%［10］。國內(nèi)報道顯示，健康青年女性面部馬拉色菌的相對豐度為48.2%［11］，這提示人種和地區(qū)可能是影響皮膚馬拉色菌定植的兩個重要因素。除馬拉色菌屬外，AD 患者和健康對照面部、上肢、背部豐度相對較高的主要真菌屬還有念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬、枝孢屬、毛孢子菌屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬等，與國內(nèi)外研究結(jié)果類似［9?11］。本研究主成分分析顯示，AD 患者面部、上肢、背部皮損真菌群落未按病情嚴重程度聚類，提示其真菌群落組成與疾病嚴重程度無相關(guān)性。微生物導致AD發(fā)病多是作為變應原進入體內(nèi)引起相關(guān)免疫反應所致，其病情嚴重程度與進入體內(nèi)引起免疫反應微生物的種類和數(shù)量有關(guān)，由于AD患者多有皮膚屏障功能障礙［12］，可影響微生物進入體內(nèi)難易程度，而且皮損的性質(zhì)、局部免疫反應也可能對微生物入侵有影響，推測患者的病情嚴重程度不僅與皮膚表面微生物的定植情況有關(guān)，還可能受多種與微生物入侵相關(guān)因素的影響，因此從理論上來說AD 患者皮膚表面真菌群落分布不一定與疾病嚴重程度有相關(guān)性。不過考慮到本研究病例數(shù)太少，上述結(jié)論仍需進行更多病例的驗證。

本研究多樣性指數(shù)分析顯示，AD患者面部、上肢、背部皮損區(qū)真菌群落多樣性明顯高于健康對照相應區(qū)域。皮膚與其表面定居的大量微生物構(gòu)成皮膚微生態(tài)系統(tǒng)，微生物與微生物之間、微生物與宿主之間緊密聯(lián)系、相互影響，皮膚生理狀態(tài)的改變可引起微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化，推測AD患者真菌群落多樣性高于健康對照可能的原因包括：①AD 患者皮膚生理狀態(tài)的異常主要表現(xiàn)為屏障功能障礙，包括角質(zhì)層含水量、皮膚表面pH值、皮脂含量等異常［13?15］，既往研究表明這些指標的異常與真菌的異常定植或感染有關(guān)［16?18］；②AD患者皮膚聚絲蛋白（FLG）、兜甲蛋白（LOR）、內(nèi)披蛋白（IVL）等角化包膜成分表達減少甚至缺乏［19?20］，而FLG、LOR和IVL表達下降與真菌感染有關(guān)［21］；③AD患者皮膚抗菌肽表達下降，也有利于真菌的定植和感染［22］；④AD 患者普遍存在Th1/Th2細胞因子失衡，白細胞介素（IL）?4、IL?6、IL?13等水平明顯升高［23］，IL?4、IL?13 可抑制AD 患者皮膚角質(zhì)形成細胞FLG、LOR、IVL 及人β 防御素2 的表達［24?27］，IL?4、IL?6 可下調(diào)AD 患者角質(zhì)層細胞神經(jīng)酰胺的表達［28］，而神經(jīng)酰胺、人β 防御素2 參與皮膚的固有免疫，防御真菌等病原體的入侵［29?30］?？傊?，皮膚物理屏障功能障礙、皮膚表面抗菌肽表達異常、Th1/Th2 細胞因子失衡均有利于真菌的定植和感染，可能是導致AD 患者面部、上肢、背部皮損區(qū)真菌群落多樣性明顯高于健康對照相應區(qū)域的原因。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突