顏紅英，丁鵬非，肖遠(yuǎn)紅，賈莉

[1.重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，重慶 405400；2.重慶市梁平縣人民醫(yī)院 感染科，重慶 405200；3.云南省腫瘤醫(yī)院（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院）,云南 昆明 650118]

胃腸道腫瘤是國內(nèi)外常見的一類消化道惡性腫瘤，多數(shù)患者就診時已處于腫瘤進(jìn)展期或晚期，目前仍無確切有效的治療方案，患者存活率較低[1-3]。因此，研究一種新型、更為高效的診治方案尤為重要。GX1短肽是一種新型環(huán)狀小肽，在體內(nèi)外均具有腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向性，可作為一種新型腫瘤血管標(biāo)記配體，與其他抗腫瘤藥物結(jié)合，在抗腫瘤血管生成方面發(fā)揮重要作用[4-7]。本實驗通過合成酪氨酸修飾的血管靶向肽（Tyr-GX1）標(biāo)記結(jié)腸癌和胃癌裸鼠，分析其體內(nèi)顯影特征，為消化道腫瘤的診斷和體位放射治療的研究提供理論依據(jù)，進(jìn)而研究碘-131（131I）標(biāo)記短肽Tyr-GX1 作為腫瘤血管靶向診斷和治療的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細(xì)胞來源

32 只SPF 級健康雌性BALB/c 裸鼠，4 ～6 周，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號： SCXK（渝）2020-0001。人胃低分化腺癌細(xì)胞系SGC7901 與人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

Tyr-GX1（美國AAT Bioquest Inc 公司），碘-131化鈉溶液（成都欣科醫(yī)藥有限公司），RPMI l640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），SPECT 顯像儀（德國西門子公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)記方法采用Iodogen 碘標(biāo)法標(biāo)記短肽Tyr-GX1，在包被管中加入Tyr-GX1（10μg/μl）與碘-131化鈉溶液11.1 MBq，反應(yīng)體系體積40μl。通過紙層析法檢測標(biāo)記產(chǎn)物放射化學(xué)純度和標(biāo)記率。在室溫下，將131I 標(biāo)記的短肽Tyr-GX1 分別混合新鮮人血清、乙二胺四乙酸、生理鹽水、半胱氨酸，并分別在0、6、12 和24 h 檢測標(biāo)記率。

1.3.2 動物模型的復(fù)制將人胃低分化腺癌細(xì)胞系SGC7901 與人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO 置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在37℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞。胰酶消化，細(xì)胞重懸，離心處理，調(diào)整細(xì)胞密度，用于建立荷胃癌與結(jié)腸癌裸鼠模型。常規(guī)消毒，4%水合氯醛0.10 ml/kg 腹腔注射麻醉裸鼠，將細(xì)胞懸液注射于裸鼠右后肢背側(cè)。

1.3.3 荷瘤裸鼠體內(nèi)標(biāo)記肽生物學(xué)分布的檢測荷結(jié)腸癌、胃癌裸鼠各16 只（分別設(shè)置為結(jié)腸癌組和胃癌組），均尾靜脈注射131I 標(biāo)記的短肽Tyr-GX1（7.4 MBq×200μl），行SPECT 檢查。分批處死裸鼠，解剖并分別取肝、腎、心等不同臟器組織和血液樣本，稱重后檢測裸鼠體內(nèi)放射性計數(shù)，計算不同臟器的每克組織百分?jǐn)z取率（%ID/g）、腫瘤與非腫瘤組織放射性攝取比值（T/NT）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 的標(biāo)記率

紙層析法結(jié)果表明，131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 的標(biāo)記率較高，為（95.67±0.79）%；放射化學(xué)純度為（96.68±1.68）%。在室溫下分別與人血清、乙二胺四乙酸、生理鹽水、半胱氨酸混合24 h 后，其標(biāo)記率仍然維持在90%以上，說明131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 在體內(nèi)外有較好的穩(wěn)定性。見表1。

表1 不同時間點131I 標(biāo)記短肽分別與人血清、乙二胺四乙酸、生理鹽水、半胱氨酸混合后的標(biāo)記率 %

2.2 131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 在結(jié)腸癌和胃癌裸鼠體內(nèi)的顯影特征

結(jié)腸癌組和胃癌組均在尾靜脈注射131I 標(biāo)記的Tyr-GX1 后8 h 開始裸鼠右后肢背側(cè)荷瘤部位放射性濃聚較心血池本底升高，且隨著標(biāo)記時間延長而升高；結(jié)腸癌組16 h 時達(dá)峰值隨后稍有降低，荷瘤部位和心血池本底T/NT 均＞1；胃癌組荷瘤部位和心血池本底T/NT 隨著時間延長而升高。兩組8、12、16 和24 h131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 體內(nèi)成像的T/NT 比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果： ①不同時間點131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 體內(nèi)成像的T/NT 有差異（F=32.089，P=0.000）；②結(jié)腸癌組與胃癌組131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 體內(nèi)成像的T/NT 有差異（F=16.574，P=0.000）；③兩組131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 體內(nèi)成像的T/NT 變化趨勢有差異（F=7.675，P=0.003）。見表2。

表2 兩組不同時間點131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 體內(nèi)成像的T/NT 比較 （n =16，±s）

表2 兩組不同時間點131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 體內(nèi)成像的T/NT 比較 （n =16，±s）

注： ?與結(jié)腸癌組比較，P ＜0.05。

組別 8 h 12 h 16 h 24 h結(jié)腸癌組 1.09±0.31 1.19±0.28 1.33±0.33 1.30±0.24胃癌組 0.85±0.19? 0.80±0.22? 0.84±0.17? 1.18±0.30?

2.3 131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 在荷結(jié)腸癌裸鼠腫瘤血管的靶向性

荷結(jié)腸癌裸鼠心、肺、肝、腎、胃、肌肉、腫瘤、血液和甲狀腺組織在不同時間的Tyr-GX1 攝取率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；逐隨著時間延長，荷結(jié)腸癌裸鼠心、肺、肝、腎、胃、肌肉、腫瘤、血液和甲狀腺組織中Tyr-GX1攝取率逐漸降低（P＜0.05），其中肝、腎組織均具有較高的放射性。1、6、12 和24 h 不同組織的Tyr-GX1 攝取率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1、6、12 和24 h 腫瘤組織均高于心臟、甲狀腺、胃和肌肉組織（P＜0.05）。見表3。

表3 荷結(jié)腸癌裸鼠不同組織中各時間點的Tyr-GX1 攝取率 （%ID/g，±s）

表3 荷結(jié)腸癌裸鼠不同組織中各時間點的Tyr-GX1 攝取率 （%ID/g，±s）

注： ①與肝組織比較，P ＜0.05；②與腎組織比較，P ＜0.05。

組織 1 h 6 h 12 h 24 h F 值 P 值心1.14±0.08①② 0.47±0.08①② 0.30±0.07①② 0.20±0.06①② 80.703 0.000肺1.78±0.37①② 0.69±0.13①② 0.57±0.09①② 0.17±0.03①② 93.289 0.000 50.75±7.15② 25.86±2.85② 15.88±2.94 12.04±1.49 195.478 0.000腎33.84±3.84① 19.84±4.29① 14.85±2.04 10.83±1.84 132.774 0.000胃0.43±0.09①② 0.19±0.04①② 0.10±0.02①② 0.05±0.01①② 36.956 0.000肌肉 0.48±0.06①② 0.21±0.05①② 0.15±0.03①② 0.03±0.00①② 47.024 0.000腫瘤 1.45±0.12①② 0.84±0.16①② 0.75±0.04①② 0.39±0.07①② 57.816 0.000血液 4.03±0.19①② 1.02±0.09①② 0.92±0.13①② 0.13±0.03①② 98.368 0.000甲狀腺 1.13±0.28①② 0.48±0.10①② 0.30±0.08①② 0.12±0.02①② 76.245 0.000 F 值 146.963 102.540 76.853 93.271 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000肝

2.4 131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 在荷胃癌裸鼠腫瘤血管的靶向性

荷胃癌裸鼠心、肺、肝、腎、腸、肌肉、腫瘤、血液和甲狀腺組織在不同時間的Tyr-GX1 攝取率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；隨著時間延長，荷胃癌裸鼠心、肺、肝、腎、腸、肌肉、腫瘤、血液和甲狀腺組織中Tyr-GX1 攝取率逐漸降低（P＜0.05），其中肝、腎組織均具有較高的放射性。1、6、12 和24 h 不同組織的Tyr-GX1攝取率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1、6、12 和24 h 腫瘤組織均高于心臟、腸、甲狀腺和肌肉組織（P＜0.05）。見表4。

表4 荷胃癌裸鼠不同組織中各時間點的Tyr-GX1 攝取率 （%ID/g，±s）

表4 荷胃癌裸鼠不同組織中各時間點的Tyr-GX1 攝取率 （%ID/g，±s）

注： ①與肝組織比較，P ＜0.05；②與腎組織比較，P ＜0.05。

組織 1 h 6 h 12 h 24 h F 值 P 值心1.02±0.13①② 0.39±0.08①② 0.27±0.07①② 0.20±0.04①② 76.845 0.000 1.83±0.39①② 0.66±0.14①② 0.46±0.12①② 0.13±0.03①② 60.838 0.000肝58.79±7.25② 31.76±3.19② 20.84±3.74 11.73±2.15 202.541 0.000腎33.28±1.94① 22.17±4.85① 18.14±3.90 10.48±2.27 154.848 0.000腸0.56±10.11①② 0.38±0.07①② 0.21±0.05①② 0.05±0.01①② 29.740 0.000肌肉 0.41±0.08①② 0.16±0.05①② 0.14±0.03①② 0.04±0.01①② 35.878 0.000腫瘤 1.38±0.13①② 0.98±0.07①② 0.93±0.04①② 0.49±0.06①② 65.489 0.000血液 4.09±0.68①② 1.01±0.20①② 0.82±0.15①② 0.24±0.07①② 102.483 0.000甲狀腺 1.03±0.09①② 0.16±0.04①② 0.13±0.02①② 0.07±0.01①② 56.062 0.000 F 值 152.856 113.567 80.460 89.245 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000肺

3 討論

隨著“新生血管形成誘導(dǎo)腫瘤生長”學(xué)說的提出，有關(guān)阻滯腫瘤新生血管形成的相關(guān)治療方法的研究亦不斷提出[8]。近年來，將放射性核素標(biāo)記小分子多肽用于腫瘤疾病輔助顯影逐漸增多，如放射性核素標(biāo)記靶向性單抗、小肽進(jìn)行放療[9-10]。放射性靶向治療是指將放射性核素標(biāo)記配體作為示蹤劑，與高表達(dá)的分子、受體結(jié)合，使腫瘤部位顯影，同時根據(jù)其放射效應(yīng)起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[11-12]。同時，通過聯(lián)合腫瘤導(dǎo)向治療藥物，可起到提高療效、減輕機體其他部位藥物毒性及減少不良反應(yīng)的作用[13]。

本研究應(yīng)用131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 后，分別經(jīng)荷結(jié)腸癌、胃癌裸鼠尾靜脈注入體內(nèi)，對其24 h 內(nèi)顯影特征進(jìn)行觀察，分析標(biāo)記短肽Tyr-GX1 在消化道惡性腫瘤血管的靶向性等。結(jié)腸癌組和胃癌組均在Tyr-GX1 標(biāo)記后8 h 開始裸鼠右后肢背側(cè)荷瘤部位放射性濃聚較心血池本底明顯升高，且隨著標(biāo)記時間延長而升高；結(jié)腸癌組標(biāo)記至18 h 時達(dá)峰值隨后稍有降低，荷瘤部位與心血池本底T/NT 均＞1；胃癌組荷瘤部位和心血池本底T/NT 隨著時間延長而升高。結(jié)腸癌組與胃癌組T/NT 比值在不同時間、不同組間及變化趨勢上有差異。結(jié)果提示，131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 與結(jié)腸癌、胃癌具有較高的結(jié)合率。

本實驗中，結(jié)腸癌和胃癌示蹤劑在不同臟器組織均出現(xiàn)快速清除，其中肝、腎組織具有較高的放射性，腫瘤組織亦存在較高的放射性，高于甲狀腺和肌肉等；不同臟器組織早期放射性濃聚較高，并隨著時間延長均逐漸降低，提示該標(biāo)記肽具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性。采用131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 在荷結(jié)腸癌和胃癌裸鼠體內(nèi)均具有良好的的腫瘤組織血管靶向性。活體內(nèi)腫瘤血管的靶向性良好，生物分子進(jìn)入動物或人體內(nèi)之后不免與內(nèi)環(huán)境因素相關(guān)聯(lián)，如出現(xiàn)特異性的代謝特征、涉及被相關(guān)酶類分解的物質(zhì)等，并且可能存在與體內(nèi)部分分子結(jié)合而使原有生物學(xué)行為改變的情況[14-16]。所以，應(yīng)基于生物學(xué)穩(wěn)定性的角度研究良好的腫瘤血管導(dǎo)向性分子，才能保證該分子可從血液中迅速清除，從而減少與正常血管的結(jié)合，亦可提升與靶組織的結(jié)合率，最終可為腫瘤靶向治療提供可靠的依據(jù)。

綜上所述，131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 在荷結(jié)腸癌和胃癌裸鼠體內(nèi)腫瘤血管靶向性較好，與惡性腫瘤組織具有較高的結(jié)合率，而結(jié)腸癌與胃癌的放射性濃聚和達(dá)峰時間有所不同；131I 標(biāo)記短肽Tyr-GX1 可能在消化道惡性腫瘤血管靶向診斷和治療方面具有潛在價值，但仍需進(jìn)一步探究。