公少華，張 霞，李 娜，唐 波

（山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院,分子與納米探針教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,化學(xué)成像功能探針山東省高等學(xué)校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東師范大學(xué)分子與納米科學(xué)研究院,濟(jì)南250014）

pH是一項(xiàng)重要的生理參數(shù)，它涉及細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞增殖及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物學(xué)過(guò)程，并且多數(shù)蛋白功能的發(fā)揮也只有在一定的pH范圍內(nèi)才能進(jìn)行［1，2］. 因此，pH穩(wěn)態(tài)對(duì)于活細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程以及細(xì)胞功能的發(fā)揮具有重要作用. 真核細(xì)胞內(nèi)部pH的分布是不均一的，這主要是因?yàn)檎婧思?xì)胞內(nèi)部存在不同的亞細(xì)胞器區(qū)室，這些亞細(xì)胞器以膜與周邊細(xì)胞質(zhì)隔開(kāi)并發(fā)揮特定的功能，而這些特定功能的發(fā)揮需要依賴(lài)細(xì)胞器pH穩(wěn)態(tài)［3，4］. 例如，細(xì)胞核的pH范圍為7.2～7.4，高爾基體的pH范圍為6.4～6.8，內(nèi)體和溶酶體的pH范圍為4.7～6.5，線(xiàn)粒體的pH≈8.0［5～8］. 細(xì)胞器pH穩(wěn)態(tài)的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞器功能的紊亂，最終可能誘發(fā)相關(guān)疾?。?］. 例如，溶酶體pH的升高與溶酶體貯積癥有關(guān)，而免疫細(xì)胞成熟以及炎癥的發(fā)生則會(huì)伴隨溶酶體的酸化［10，11］. 線(xiàn)粒體pH 的紊亂與許多疾病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，如阿爾茲海默癥、雷氏癥候群、癌癥以及心血管疾病等［12，13］. 為了更好地闡明細(xì)胞器pH的變化在生理以及病理中的重要作用，發(fā)展有效的工具用于在亞細(xì)胞器水平上對(duì)pH的波動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)至關(guān)重要.

目前已有多種方法可用于pH 的測(cè)定，如H+滲透微電極法、核磁共振波譜法以及光學(xué)顯微鏡法等［14］. 但是這些技術(shù)通常需要使用高精度的儀器，并且樣品的處理過(guò)程比較復(fù)雜，從而限制了其在活細(xì)胞水平上進(jìn)行pH分析的應(yīng)用. 熒光光譜分析具有響應(yīng)速度快、信噪比高、非侵入及時(shí)空分辨率高的優(yōu)點(diǎn)［15，16］. 因此，熒光探針?lè)浅＿m合用于活細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)以及亞細(xì)胞器pH的檢測(cè). 可以用于亞細(xì)胞器pH波動(dòng)檢測(cè)的熒光探針類(lèi)型較多，有熒光蛋白變異體、小分子熒光探針及熒光納米探針等. 熒光蛋白變異體的熒光發(fā)射在一定范圍內(nèi)受pH影響，因此可以用于在亞細(xì)胞器水平上對(duì)pH進(jìn)行檢測(cè)［17，18］. 然而，這些熒光蛋白變異體需要進(jìn)行轉(zhuǎn)染表達(dá)，增加了操作的復(fù)雜性，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用［8］. 除熒光蛋白外，小分子熒光探針也可用于亞細(xì)胞器pH 波動(dòng)的檢測(cè). 近年來(lái)，靶向線(xiàn)粒體［18，19］、溶酶體［20，21］、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［22，23］以及高爾基體［24，25］進(jìn)行pH 檢測(cè)的分子熒光探針被相繼報(bào)道. 小分子熒光探針雖然能夠?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)，但其制備過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，容易從細(xì)胞中外排，存在水溶性問(wèn)題，有潛在的生物毒性［15，26～28］. 相對(duì)而言，熒光納米探針易于制備，靈敏度、特異性及靶向能力更好，并且可在納米顆粒上修飾多種熒光顏料分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種分子的同時(shí)檢測(cè)［29，30］.

對(duì)于利用熒光探針進(jìn)行pH成像的研究工作，2017年，Kim等［2］綜述了利用熒光探針對(duì)亞細(xì)胞器pH進(jìn)行成像的研究進(jìn)展，對(duì)小分子熒光探針的研究工作進(jìn)行了全面、詳細(xì)的介紹，但對(duì)于熒光納米探針的研究工作涉及較少. 2019年，Barati等［31］總結(jié)了利用不同種類(lèi)的納米傳感器對(duì)細(xì)胞pH進(jìn)行成像的研究工作. 本綜述總結(jié)了近年來(lái)利用熒光納米探針在細(xì)胞器水平上對(duì)pH 進(jìn)行定量檢測(cè)與成像的策略，并對(duì)該領(lǐng)域的前景以及所面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了展望.

1 細(xì)胞器pH檢測(cè)

1.1 線(xiàn)粒體pH檢測(cè)

線(xiàn)粒體是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器，在細(xì)胞能量代謝、氧化還原調(diào)節(jié)、信號(hào)通路、鈣離子穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用［32，33］. 其中，線(xiàn)粒體pH對(duì)于線(xiàn)粒體功能的發(fā)揮十分關(guān)鍵，只有維持線(xiàn)粒體pH在一定范圍內(nèi)，才能使線(xiàn)粒體正常發(fā)揮功能. 線(xiàn)粒體pH失衡會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能紊亂，并可能最終引發(fā)阿爾茲海默癥、心血管疾病及癌癥等疾?。?4，35］. 因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞線(xiàn)粒體pH的變化對(duì)于深入研究相關(guān)疾病的致病機(jī)理十分重要.

1.1.1 基于硅納米顆粒的熒光納米探針 基于非侵入、高分辨檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，熒光納米探針?lè)浅＿m用于亞細(xì)胞器pH 的檢測(cè). 熒光納米探針的制備需要以納米顆粒作為載體，其中，介孔二氧化硅納米顆粒（MNPs）具有良好的生物相容性、較高的負(fù)載能力，且其表面易修飾其它分子，適合作為熒光納米探針的載體［36］. 此外，熒光納米探針的設(shè)計(jì)還需要考慮檢測(cè)準(zhǔn)確性的問(wèn)題. 基于單發(fā)射熒光信號(hào)峰的熒光納米探針，其熒光信號(hào)容易受到探針濃度、激發(fā)條件、光漂白、環(huán)境和儀器條件等因素的影響. 相比之下，比率熒光探針可以產(chǎn)生2個(gè)不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，能夠有效減少外界因素的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)pH的熒光定量檢測(cè)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性［37，38］. 為了實(shí)現(xiàn)線(xiàn)粒體內(nèi)pH的精準(zhǔn)、定量測(cè)定，Tang等［39］發(fā)展了一種能夠靶向線(xiàn)粒體的比率熒光納米探針，他們選用介孔硅納米顆粒（MSNs）作為納米探針的載體，對(duì)其表面進(jìn)行羧基化，進(jìn)而修飾能對(duì)pH響應(yīng)的氨基熒光素（AF，發(fā)射峰：515 nm）和作為參比單元的溴化乙錠（EB，發(fā)射峰：595 nm），形成MSNs-EB-AF. 為了防止染料的泄露以及進(jìn)一步修飾線(xiàn)粒體靶向基團(tuán)，在MSNs-EB-AF表面繼續(xù)包覆一層氨基化的介孔二氧化硅. 然后，進(jìn)行線(xiàn)粒體靶向基團(tuán)（4-羧丁基）溴化三苯基磷（TPP）的修飾，最終形成能夠靶向線(xiàn)粒體進(jìn)行pH響應(yīng)的比率熒光納米探針. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以488 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，該比率熒光納米探針的熒光強(qiáng)度比在pH 5.0～8.3范圍內(nèi)與pH呈線(xiàn)性相關(guān)，在pH 4～9范圍內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)可逆變化. 在活細(xì)胞水平上，該探針能夠靶向線(xiàn)粒體. 在MCF-7細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)剝奪的條件下，利用該探針能夠檢測(cè)出線(xiàn)粒體pH的降低.

線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧的主要產(chǎn)生部位，這些活性氧分子可以分為超氧陰離子自由基（）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥基自由基（?OH）等不同種類(lèi). 線(xiàn)粒體活性氧的失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并且與許多疾病的發(fā)生密切關(guān)聯(lián). 線(xiàn)粒體活性氧的變化通常伴隨著線(xiàn)粒體pH的波動(dòng)，因此同時(shí)檢測(cè)活性氧和pH的變化非常重要［40～42］. 為了實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)粒體內(nèi)同時(shí)對(duì)H2O2和pH變化進(jìn)行實(shí)時(shí)原位檢測(cè)，Tang等［43］發(fā)展了一種熒光納米傳感器. 該納米傳感器以介孔硅納米顆粒（MSN）作為載體，在其孔道內(nèi)裝載能夠分別檢測(cè)H2O2和pH 的分子熒光探針Cy-O-SeH 和熒光素，再利用靜電相互作用將聚乙烯亞胺（PEI）包覆在MSN表面，用于封閉MSN的孔道，防止分子熒光探針泄露. 最后，利用酰胺鍵作用將三苯基膦修飾到納米探針的表面，用于線(xiàn)粒體靶向. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該熒光納米探針可以靶向MCF-7活細(xì)胞線(xiàn)粒體，并且能在一定范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)pH和H2O2波動(dòng)的檢測(cè)（pH：5.3～8.2，H2O2：0～150 μmol/L）. 小分子藥物二氯乙酸鹽能夠抑制線(xiàn)粒體丙酮酸脫氫酶激酶活性，將糖酵解代謝途徑轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟茄趸緩? 用二氯乙酸鹽對(duì)MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行處理后，利用該探針能夠?qū)2O2水平的上升和pH 的降低進(jìn)行實(shí)時(shí)可視化成像.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該納米探針能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞線(xiàn)粒體H2O2和pH變化的實(shí)時(shí)原位檢測(cè)（圖1）.

Fig.1 Schematic of the nanoprobe for imaging of mitochondrial pH and H2O2[43]

細(xì)胞自噬和凋亡是細(xì)胞自我毀滅的2種過(guò)程. 自噬是細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)下溶酶體降解相關(guān)物質(zhì)的過(guò)程，用于提供三磷酸腺苷，維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)與能量. 凋亡是一種編碼細(xì)胞死亡形式，用于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［45］. 這些生物學(xué)過(guò)程中往往伴隨著活性小分子的變化，研究其動(dòng)態(tài)變化對(duì)于闡釋疾病的活性分子調(diào)節(jié)機(jī)制十分重要［46］. 為了檢測(cè)細(xì)胞自噬和凋亡這2種生物學(xué)過(guò)程中pH和的動(dòng)態(tài)變化，Tang等［47］設(shè)計(jì)了一種雙比率熒光納米探針，該納米探針以摻雜有羅丹明B的MNPs作為參比內(nèi)核，在其外層繼續(xù)包覆一層二氧化硅，外層的二氧化硅層中摻雜有能夠分別檢測(cè)pH 和的Tpy-Cy 和DBZTC 分子. 為了防止熒光分子泄露，在二氧化硅的外層包覆殼聚糖，之后，通過(guò)共價(jià)鍵連接的方式修飾上三苯基膦，用于靶向細(xì)胞線(xiàn)粒體. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該探針的相對(duì)熒光強(qiáng)度在0～1.7 μmol/L 范圍內(nèi)與濃度呈現(xiàn)線(xiàn)性變化，在pH 5.5～8.5范圍內(nèi)與pH呈現(xiàn)線(xiàn)性變化. 該研究通過(guò)饑餓狀態(tài)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬過(guò)程，通過(guò)L-丁硫氨酸亞砜亞胺（BSO）誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞發(fā)生凋亡過(guò)程，利用該探針進(jìn)行檢測(cè). 結(jié)果顯示，在自噬過(guò)程早期pH會(huì)下降，的水平幾乎不變；而在晚期pH會(huì)持續(xù)下降，的水平會(huì)升高. 對(duì)于凋亡過(guò)程而言，凋亡過(guò)程早期pH會(huì)降低，的水平升高，晚期pH幾乎保持不變，而的水平會(huì)持續(xù)升高（圖2）.

Fig.2 Schematic of the nanosensor formation and the structures of RhB,DBZTC and Tpy?Cy[47]

1.1.2 基于DNA四面體的熒光納米探針 線(xiàn)粒體對(duì)于維持鈣離子穩(wěn)態(tài)也具有重要作用，此功能的發(fā)揮同樣也需要維持相應(yīng)的pH值［48］. 在腦缺血疾病模型中，鈣離子穩(wěn)態(tài)被打破，其水平的變化與pH的變化相關(guān)［49］. 因此，對(duì)這2 種活性小分子進(jìn)行實(shí)時(shí)原位成像有助于理解其在生理病理過(guò)程中的作用.DNA四面體的形狀和尺寸可以精準(zhǔn)控制，生物相容性好，有多個(gè)位點(diǎn)可進(jìn)行分子修飾，可用于多種活性分子的檢測(cè)，并且被修飾分子的間隔距離可控，能夠有效避免多種響應(yīng)分子同時(shí)修飾到納米顆粒上時(shí)熒光共振能力轉(zhuǎn)移（FRET）產(chǎn)生的影響［50］. 為了解決神經(jīng)元細(xì)胞線(xiàn)粒體中鈣離子和pH變化的實(shí)時(shí)原位檢測(cè)問(wèn)題，Tian 等［51］在DNA 四面體納米探針的4 個(gè)端點(diǎn)分別修飾三苯基膦、異硫氰酸熒光素（FITC）、AF660 以及鈣離子探針（CD＠CaL）. 三苯基膦用于將該納米探針靶向到線(xiàn)粒體；FITC 分子親水、穩(wěn)定且無(wú)毒，不受細(xì)胞器內(nèi)酶的干擾，可以用于pH的檢測(cè)［52］；AF660作為參比熒光分子；鈣離子熒光探針由合成的鈣離子配體（CaL）和量子點(diǎn)（CDs）組成，可用于鈣離子的檢測(cè)（圖3）. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該探針對(duì)鈣離子的檢出限為0.3 μmol/L，熒光強(qiáng)度比在1～390 μmol/L范圍內(nèi)與鈣離子濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，在pH 5.51～8.02范圍內(nèi)與pH呈現(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系，證明該探針能夠?qū)崿F(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞線(xiàn)粒體pH以及鈣離子的檢測(cè). 作者利用該四面體比率熒光納米探針研究了在誘導(dǎo)下神經(jīng)元細(xì)胞死亡的信號(hào)通路.結(jié)果表明，的刺激能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)暫時(shí)性的酸化，進(jìn)而激活線(xiàn)粒體膜ASIC1a通道，導(dǎo)致線(xiàn)粒體堿化以及鈣離子過(guò)載. Aβ的聚集會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)pH的降低以及鈣離子的爆發(fā)式增多，進(jìn)一步通過(guò)ASIC1a導(dǎo)致線(xiàn)粒體酸化以及鈣離子過(guò)載.

Fig.3 Schematic illustration of the working principle of the developed DNA nanoprobe for Ca2+and pH sensing[51]

1.1.3 基于聚合物的熒光納米探針 聚合物納米探針具有單顆粒亮度強(qiáng)、光穩(wěn)定性好及毒性低的優(yōu)點(diǎn)［53，54］. 基于聚合物納米探針的優(yōu)勢(shì)，Gao等［32］首次利用半導(dǎo)體聚合物點(diǎn)作為載體，發(fā)展了一種比率熒光納米傳感器，對(duì)活細(xì)胞線(xiàn)粒體的pH進(jìn)行了檢測(cè)和成像. 在該策略中，三苯基膦被修飾到聚乙烯醇壬基苯基酯上形成TTO-CO-520，然后TTO-CO-520、聚（9，9-二-N-辛基芴基-2，7-二基）（PFO）、聚（9，9-二辛基芴）-（4，7-二-2-噻吩基-2，1，3-苯并噻二唑）（PF-DBT5）和聚（苯乙烯-順丁烯二酸酐）（PSMA）通過(guò)共沉淀的方法形成熒光聚合物點(diǎn). 該聚合物點(diǎn)含有羧基與線(xiàn)粒體靶向基團(tuán)，可用于進(jìn)一步修飾能夠響應(yīng)pH的非熒光指示劑（剛果紅，CR）. 在該比率熒光納米探針中，PFO與PF-DBT5作為熒光能量供體，CR作為能量受體，當(dāng)pH 發(fā)生變化時(shí)，CR 與PFO，CR 與PF-DBT5 的FRET 效率會(huì)發(fā)生改變. 利用380 nm的光對(duì)該探針進(jìn)行激發(fā)，能夠獲得2 個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)（PFO：442 nm，PF-DBT5：616 nm），隨著pH 的降低（8.96～2.57），PFO的熒光強(qiáng)度不會(huì)發(fā)生明顯變化，PF-DBT5的熒光強(qiáng)度會(huì)降低，從而實(shí)現(xiàn)比率熒光檢測(cè). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該探針的相對(duì)熒光強(qiáng)度比在pH 2.57～8.96范圍內(nèi)與pH呈線(xiàn)性相關(guān)；在pH 2.5～9范圍內(nèi)可實(shí)現(xiàn)可逆變化. 該探針能夠靶向Raw 264.7細(xì)胞線(xiàn)粒體，并對(duì)線(xiàn)粒體pH進(jìn)行定量檢測(cè)（圖4）.

Fig.4 Schematic illustration of the mitochondria?targeted Pdots for ratiometric detection of pH in mitochondria[32]

為了解決熒光納米探針的毒性問(wèn)題，Wang等［5］發(fā)展了一種以低毒性的β環(huán)糊精聚合物為骨架的比率熒光納米探針，用于成像活細(xì)胞線(xiàn)粒體pH變化. 2種親酯性的染料——金剛烷標(biāo)記的熒光素和金剛烷標(biāo)記的羅丹明分別用作pH檢測(cè)單元和參比單元，金剛烷標(biāo)記的三苯基膦用作線(xiàn)粒體靶向基團(tuán). 基于主客體作用，β環(huán)糊精聚合物能夠與親酯性染料以及金剛烷標(biāo)記的三苯基膦通過(guò)自組裝形成比率熒光納米顆粒. 該探針的相對(duì)熒光強(qiáng)度比在pH 4.0～9.0 之間能夠呈現(xiàn)可逆變化. 利用該探針能夠靶向HeLa細(xì)胞線(xiàn)粒體，對(duì)線(xiàn)粒體內(nèi)pH的變化進(jìn)行定量檢測(cè).

1.1.4 基于量子點(diǎn)的熒光納米探針 利用光動(dòng)力學(xué)療法（PDT）治療癌癥，主要依賴(lài)于光敏劑產(chǎn)生活性氧對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷［55］. 其中，過(guò)量的活性氧會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體過(guò)氧化，進(jìn)而導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能紊亂、凋亡，是治療癌癥的一種主要機(jī)制. 而細(xì)胞凋亡與線(xiàn)粒體pH 的變化密切相關(guān)，實(shí)時(shí)檢測(cè)pH 的變化能夠?qū)DT的治療效果進(jìn)行更好的評(píng)估［56］. 碳量子點(diǎn)作為一種熒光納米材料，具有良好的光穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性及生物相容性，并且易于進(jìn)行修飾［57，58］. 基于自然生物質(zhì)制備的碳量子點(diǎn)被稱(chēng)為生物質(zhì)量子點(diǎn)（BQDs）. 這種生物質(zhì)量子點(diǎn)成本低、易于大規(guī)模制備且環(huán)境友好［59］，可以用于生物傳感和成像. 為了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PDT過(guò)程中pH的變化，Liu等［60］設(shè)計(jì)了一種基于BQDs 的診療一體化比率熒光納米探針. 該探針既可以用于靶向癌細(xì)胞線(xiàn)粒體進(jìn)行PDT，又能夠?qū)DT過(guò)程中線(xiàn)粒體pH的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè). 其中，BQDs以碳量子點(diǎn)為基礎(chǔ)，利用含葉酸的桂花葉制備，以單波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)可獲得雙波長(zhǎng)發(fā)射. 在BQDs上修飾聚氧乙烯二胺及葉酸分子，形成比率熒光納米探針BQD-FAs. 葉酸分子能夠使探針靶向癌細(xì)胞，探針表面的正電荷能夠促進(jìn)探針靶向線(xiàn)粒體. 由于探針表面富含葉綠素，所以在近紅外光的照射下能夠產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧，用于對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷. 此外，在pH 3～8 范圍內(nèi)，該探針的熒光強(qiáng)度比（F490/F650）與pH值呈線(xiàn)性關(guān)系，可用于線(xiàn)粒體pH變化的檢測(cè)（圖5）.

1.2 溶酶體pH檢測(cè)

溶酶體是一種細(xì)胞內(nèi)的酸性細(xì)胞器，內(nèi)含水解酶，能夠降解大分子和相關(guān)的細(xì)胞組分［61］. 溶酶體參與質(zhì)膜修復(fù)、蛋白降解、病原體清除以及細(xì)胞內(nèi)吞與自噬等過(guò)程，對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用［62］. 這些功能的發(fā)揮都依賴(lài)于溶酶體pH穩(wěn)態(tài). 溶酶體pH的異常會(huì)導(dǎo)致溶酶體功能缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生［63］. 因此，對(duì)溶酶體pH進(jìn)行檢測(cè)十分重要.

Fig.5 Schematic illustration of the preparation and application of BQD?FAs[60]

1.2.1 基于硅納米顆粒的熒光納米探針 pH響應(yīng)的熒光納米探針可以通過(guò)2種方式聚集到細(xì)胞的溶酶體部位. 一種方式是在納米顆粒表面修飾溶酶體靶向基團(tuán)，使納米顆粒能夠主動(dòng)靶向到溶酶體的位置；另一種方式是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用，使納米顆粒能夠最終自動(dòng)聚集到溶酶體的位置. Tang等［39］報(bào)道了一種能夠靶向溶酶體進(jìn)行pH檢測(cè)的比率熒光納米探針. 該探針由MNPs修飾參比分子EB、pH響應(yīng)分子AF以及溶酶體靶向基團(tuán)3-（4-嗎啉酰基）鹽酸丙酸（MPP）而成，可定位于MCF-7細(xì)胞溶酶體，結(jié)合其它納米顆粒，利用單一激發(fā)波長(zhǎng)（488 nm）進(jìn)行激發(fā)，能對(duì)溶酶體、線(xiàn)粒體以及細(xì)胞質(zhì)pH的變化進(jìn)行檢測(cè)（圖6）. 在另一種策略中，Han等［64］利用MNPs作為載體，修飾對(duì)pH不敏感的分子羅丹明內(nèi)酰胺以及pH敏感分子FITC，制得pH響應(yīng)探針. 該探針的pH響應(yīng)范圍為3.5～6，并且能夠通過(guò)內(nèi)吞的方式聚集到L929 細(xì)胞溶酶體，對(duì)pH 進(jìn)行檢測(cè). Bossi等［65］發(fā)展了一種具有良好生物相容性的pH 檢測(cè)熒光納米探針，螺羅丹明酰胺作為pH 響應(yīng)分子被修飾到具有核殼結(jié)構(gòu)的硅納米顆粒上，使納米探針能夠快速、可逆、高靈敏且高選擇性地進(jìn)行pH檢測(cè). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該熒光納米探針能夠定位于溶酶體，實(shí)現(xiàn)對(duì)pH的檢測(cè).

為了解決對(duì)溶酶體內(nèi)pH 的實(shí)時(shí)、長(zhǎng)時(shí)間成像問(wèn)題，He等［66］發(fā)展了一種基于熒光硅納米顆粒的pH 納米探針. 在該探針中，熒光硅納米顆粒上偶聯(lián)有pH敏感的多巴胺分子以及pH不敏感的異硫氰酸羅丹明B 染料（RBITC）分子. 該納米傳感器與溶酶體染料的皮爾森相關(guān)系數(shù)高（0.9），能夠在較寬的pH范圍內(nèi)（4～10）對(duì)pH的波動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，具有良好的光穩(wěn)定性，在長(zhǎng)時(shí)間的紫外光照射下，不會(huì)發(fā)生明顯的光強(qiáng)度減弱，適用于對(duì)溶酶體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間pH波動(dòng)的檢測(cè)（圖7）. 為了解決熒光探針光穩(wěn)定性的問(wèn)題，He等［67］利用免標(biāo)記的熒光硅量子點(diǎn)作為載體，在其上共價(jià)連接AS1411適配體. AS1411是一種富含鳥(niǎo)嘌呤的DNA適配體，能夠與癌細(xì)胞上過(guò)表達(dá)的核仁蛋白特異性結(jié)合. AS1411的末端修飾有pH敏感單元FAM，熒光硅納米顆粒能夠作為熒光參比單元. 該探針?biāo)苄院凸夥€(wěn)定性良好，熒光響應(yīng)強(qiáng)度高，能夠特異性地靶向MCF-7癌細(xì)胞并定位于溶酶體，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，可對(duì)溶酶體的pH進(jìn)行成像和定量分析.

溶酶體pH是反映溶酶體活性的一個(gè)重要參數(shù)，其變化也會(huì)受到其它因素的影響. 有研究［20］顯示，局部的溫度升高會(huì)上調(diào)溶酶體pH，所以測(cè)定pH時(shí)對(duì)溫度的影響進(jìn)行補(bǔ)償非常重要. 細(xì)胞內(nèi)的熱量分布是不均一的，不同位置的溫度相差約1 ℃，所以同時(shí)對(duì)pH和溫度進(jìn)行精準(zhǔn)成像非常重要. Wang等［63］基于硅納米顆粒發(fā)展了一種同時(shí)對(duì)pH和溫度進(jìn)行測(cè)定的納米探針. 在該探針中，參比銪復(fù)合物和對(duì)溫度敏感的探針羅丹明B被共價(jià)固定到硅納米顆粒的內(nèi)部，表面進(jìn)行氨基修飾，氨基的修飾致使硅納米顆粒表面帶正電，能夠促進(jìn)探針被細(xì)胞攝取，并使探針最終聚集于溶酶體. 此外，氨基可進(jìn)一步用于pH敏感探針熒光素的修飾. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該納米探針可在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)對(duì)pH進(jìn)行響應(yīng)，在20～60 ℃范圍內(nèi)對(duì)溫度進(jìn)行響應(yīng). 該納米探針能夠被HeLa細(xì)胞攝取并主要定位于溶酶體，適用于監(jiān)測(cè)溶酶體內(nèi)溫度和pH的動(dòng)態(tài)變化.

Fig.6 Illustration of the ratiometric fluorescence nano?sensors for imaging of subcellular pH[39]

Fig.7 Design of dual?modified SiNPs(DMSiNPs)?based pH nanoprobe[66]

1.2.2 基于金納米顆粒的熒光納米探針 為了解決溶酶體pH 精準(zhǔn)測(cè)定的問(wèn)題，Russell 等［9］發(fā)展了一種基于金納米顆粒的比率熒光納米探針. 在該探針中，蒽衍生物配體基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）原理能夠?qū)H 進(jìn)行響應(yīng)，羅丹明衍生物配體則作為熒光參比分子. 為了防止金納米顆粒對(duì)2種分子熒光的猝滅，分別對(duì)這2種分子進(jìn)行烷基鏈的修飾，使熒光分子與金納米顆粒之間能夠保持一定的距離. 最后，修飾有烷基鏈的2種分子通過(guò)金硫鍵連接到金納米顆粒的表面，形成最終的比率熒光pH 納米探針. 通過(guò)用364 nm 波長(zhǎng)光激發(fā)，能夠獲得2種熒光分子的熒光發(fā)射峰. 該納米探針的熒光強(qiáng)度比（I421/I580） 在pH 3.73～8.11 范圍內(nèi)隨pH而變化. 該納米探針能夠被中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞攝取并最終聚集在溶酶體內(nèi)，可以用于溶酶體pH的定量測(cè)定（圖8）.

1.2.3 基于聚合物的熒光納米探針 為了解決聚合物納米探針因聚集而導(dǎo)致的熒光猝滅問(wèn)題，Smet 等［68］發(fā)展了一種基于超支化聚合物的聚集誘導(dǎo)發(fā)光的熒光納米探針. 基于1，8-萘二甲酰亞胺染料分子具有的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)，將2種基于1，8-萘二甲酰亞胺的染料分子修飾到超支化聚合物納米顆粒上，其中一種能夠?qū)H進(jìn)行響應(yīng)，另外一種作為參比單元，制成比率熒光納米探針對(duì)pH進(jìn)行檢測(cè). 在水相中，該納米探針能夠發(fā)出熒光，并且能夠在pH 4.5～8.4范圍內(nèi)響應(yīng)pH的變化. 共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該探針可定位于HeLa細(xì)胞溶酶體，對(duì)溶酶體的pH進(jìn)行測(cè)定. 為了拓寬納米探針對(duì)pH的檢測(cè)范圍，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)低pH條件下的比率測(cè)定，S?ndergaard等［69］將3種pH敏感的熒光團(tuán)二氟俄勒岡州綠、俄勒岡州綠、熒光素以及pH不敏感熒光團(tuán)Alexa 568共價(jià)修飾到水凝膠中，構(gòu)建了比率pH 熒光納米探針. 多熒光團(tuán)的使用拓寬了熒光納米探針的pH 檢測(cè)范圍，使熒光探針能夠在pH 1.4～7.0范圍內(nèi)響應(yīng)pH的變化，從而用于溶酶體內(nèi)pH的檢測(cè). Almdal等［70］發(fā)展了一種基于聚丙烯酰胺聚合物的比率熒光納米探針，以羅丹明作為參比單元，俄勒岡綠作為pH敏感單元，利用反相微乳液技術(shù)形成聚合物納米探針. 該探針能夠在pH 4.1～5.7范圍內(nèi)對(duì)pH進(jìn)行響應(yīng)，并且可以通過(guò)內(nèi)吞途徑到達(dá)溶酶體，對(duì)溶酶體的pH進(jìn)行檢測(cè). 為了更好地實(shí)現(xiàn)溶酶體內(nèi)pH的比率熒光成像，Jiang等［71］通過(guò)微乳液聚合及表面修飾法構(gòu)建了一種基于FRET 的比率熒光聚合物納米探針（RFPNS）. 在該探針中，4-乙氧基-9-烯丙基-1，8-萘二甲酰亞胺（EANI）作為供體，F(xiàn)ITC 作為受體，同時(shí)也作為pH 響應(yīng)單元. 當(dāng)pH升高時(shí)，F(xiàn)ITC能轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N環(huán)打開(kāi)的狀態(tài)，此時(shí)，EANI能夠與開(kāi)環(huán)狀態(tài)的FITC發(fā)生FRET，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)pH的比率熒光識(shí)別. 該納米探針?biāo)苄粤己?，能夠定位在HeLa細(xì)胞的溶酶體內(nèi)，可視化成像溶酶體pH的變化.

1.2.4 基于量子點(diǎn)的熒光納米探針 量子點(diǎn)作為一種熒光納米材料，其水溶性與光穩(wěn)定性良好，本身可以用作熒光納米探針的載體，并且由于其自身的熒光可以作為熒光納米探針的參比，不需要利用其它的熒光分子作為參比單元. 基于量子點(diǎn)特有的優(yōu)勢(shì)，Wu等［72］將pH敏感單元FITC直接連接到碳量子點(diǎn)上，碳量子點(diǎn)與FITC分子構(gòu)成FRET系統(tǒng)，從而構(gòu)建了比率熒光納米探針. 當(dāng)pH降低時(shí)，413 nm處碳量子點(diǎn)的熒光發(fā)射強(qiáng)度會(huì)下降，531 nm 處FITC 的熒光發(fā)射強(qiáng)度會(huì)升高. 二者熒光強(qiáng)度的比值（I531/I413）隨著pH的變化而變化. 該探針能夠通過(guò)內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞并且聚集在溶酶體，可以對(duì)溶酶體pH進(jìn)行檢測(cè).

為了解決量子點(diǎn)探針靶向溶酶體的問(wèn)題，Wang等［73］合成了一種氨基功能化的碳量子點(diǎn)（ACDs）用于溶酶體pH的檢測(cè). 該量子點(diǎn)由檸檬酸和尿素制備而成，納米顆粒表面羧基的含量高于氨基的含量，能夠響應(yīng)4.0～5.4范圍內(nèi)pH的變化. 該探針無(wú)需靶向基團(tuán)的修飾，能夠通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞并最終定位于溶酶體，與溶酶體染料的皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.95. 利用該量子點(diǎn)熒光納米探針，能夠?qū)崿F(xiàn)MCF-7細(xì)胞內(nèi)溶酶體pH成像，在氯喹的刺激下可檢測(cè)出溶酶體pH的升高. Xie 等［74］制備了一種能夠靶向溶酶體的碳量子點(diǎn)熒光納米探針，適用于在活細(xì)胞和活體水平上進(jìn)行pH的檢測(cè). 該量子點(diǎn)由對(duì)苯二胺和硫脲制備，受到pH的影響時(shí)，量子點(diǎn)表面的電荷會(huì)發(fā)生變化，從而引起熒光強(qiáng)度的變化. 隨著pH的升高，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱，能夠在pH 4～8的范圍內(nèi)響應(yīng)pH的變化. 該探針可通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入HeLa 細(xì)胞的溶酶體內(nèi)對(duì)pH的變化進(jìn)行成像. 此外，作者以LPS誘導(dǎo)炎癥模型，利用該探針在活體水平上對(duì)炎癥過(guò)程中pH降低的變化進(jìn)行了檢測(cè).

1.2.5 基于上轉(zhuǎn)化納米顆粒（UCNPs）的熒光納米探針 UCNPs 是一類(lèi)摻雜鑭系離子的獨(dú)特的納米材料，能夠?qū)? 個(gè)或者更多低能量的光子轉(zhuǎn)變成為1 個(gè)高能量的光子［75］. UCNPs 可以通過(guò)近紅外光激發(fā)來(lái)獲取可見(jiàn)光以及紫外光發(fā)射. 近紅外光與可見(jiàn)光及紫外光相比，組織穿透深度更深，對(duì)于組織損傷小，可有效避免檢測(cè)過(guò)程中光漂白以及背景熒光干擾等問(wèn)題，從而提高熒光檢測(cè)的準(zhǔn)確性［76］. 基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒特有的優(yōu)勢(shì)，Sch?ferling 等［77］發(fā)展了一種比率熒光納米探針，pH 敏感分子pHrodo?紅染料分子被共價(jià)修飾到包覆有硅殼層的上轉(zhuǎn)化納米顆粒表面用于檢測(cè)pH的變化. 該納米探針以980 nm的近紅外光作為激發(fā)光，激發(fā)UCNPs發(fā)射550 nm波長(zhǎng)的熒光，該熒光可以進(jìn)一步用于pHrodo?紅染料分子的激發(fā)，構(gòu)成上轉(zhuǎn)化共振能量轉(zhuǎn)移（UC-RET），形成pHrodo?紅染料分子590 nm處的熒光發(fā)射峰.由于受體染料分子少，所以UCNPs發(fā)出熒光的強(qiáng)度基本不會(huì)變化，因此上轉(zhuǎn)化納米顆粒本身可以作為參比單元. 該探針的熒光強(qiáng)度比在pH 3～6.7范圍內(nèi)與pH變化呈線(xiàn)性關(guān)系，能夠用于測(cè)定溶酶體pH.基于類(lèi)似原理，Kong等［78］將pH敏感分子FITC修飾到上轉(zhuǎn)化納米顆粒表面，構(gòu)建了比率熒光探針用于溶酶體pH的檢測(cè). 不同的是，該UCNPs在980 nm的近紅外光激發(fā)下，可獲得475和645 nm 2個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)的發(fā)射峰，其中475 nm 的發(fā)射光可用于激發(fā)FITC 分子，645 nm 的光可作為參比熒光.I475/645在pH 3～7范圍內(nèi)與pH值呈線(xiàn)性相關(guān). Li等［79］報(bào)道了一種基于雙光子激發(fā)的比率熒光納米探針. 該探針包含對(duì)pH不敏感的UCNP核，其在810 nm具有發(fā)射峰，可作為熒光參比單元. UCNP核上包覆介孔二氧化硅殼，在殼層的孔道中裝載pH敏感的雙光子染料分子反式-4-［對(duì)-（N，N-二乙氨基）苯乙烯基］-碘化甲基吡啶鎓（DMI），然后在二氧化硅殼層上進(jìn)一步修飾β-環(huán)糊精，用于提高納米探針的親水性和生物相容性. 利用920 nm波長(zhǎng)光進(jìn)行激發(fā)，可獲得610 nm處DMI的熒光發(fā)射峰及810 nm處上轉(zhuǎn)化納米顆粒的發(fā)射峰. 當(dāng)pH升高時(shí)，DMI的熒光強(qiáng)度會(huì)顯著上升，而上轉(zhuǎn)換納米顆粒的熒光幾乎不變. 熒光強(qiáng)度比例I610/I810在pH 4.0～6.5范圍內(nèi)隨著pH的升高而增大. 該納米顆粒能夠選擇性地聚集在溶酶體內(nèi)，對(duì)藥物刺激下溶酶體pH的變化進(jìn)行測(cè)定（圖9）.

Fig.9 Schematic of sensing mechanism of the TPE ratiometric fluorescent nanoprobe for intracellular pH measurement[79]

1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH檢測(cè)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中一類(lèi)重要的細(xì)胞器，在鈣離子穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)合成及折疊、膜的成熟和蛋白的分泌方面具有重要作用. 當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能受到外界條件干擾時(shí)，會(huì)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力會(huì)誘導(dǎo)自噬過(guò)程的發(fā)生，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的酸化，這種酸化的過(guò)程與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)的疾病的發(fā)生有密切關(guān)系［80～82］. 因此，實(shí)時(shí)成像內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的pH變化對(duì)于探究相關(guān)疾病的病理十分重要.

為了實(shí)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH 的檢測(cè)，Wang 等［73］利用檸檬酸和尿素合成了一種表面帶有氨基的碳量子點(diǎn)（ACDs），然后進(jìn)一步修飾月桂胺，獲得月桂胺修飾的碳量子點(diǎn)（LCDs）. 該LCDs 能夠響應(yīng)6.2～7.2 范圍內(nèi)pH的變化，通過(guò)脂筏內(nèi)吞作用和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入MCF-7細(xì)胞，聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位染料的皮爾森相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.92. 在抗炎藥物地塞米松的刺激下，該探針可實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH降低的檢測(cè).

2 總結(jié)與展望

本文綜述了近年來(lái)利用不同類(lèi)型的熒光納米探針對(duì)細(xì)胞器內(nèi)pH 進(jìn)行實(shí)時(shí)成像與檢測(cè)的研究進(jìn)展. 這些熒光納米顆粒具有自身特有的優(yōu)勢(shì)：介孔二氧化硅納米顆粒易于合成、修飾且成本低；聚合物納米顆粒水溶性良好且毒性低；量子點(diǎn)具有自發(fā)光性質(zhì)與良好的光穩(wěn)定性；上轉(zhuǎn)化納米顆?？梢岳媒t外光進(jìn)行激發(fā)，減少檢測(cè)背景干擾. 總體而言，熒光納米顆粒易于合成、光穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)且受環(huán)境的干擾小，通過(guò)在熒光納米顆粒上修飾多種響應(yīng)分子，可用于實(shí)時(shí)、原位研究pH與其它活性分子之間變化的關(guān)系. 這對(duì)于研究由細(xì)胞器pH變化引起的相關(guān)疾病的致病機(jī)理具有重要意義. 但是，對(duì)于細(xì)胞器內(nèi)pH 的檢測(cè)還面臨如下問(wèn)題與挑戰(zhàn)：（1）納米顆粒易于合成、修飾，但經(jīng)過(guò)多步修飾后，納米顆粒往往容易發(fā)生聚集，其批次間合成的質(zhì)量控制問(wèn)題需要進(jìn)一步解決.（2）熒光納米探針在細(xì)胞內(nèi)的不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)的分布不均，從而對(duì)pH的測(cè)定產(chǎn)生影響.（3）熒光染料分子修飾到納米顆粒上，染料分子聚集所產(chǎn)生的猝滅效應(yīng)會(huì)影響pH檢測(cè)的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步消除基于不同納米材料熒光納米探針的熒光猝滅效應(yīng)，對(duì)于提高pH檢測(cè)的準(zhǔn)確性具有重要意義.（4）特定細(xì)胞器內(nèi)pH的變化通常會(huì)與其它多種活性分子的變化相關(guān)聯(lián)，需要進(jìn)一步發(fā)展能夠同時(shí)對(duì)pH和其它多種活性分子進(jìn)行成像的熒光納米探針，用于研究疾病發(fā)生過(guò)程中各種活性分子的實(shí)時(shí)變化.（5）活細(xì)胞細(xì)胞器pH的波動(dòng)范圍較小，需要進(jìn)一步發(fā)展高靈敏的pH熒光納米探針，對(duì)于細(xì)胞器內(nèi)微小pH的變化進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè).（6）目前的細(xì)胞器pH熒光納米探針主要利用細(xì)胞器靶向基團(tuán)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器的靶向，檢測(cè)的細(xì)胞器多集中于線(xiàn)粒體和溶酶體，缺少對(duì)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及細(xì)胞核等細(xì)胞器pH檢測(cè)的熒光納米探針，進(jìn)一步發(fā)展靶向這些細(xì)胞器的熒光納米探針進(jìn)行pH檢測(cè)，可為研究細(xì)胞器內(nèi)的pH與相關(guān)疾病的關(guān)系提供合適的工具.