趙洪濤，孫 巖，郭一暢，蔡文生，邵學(xué)廣

（南開(kāi)大學(xué)化學(xué)學(xué)院分析科學(xué)研究中心,天津市生物傳感與分子識(shí)別重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300071）

近年來(lái)關(guān)于超冷水、界面水和限域水等的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究備受關(guān)注. 在超冷條件下，水的四面體結(jié)構(gòu)會(huì)迅速增加，導(dǎo)致熱力學(xué)響應(yīng)的變化［1］. 也有研究發(fā)現(xiàn)，在超冷條件下水會(huì)發(fā)生相變，兩相具有相似的氫鍵結(jié)構(gòu)但密度不同［2］. 抗凍劑是一類加入到其它液體（通常為水）中以降低其冰點(diǎn)、提高抗凍能力的物質(zhì). 由于抗凍劑能降低水的冰點(diǎn)，在生物抗凍、冷凍保存等方面具有廣泛的應(yīng)用. 因此抗凍劑存在下低溫水的結(jié)構(gòu)及冰點(diǎn)降低的機(jī)理研究引起了相關(guān)學(xué)者的關(guān)注. 如Oh等［3］利用紅外光譜研究了二甲基亞砜（DMSO）降低水冰點(diǎn)的機(jī)理，結(jié)果表明，DMSO與水在共晶點(diǎn)附近相互作用最強(qiáng)，這可能是導(dǎo)致凝固點(diǎn)降低的原因；Gonda等［4］研究了蔗糖和海藻糖對(duì)冰晶生長(zhǎng)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)蔗糖和海藻糖會(huì)與水通過(guò)氫鍵作用形成團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，從而抑制水分子的擴(kuò)散，造成冰晶不易成核和生長(zhǎng). 抗凍蛋白是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物，是廣義上的抗凍劑. 抗凍蛋白對(duì)水結(jié)構(gòu)的影響及冰點(diǎn)降低的機(jī)理已有研究. 如Hudait等［5］研究了黃粉蟲抗凍蛋白降低水冰點(diǎn)的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)蛋白上的羥基可通過(guò)氫鍵作用與水結(jié)合，減緩水的動(dòng)力學(xué)，從而抑制水結(jié)冰. 此外，還有研究認(rèn)為抗凍糖蛋白會(huì)影響周圍的水結(jié)構(gòu)，使其動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，不易成核結(jié)冰，從而使溶液凝固點(diǎn)降低［6］. 因此，抗凍劑與水之間的相互作用以及水在低溫下的結(jié)構(gòu)是理解冰點(diǎn)降低的關(guān)鍵因素.

近紅外光譜技術(shù)被廣泛用于研究水的結(jié)構(gòu)，并被認(rèn)為是研究溶液中氫鍵的有效方法之一［7］. Maeda等［8］研究了5～85 ℃下水的近紅外光譜，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取出了通過(guò)氫鍵作用形成的5種不同的水結(jié)構(gòu)，即含有0，1，2，3和4個(gè)氫鍵的水結(jié)構(gòu)；Gowen等［9］通過(guò)近紅外光譜研究了不同金屬離子對(duì)水氫鍵網(wǎng)絡(luò)的影響，結(jié)果表明，Al3+和Mg2+會(huì)增強(qiáng)水分子之間的氫鍵作用，而Na+和K+會(huì)減弱水分子之間形成的氫鍵強(qiáng)度；Xu等［10］利用近紅外光譜考察了尼龍6脫水過(guò)程中水結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)尼龍6的脫水過(guò)程與游離水及含有1或2個(gè)氫鍵的水結(jié)構(gòu)相關(guān).

本課題組利用水的近紅外光譜信息和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了有機(jī)小分子水溶液［11～13］、血清［14］和脯氨酸溶液［15］等混合體系的定量分析；還利用溫控近紅外光譜技術(shù)研究了人血清蛋白對(duì)水結(jié)構(gòu)的影響［16］，發(fā)現(xiàn)在蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變時(shí)含有3個(gè)氫鍵的水分子結(jié)構(gòu)（S3）具有重要作用；對(duì)不同溫度下葡萄糖水溶液的近紅外光譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和水之間的相互作用起到了穩(wěn)定四面體水結(jié)構(gòu)的作用，使水的結(jié)構(gòu)更加有序［17，18］；研究了不同溫度下寡肽水溶液的近紅外光譜，得到了3種水結(jié)構(gòu)的信息及其隨溫度的變化規(guī)律，表明寡肽和水之間的相互作用提高了水結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性［19］；分別考察了不同溫度下卵清蛋白水溶液［20］和聚合物水溶液［21］的近紅外光譜，發(fā)現(xiàn)具有2個(gè)氫鍵的水結(jié)構(gòu)在相變的過(guò)程中起到了維持溶質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用.

為了理解低溫下水的結(jié)構(gòu)及冰點(diǎn)降低的機(jī)理，本文采用近紅外光譜并結(jié)合拉曼光譜和分子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)對(duì)低溫下DMSO-水混合物中的水結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究. 分析了不同含量DMSO-水混合物的近紅外光譜和拉曼光譜，分析了不同溫度下混合物的近紅外光譜.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

DMSO（純度>99.7%）購(gòu)自艾覽（上海）化工科技有限公司；水為自制二次蒸餾水；配制了DMSO摩爾分?jǐn)?shù)分別為0，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%11個(gè)DMSO-水混合物，標(biāo)記為xDMSO-水（x為DMSO摩爾分?jǐn)?shù)）.

Vertex 70型紅外光譜儀，德國(guó)布魯克光譜儀器公司，配置了鹵素鎢燈光源、InGaAs檢測(cè)器及量程為1 mm的光纖探頭；inVia型拉曼光譜儀，英國(guó)雷尼紹公司；DFY-5/120型低溫恒溫反應(yīng)浴，天津星科科技有限公司.

1.2 光譜測(cè)量與計(jì)算

1.2.1 近紅外光譜 將光纖探頭插入待測(cè)液中進(jìn)行測(cè)量，光譜掃描范圍為12000～4000 cm?1，掃描64次，光譜分辨率為8 cm?1. 樣品的溫度由低溫恒溫反應(yīng)浴控制，控溫精度為±0.1 ℃. 以空氣為背景，溫度測(cè)量范圍為20～?70 ℃（純水為20～0 ℃），溫度間隔為10 ℃（純水為5 ℃），每個(gè)溫度下穩(wěn)定30 min后進(jìn)行光譜采集.

1.2.2 拉曼光譜 將待測(cè)液吸取到毛細(xì)管中進(jìn)行測(cè)量，激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)為532 nm，光譜測(cè)量范圍為4000～500 cm?1，激光功率為10 mW，曝光時(shí)間為1 s，測(cè)量溫度為20℃.

1.2.3 連續(xù)小波變換 連續(xù)小波變換（CWT）已廣泛用于增強(qiáng)光譜分辨率并扣除背景和噪聲［22～25］. 采用Sym4 小波濾波器的CWT 可計(jì)算光譜的近似四階導(dǎo)數(shù)，被認(rèn)為是提高近紅外光譜分辨率的有效方法［26］. 使用Sym4濾波器，近紅外光譜的計(jì)算中尺度系數(shù)設(shè)為20，拉曼光譜的計(jì)算中尺度系數(shù)設(shè)為10，以獲得合適的平滑效果.

1.2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬 采用NAMD2.13 軟件［27］對(duì)30%DMSO-水混合物進(jìn)行模擬. 建立了包含610 個(gè)DMSO 分子和1234 個(gè)水分子的立方盒子. 水分子模型采用TIP3P［28］，力場(chǎng)參數(shù)選擇CHARMM力場(chǎng)［29，30］. 分別使用朗之萬(wàn)（Langevin）活塞法和Langevin動(dòng)力學(xué)［31］對(duì)壓力和溫度進(jìn)行控制，壓力控制在1.013×105Pa，溫度分別為20 和?70 ℃. 分子動(dòng)力學(xué)軌跡通過(guò)可視化軟件VMD［32］進(jìn)行分析，通過(guò)SHAKE/RATTLE 和SETTLE 算法約束了含氫基團(tuán)的化學(xué)鍵［33，34］. 每個(gè)體系分別進(jìn)行了100 ns 的平衡模擬，選取最后50 ns進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析. 氫鍵的判斷依據(jù)為O―O距離小于0.35 nm且O―H…O的角度大于150°.

2 結(jié)果與討論

2.1 近紅外光譜分析

圖1給出了不同DMSO-水混合物在20 ℃時(shí)的近紅外吸收光譜（NIR）. 圖中位于6900和5200 cm?1處的2個(gè)譜峰分別歸屬為OH基團(tuán)伸縮振動(dòng)的一級(jí)倍頻和OH基團(tuán)彎曲及伸縮振動(dòng)的組合頻［8］. 由于水結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，6900 cm?1處的寬峰中包含了各種不同結(jié)構(gòu)OH基團(tuán)的光譜信息，導(dǎo)致譜峰表現(xiàn)為很寬的重疊峰；如圖1所示，隨著DMSO含量的增加，該峰向低波數(shù)方向移動(dòng)，表明DMSO與水之間存在相互作用并導(dǎo)致水結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且隨著二者相對(duì)含量的不同逐漸變化. 另外，DMSO和水峰的重疊也可能是導(dǎo)致譜峰移動(dòng)的原因. 但由于譜峰的重疊難以從圖1中得到更多的有效信息.

Fig.1 NIR spectra of xDMSO?water mixture

Fig.2 Transformed NIR spectra of water(a)and DMSO(b)

為了從近紅外光譜中得到更多信息，使用CWT進(jìn)行了計(jì)算，計(jì)算中采用了Sym4小波基，因此計(jì)算結(jié)果相當(dāng)于光譜的近似四階導(dǎo)數(shù)［26］. 為了便于分析，圖2給出了純水和純DMSO 的近似四階導(dǎo)數(shù)近紅外光譜，可以看出光譜的分辨率得到了很大程度的提高. 其中水的吸收峰較為簡(jiǎn)單，有3個(gè)譜峰，分別位于7109，6978 和6839 cm?1處，可分別歸屬為游離、弱氫鍵鍵合和強(qiáng)氫鍵鍵合的OH 基團(tuán)［8，35］. 而DMSO的譜峰較為復(fù)雜，有6個(gè)吸收峰，分別位于7120，7000，6908，6846，6731和6510 cm?1處，前5個(gè)譜峰來(lái)源于CH 基團(tuán)伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)的組合頻［36］，第6 個(gè)峰可歸屬為S=O 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)倍頻峰［3］.

2.2 DMSO與水的相互作用

圖3 為不同DMSO-水混合物光譜的近似四階導(dǎo)數(shù)近紅外光譜圖. 與圖2 進(jìn)行比較可見(jiàn)，隨著DMSO含量的增加，水的3個(gè)吸收峰強(qiáng)度迅速減小，其中弱氫鍵鍵合的―OH峰甚至完全被掩蓋. 一方面―OH峰的強(qiáng)度隨混合物中水含量的減少而降低，另一方面DMSO 與水之間的相互作用破壞了水分子的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使水的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化. DMSO 與水的相互作用強(qiáng)于水分子之間的相互作用［37］，因此在DMSO-水混合物中，水主要以與DMSO形成氫鍵的形式存在. 從圖3還可見(jiàn)，7000和6731 cm?1處C―H 峰的強(qiáng)度隨著DMSO 含量的增加而增大，但在7120，6908 和6846 cm?1處的C―H 峰的強(qiáng)度隨著DMSO含量的增加反而逐漸降低，這是因?yàn)樗鼈兣cO―H吸收峰重疊嚴(yán)重，導(dǎo)致譜峰表現(xiàn)出隨水含量減少而減小的規(guī)律. 此外，隨著DMSO含量的增加，C―H的5個(gè)吸收峰均向低波數(shù)移動(dòng)，這可能由水與S=O間的氫鍵作用對(duì)鄰位CH基團(tuán)造成的影響，或者由水與CH基團(tuán)之間的弱相互作用所致［38］. 另外，水峰的重疊也有可能導(dǎo)致譜峰的移動(dòng).

Fig.3 NIR transformed spectra of xDMSO?water mixture

Fig.4 Variation of the peak intensity at 6442 cm?1 of xDMSO?water

由圖3 還可見(jiàn)，6510 cm?1處吸收峰的強(qiáng)度隨著DMSO 含量的增加而增加，進(jìn)一步說(shuō)明此峰歸屬為S=O的合理性. 更有趣的是，在6442 cm?1處出現(xiàn)了一個(gè)新的譜峰，該峰顯然是由DMSO與水相互作用而產(chǎn)生的，根據(jù)譜峰的位置和DMSO的性質(zhì)，該峰應(yīng)歸屬為DMSO與水形成氫鍵的S=O結(jié)構(gòu). 為了對(duì)該峰進(jìn)行詳細(xì)分析，圖4 給出了該峰峰強(qiáng)度隨DMSO 含量的變化. 可見(jiàn)，隨著DMSO 摩爾分?jǐn)?shù)的增加，峰強(qiáng)度快速增加，30%時(shí)增速放緩，60%時(shí)峰強(qiáng)度達(dá)到最大，隨后峰強(qiáng)度迅速降低. 2個(gè)明顯的拐點(diǎn)分別位于30%和60%，此時(shí)DMSO與水的摩爾比分別接近1∶2和2∶1. 據(jù)此可以推測(cè)，在DMSO與水的混合物中可能存在摩爾比分別為1∶2和2∶1的氫鍵結(jié)構(gòu)，分別表示為DW2和D2W. 當(dāng)DMSO含量少于水含量時(shí)，DMSO 上的S=O 先與2 個(gè)水分子形成DW2 結(jié)構(gòu)且隨著DMSO 含量的增加而增多，當(dāng)DMSO 含量明顯多于水含量時(shí)，水分子與2個(gè)DMSO 形成D2W結(jié)構(gòu)且隨著水含量的減少而減少，即在30%和60%混合物中DMSO與水存在的主要形式分別為DW2和D2W結(jié)構(gòu). 需要注意的是，當(dāng)DMSO和水的含量相近時(shí)并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)，可能是由于摩爾比為1∶1的氫鍵結(jié)構(gòu)（DW）穩(wěn)定性較弱，也可能是摩爾比分別為1∶2和1∶1的2種結(jié)構(gòu)在光譜上的相似性致使兩者之間的轉(zhuǎn)換不存在明顯的拐點(diǎn).

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，測(cè)定了不同DMSO-水混合物在20 ℃時(shí)的拉曼光譜. 圖5（A）為不同DMSO-水混合物在1100～980 cm?1波長(zhǎng)范圍的拉曼光譜，該譜峰源于S=O 的伸縮振動(dòng)［39］. 隨著DMSO含量的增加，峰值向高波數(shù)方向移動(dòng)，表明S=O與水之間確實(shí)存在相互作用. 但由于譜峰的重疊，難以得到更多的有效信息. 因此，同樣采用CWT 技術(shù)提高光譜的分辨率，結(jié)果見(jiàn)圖5（B）. 在1059，1041，1026和1012 cm?1處出現(xiàn)了4個(gè)峰，其中1059 cm?1處的峰可歸屬為游離的S=O結(jié)構(gòu)［40］. 為了對(duì)其余3 個(gè)峰進(jìn)行歸屬，測(cè)定了不同含量DMSO-CCl4混合物的拉曼光譜［圖5（C）］. 近似導(dǎo)數(shù)光譜見(jiàn)圖5（D）. 由圖5（D）可見(jiàn)，位于1059 和1041 cm?1處的譜峰，分別對(duì)應(yīng)于游離和自聚狀態(tài)時(shí)S=O［40，41］.對(duì)比圖5（B）和（D），1026和1012 cm?1處出現(xiàn)了2個(gè)明顯的譜峰，并且二者的最高值分別對(duì)應(yīng)DMSO摩爾分?jǐn)?shù)60%和30%. 此結(jié)果進(jìn)一步表明D2W 和DW2 的存在，與上述近紅外光譜的結(jié)果高度一致. 值得注意的是，D2W和DW 結(jié)構(gòu)中S=O的氫鍵結(jié)構(gòu)非常相似，通過(guò)1026 cm?1處的譜峰無(wú)法確認(rèn)屬于哪種結(jié)構(gòu)，但其最高強(qiáng)度對(duì)應(yīng)DMSO摩爾分?jǐn)?shù)為60%，可以說(shuō)明摩爾比1∶1的DW結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可能很差甚至并不存在.

Fig.5 Raman spectra(A, C) and transformed spectra(B, D) of xDMSO?water(A, B) and xDMSO?CCl4(C,D)mixtures(C)at 20 ℃

2.3 低溫DMSO-水混合物中水的結(jié)構(gòu)

為了對(duì)低溫水結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，采用溫控近紅外光譜技術(shù)測(cè)定了溫度范圍分別為20～0 ℃和20～?70 ℃條件下的水和30%DMSO-水混合物的近紅外光譜. 其中?70 ℃為文獻(xiàn)［42］報(bào)道的DMSO-水混合物的凝固點(diǎn)，但在本文中，?70 ℃時(shí)的光譜仍為液態(tài)混合物的光譜，未對(duì)凝固后的光譜進(jìn)行測(cè)量.圖6（A）和（B）分別是由CWT計(jì)算得到的近似四階導(dǎo)數(shù)光譜. 從圖6（A）可見(jiàn)，純水在溫度>5 ℃時(shí)光譜中主要有代表游離、弱氫鍵鍵合和強(qiáng)氫鍵鍵合的OH基團(tuán)的3個(gè)峰. 隨著溫度的降低，它們的強(qiáng)度分別表現(xiàn)出減小、增加和小幅度變動(dòng). 溫度越低，水的氫鍵作用越強(qiáng)，更多游離的OH基團(tuán)轉(zhuǎn)化為氫鍵鍵合結(jié)構(gòu)［8］. 在0 ℃時(shí)，水的光譜發(fā)生了很大變化，3個(gè)OH基團(tuán)峰消失，在6754 cm?1處出現(xiàn)了一個(gè)新峰且為光譜中的主要譜峰，此峰可歸屬為水的四面體結(jié)構(gòu)［43，44］. 由此可以看出，冰中水的結(jié)構(gòu)主要是四面體結(jié)構(gòu).

Fig.6 Transformed spectra of water(A)and 30%DMSO?water mixture(B)at different temperatures

圖6（B）為不同溫度時(shí)DMSO-水混合物的近紅外光譜，與圖6（A）中的結(jié)果完全不同. 前述的譜峰歸屬和分析表明，混合物中主要是通過(guò)氫鍵形成的DMSO-水聚集體，即DW2結(jié)構(gòu). 有趣的是，圖6（B）中的光譜從20 ℃到?70 ℃都沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，只是各譜峰的相對(duì)強(qiáng)度隨溫度的降低發(fā)生了變動(dòng).由于譜峰的重疊，難以對(duì)譜峰的強(qiáng)度變化進(jìn)行細(xì)致分析，但仍能看出強(qiáng)氫鍵鍵合的OH 峰（6839 cm?1）隨溫度的降低逐漸增加. 特別值得注意的是，6510 cm?1處S=O 峰的強(qiáng)度隨溫度的降低逐漸減弱，而6442 cm?1處的譜峰（氫鍵鍵合的S=O，在此處主要是DW2結(jié)構(gòu)）強(qiáng)度逐漸增加，說(shuō)明隨著溫度的降低形成了更多的DW2結(jié)構(gòu). 因此，DW2結(jié)構(gòu)是混合物冰點(diǎn)降低的主要原因，即DW2結(jié)構(gòu)抑制了四面體水結(jié)構(gòu)的形成.

2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬分析

Fig.7 Structure and statistic of S=O structures from the trajectory of molecular dynamics simulation

為了進(jìn)一步對(duì)上述結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，分別對(duì)30%DMSO-水混合物在20 ℃和?70 ℃時(shí)的軌跡進(jìn)行了模擬，并采用上述氫鍵的判斷標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)了軌跡中游離S=O 基團(tuán)、D2W 和DW2 結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)概率. 圖7 是3種結(jié)構(gòu)及其統(tǒng)計(jì)結(jié)果. 可以看出，混合物中的DMSO和水分子主要以DW2結(jié)構(gòu)的形式存在，并且低溫時(shí)DW2的含量有所增加，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度一致，有力支持了DW2結(jié)構(gòu)抑制四面體水結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致混合物冰點(diǎn)降低的結(jié)論.

3 結(jié) 論

采用近紅外光譜結(jié)合拉曼光譜和分子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)對(duì)DMSO-水混合物中的水結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究. 利用CWT 技術(shù)可以提高光譜的分辨率，從高分辨的光譜中可以明顯看出DMSO 與水形成氫鍵的S=O 峰，根據(jù)此峰的強(qiáng)度隨DMSO 的含量變化得到了DMSO-水混合物中S=O 與水形成的2 種結(jié)構(gòu)（D2W和DW2）. 拉曼光譜進(jìn)一步驗(yàn)證了2種結(jié)構(gòu)的存在. 通過(guò)對(duì)不同溫度下水和30%DMSO-水混合物的近紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)DW2結(jié)構(gòu)抑制了低溫時(shí)四面體水結(jié)構(gòu)的形成可能是DMSO-水混合物冰點(diǎn)降低的原因，此結(jié)論得到了分子動(dòng)力學(xué)模擬的驗(yàn)證. 近紅外光譜為低溫下水結(jié)構(gòu)的研究提供了良好手段，可廣泛用于低溫體系中水的結(jié)構(gòu)和氫鍵作用的研究.