王丹妮 楊鈐 仲啟明 宋美卿 仝立國(guó) 賈力莉 牛艷艷 馮瑪莉

摘 要 目的：研究異虎耳草素對(duì)對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）致松果體損傷模型大鼠的改善作用及其對(duì)生物鐘基因表達(dá)的影響。方法：將60只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（2%聚山梨酯80溶液）、模型對(duì)照組（2%聚山梨酯80溶液）、陽(yáng)性對(duì)照組（褪黑素，10 mg/kg）和異虎耳草素高、中、低劑量組（3、1.5、0.75 mg/kg），每組10只。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用腹腔注射PCPA（450? ? ? mg/kg）的方法構(gòu)建松果體損傷模型。造模結(jié)束后，各組大鼠灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。在給藥第6天，通過(guò)戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)考察各組大鼠的入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間;末次給藥后，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠血清中褪黑素水平，分別在熒光顯微鏡和電子顯微鏡下觀察大鼠松果體組織的病理變化和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，并采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測(cè)定大鼠松果體中生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的入睡潛伏期顯著延長(zhǎng)（P<0.05）;血清中褪黑素水平和松果體中Bmal1、Per1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），Per3 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;松果體細(xì)胞排列紊亂、核固縮，空泡變性明顯增多，數(shù)目明顯減少，線粒體多見腫脹、嵴斷裂、固縮。與模型對(duì)照組比較，異虎耳草素高劑量組大鼠的入睡潛伏期顯著縮短（P<0.05）、睡眠持續(xù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P<0.05），血清中褪黑素水平和松果體中Clock、Bmal1、Per1、Cry1、Cry2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）;異虎耳草素中劑量組大鼠的入睡潛伏期顯著縮短（P<0.05），血清中褪黑素水平和松果體中Clock、Bmal1、Per1、Cry1、Cry2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01），Per3 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;異虎耳草素低劑量組大鼠Clock、Bmal1、Per2、Cry2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Per3 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;異虎耳草素各劑量組大鼠松果體細(xì)胞排列紊亂均有一定程度改善、核固縮空泡變性減少，線粒體腫脹、嵴斷裂、固縮均有一定程度減少。結(jié)論：異虎耳草素對(duì)PCPA致大鼠松果體損傷具有一定的改善作用;其可上調(diào)松果體正向調(diào)節(jié)因子Clock、Bmal1和負(fù)向調(diào)節(jié)因子Per1、Per2、Cry1、Cry2的表達(dá)，下調(diào)負(fù)向調(diào)節(jié)因子Per3的表達(dá)。

關(guān)鍵詞 異虎耳草素;松果體;生物鐘基因;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of isopimpinelline on p-chlorophenylalanine （PCPA）-induced pineal injury model rats and its effect on expression of biological clock gene. METHODS： Totally 60 rats were divided into blank control group （2% polysorbate solution）， model control group （2% polysorbate solution）， positive control group （melatonin， 10 mg/kg） and isopimpinelline high-dose， medium-dose and low-dose groups （3， 1.5， 0.75 mg/kg）. Except for blank control group， rats in other groups were given PCPA intraperitoneally （450 mg/kg） to establish pineal injury model. After modeling finished， they were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. On the 6th day of administration， the sleep latency and sleep duration of rats in each group were investigated by pentobarbital sodium coordination sleep test; after last administration， ELISA assay was used to determine the serum level of melatonin in rats. Fluorescence microscope and electron microscope were used to observe the pathological tissue and cell ultrastructure changes of the pineal gland. RT-qPCR was used to detect the mRNA expressions of biological clock gene Clock， Bmal1， Per1， Per2， Per3， Cry1， Cry2 in pineal gland of rats. RESULTS： Compared with blank control group， model control group had significantly longer sleep latency （P<0.05）; serum melatonin， mRNA expressions of Bmal1 and Per1 in pineal gland were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01） while mRNA expression of Per3 was increased significantly （P<0.05）. The pineal gland cell arrangement disorder， nuclear pyknosis， vacuolar degeneration increased and cell number decreased significantly; mitochondria swollen， cristae broken and pyknosis were observed. Compared with model control group， the sleep latency of isopimpinelline high-dose group was shortened significantly （P<0.05）， sleep duration time was prolonged significantly （P<0.05）; the levels of melatonin in serum， mRNA expressions of Clock， Bmal1， Per1， Cry1 and Cry2 in pineal gland of rats were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. In isopimpinelline medium-dose group， the sleep latency was shortened significantly （P<0.05）; the levels of melatonin in serum and mRNA expressions of Clock， Bmal1， Per1， Cry1， Cry2 in pineal gland were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while mRNA expression of Per3 was decreased significantly （P<0.05）. In isopimpinelline low-dose group， the levels of mRNA expressions of Clock， Bmal1， Per2 and Cry2 were increased significantly （P<0.05）， while mRNA expression of Per3 was decreased significantly （P<0.05）. Cell arrangement disorder was improved and nuclear pyknosis vacuole degeneration was decreased to some extent in isopimpinelline groups; mitochondria swelled， cristae fractured， and pyknosis decreased to some extent. CONCLUSIONS： Isopimpinelline can improve PCPA-induced pineal gland injury in rats; it can up-regulate the expressions of positive regulators Clock， Bmal1 and negative regulators Per1， Per2， Cry1， Cry2， while down-regulate the expression of negative regulator Per3.

KEYWORDS? ?Isopimpinelline; Pineal gland; Biological clock gene; Rats

松果體（Pineal gland）作為晝夜節(jié)律生物鐘，主要通過(guò)合成、分泌褪黑素進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體晝夜節(jié)律、促進(jìn)睡眠，并且其分泌的褪黑素還具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抗腫瘤、延緩衰老等作用[1-2]。松果體損傷會(huì)導(dǎo)致褪黑素合成、分泌減少，從而引起機(jī)體晝夜節(jié)律紊亂。鐘振蕩器由一組晝夜節(jié)律基因及其編碼的蛋白組成，是維持內(nèi)源性生物鐘運(yùn)作的核心元件[3]。目前，針對(duì)哺乳動(dòng)物研究較多的生物鐘基因分別有Clock、Bmal1、Perl、Per2、Per3、Cry1、Cry2等，其對(duì)晝夜節(jié)律生物鐘機(jī)能有著重要作用[4]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蛇床子具有中樞抑制作用，其主要活性成分為蛇床子香豆素類成分，包括異虎耳草素、蛇床子素、佛手柑內(nèi)酯等[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究通過(guò)譜-效分析發(fā)現(xiàn)，異虎耳草素為蛇床子香豆素類主要活性成分之一，具有催眠、提高血清褪黑素水平的作用，并可下調(diào)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞Bmal1基因表達(dá)，上調(diào)Cry1、Per1、Per2基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期[6-8]。但其催眠活性是否通過(guò)改善松果體損傷及調(diào)控松果體生物鐘基因表達(dá)尚不明確。鑒于此，本研究通過(guò)腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）致大鼠松果體損傷后，觀察異虎耳草素對(duì)松果體損傷大鼠的睡眠、血清褪黑素水平、松果體組織病理學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和生物鐘基因表達(dá)的影響，以期發(fā)現(xiàn)含異虎耳草素的中藥材或植物藥保護(hù)松果體的作用及催眠機(jī)制，進(jìn)而為此類藥物的臨床應(yīng)用、研發(fā)和資源利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

H1型多功能微孔讀板機(jī)（美國(guó)Bio-Tek公司）;BX51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;JEM-1011型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）;7500型實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、9902 Veriti型定性PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）;H1型全功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）。

1.2 藥品與試劑

異虎耳草素對(duì)照品（上海融合醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：150809，純度：>98%）;褪黑素對(duì)照品（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：917D021，純度：≥99.0%）;PCPA、戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：10026000696、57-30-0，純度：100%、>99.0%）;聚山梨酯80（湖北省醫(yī)藥公司化玻站，批號(hào)：080308，化學(xué)純）;褪黑素酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（德國(guó)IBL公司，批號(hào)：EME174）;RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測(cè)試劑盒（德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：160052260、163018617）;cDNA合成試劑盒（瑞士Roche公司，批號(hào)：04379012001）;其余試劑均為分析純，水為超純水。PCR引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠60 只，雄性，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。大鼠購(gòu)入后飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院中心實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境溫度為22～24 ℃、相對(duì)濕度為40%～50%。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中對(duì)動(dòng)物處理的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行操作。

2 方法

2.1 分組與造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和異虎耳草素高、中、低劑量組，每組10 只。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠均參考文獻(xiàn)方法[7]并進(jìn)行優(yōu)化后復(fù)制松果體損傷模型：腹腔注射PCPA混懸液450 mg/kg[按文獻(xiàn)方法[9]加入溶劑0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 10.1），80 ℃水浴加熱30 min，超聲（功率：250 W，頻率：25 kHz）處理5 min，制成4.5%PCPA混懸液]，每天1次，連續(xù)2 d。空白對(duì)照組大鼠腹腔注射等量、等pH的0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液。

2.2 給藥

分別將褪黑素、異虎耳草素溶于2%聚山梨酯80溶液（量取2 mL聚山梨酯80加水至100 mL制得）中，制成褪黑素質(zhì)量濃度為1 mg/mL和異虎耳草素質(zhì)量濃度分別為0.3、0.15、0.075 mg/mL的溶液。在“2.1”項(xiàng)下造模后，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃褪黑素10 mg/kg[10]，異虎耳草素高、中、低劑量組大鼠分別灌胃異虎耳草素3、1.5、0.75 mg/kg[7]，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠灌胃等體積2%聚山梨酯80溶液，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 一般情況觀察 腹腔注射PCPA混懸液完畢后，觀察各組大鼠的精神狀態(tài)及活動(dòng)情況。

2.3.2 大鼠戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn) 給藥第6 天，各組大鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉38 mg/kg。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo);以大鼠背向下姿勢(shì)保持30 s以上者判斷為翻正反射消失。記錄注射戊巴比妥鈉后至大鼠翻正反射消失的時(shí)間，作為入睡潛伏期;觀察并記錄大鼠翻正反射消失至覺醒的時(shí)間，作為睡眠持續(xù)時(shí)間。

2.3.3 大鼠血清中褪黑素水平測(cè)定 末次給藥后2 h時(shí)，以10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，然后于腹主動(dòng)脈取血2 mL。將血樣以3 000 r/min離心10 min，收集血清。采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)血清中褪黑素水平，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.3.4 大鼠松果體病理組織學(xué)觀察 取血后，每組隨機(jī)選3只大鼠處死并沿枕骨大孔開顱，將大腦人字縫上部充分暴露，可見橢圓形米粒大小的松果體。完整剖取松果體，置于10%甲醛溶液中固定48 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度5 ?m），然后行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察松果體病理組織學(xué)變化。

2.3.5 大鼠松果體超微結(jié)構(gòu)觀察 取血后，每組隨機(jī)選2只大鼠，按“2.3.4”項(xiàng)下方法快速剖取松果體，于30 s內(nèi)置于2%戊二醛溶液中固定2 h，然后轉(zhuǎn)至0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）中，常規(guī)1%鋨酸固定、脫水、包埋、切片（厚度70 nm）、電子染色后，置于電子顯微鏡下觀察松果體超微結(jié)構(gòu)變化。

2.3.6 大鼠松果體生物鐘基因檢測(cè) 取血后，取各組剩余的5只大鼠，按“2.3.4”項(xiàng)下方法快速剖取松果體，采用Trizol法分離提取其總RNA，檢驗(yàn)純度和濃度后，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA模板3 μL，上、下游引物各2.5 μL，2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、無(wú)酶水4.5 μL，總體系為25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 min，95 ℃退火10 s，60 ℃延伸35 s，共40個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1和Cry2基因的mRNA表達(dá)水平（其中Ct表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

腹腔注射PCPA完畢后，空白對(duì)照組大鼠反應(yīng)敏捷、迅速，皮毛柔順光亮;其余大鼠較空白對(duì)照組大鼠白天活動(dòng)增加，易激惹、打斗、嘶叫，頭部可見多處皮膚撕咬破損出血，表明模型復(fù)制成功。

3.2 大鼠戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的入睡潛伏期顯著延長(zhǎng)（P<0.05）;睡眠持續(xù)時(shí)間有一定縮短，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和異虎耳草素高、中劑量組大鼠的入睡潛伏期均顯著縮短（P<0.05），陽(yáng)性對(duì)照組和異虎耳草素高劑量組大鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

3.3 大鼠血清中褪黑素水平測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中褪黑素水平顯著降低（P<0.01）。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和異虎耳草素高、中劑量組大鼠血清中褪黑素水平顯著升高（P<0.01）。各組大鼠血清中褪黑素水平測(cè)定結(jié)果見表3。

3.4 大鼠松果體病理組織學(xué)觀察結(jié)果

空白對(duì)照組大鼠松果體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞排列緊密、均勻分布、清晰可見。模型對(duì)照組大鼠松果體細(xì)胞排列紊亂、數(shù)目明顯減少，空泡變性增多，細(xì)胞核固縮向周邊移動(dòng)，細(xì)胞界限模糊。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠松果體細(xì)胞排列紊亂、數(shù)目明顯減少，空泡變性呈橢圓形，細(xì)胞核固縮向周邊移動(dòng)，細(xì)胞界限模糊。與模型對(duì)照組比較，異虎耳草素高、中劑量組大鼠松果體細(xì)胞排列均勻、清晰可見，數(shù)目明顯增多，空泡變性、細(xì)胞核固縮向周邊移動(dòng)的情況明顯減少，細(xì)胞界限清晰，且以高劑量組效果更為明顯;異虎耳草素低劑量組大鼠松果體細(xì)胞排列稍均勻、數(shù)目略增多，空泡變性、細(xì)胞核固縮向周邊移動(dòng)的情況略減少，細(xì)胞界限稍清晰。各組大鼠松果體病理組織學(xué)顯微圖見圖1。

3.5 大鼠松果體超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

空白對(duì)照組大鼠松果體細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核體積較大，細(xì)胞形狀不規(guī)則，表面不光滑、多有凹陷，常染色質(zhì)多、異染色質(zhì)少;細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)少，有較多線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、脂滴，這與文獻(xiàn)報(bào)道[11]相符。模型對(duì)照組大鼠松果體細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核體積較大，細(xì)胞形狀不規(guī)則，表面不光滑、多有凹陷，常染色質(zhì)多、異染色質(zhì)少;細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)少，有較多線粒體，且線粒體多腫脹、嵴斷裂、固縮，游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體較多，有較少脂滴。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠松果體的線粒體腫脹、嵴斷裂、固縮情況略減輕。與模型對(duì)照組比較，異虎耳草素高、中劑量組大鼠松果體的線粒體腫脹情況明顯減輕，嵴斷裂、固縮情況明顯減少;異虎耳草素低劑量組松果體的線粒體腫脹略減輕，嵴斷裂、固縮略減少。各組大鼠松果體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯微圖見圖2。

3.6 大鼠松果體生物鐘基因表達(dá)測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠松果體中Bmal1、Per1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Per3 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠松果體中Clock、Per1、Per3、Cry1、Cry2 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），Per2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;異虎耳草素高劑量組大鼠松果體中Clock、Bmal1、Per1、Cry1、Cry2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）;異虎耳草素中劑量組大鼠松果體中Clock、Bmal1、Per1、Cry1、Cry2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01），Per3 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;異虎耳草素低劑量組大鼠松果體中Clock、Bmal1、Per2、Cry2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Per3 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。各組大鼠松果體中生物鐘基因mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表4。

4 討論

松果體為實(shí)質(zhì)性器官，主要由松果體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，也稱為明細(xì)胞和暗細(xì)胞，其中明細(xì)胞占90%以上[12]。松果體是機(jī)體生物鐘節(jié)律的重要組成部分，主要合成、分泌褪黑素，但褪黑素合成后并不儲(chǔ)存于松果體細(xì)胞中，而是被迅速分泌到周圍血液中，因此血液中褪黑素水平可以準(zhǔn)確反映松果體合成、分泌褪黑素的能力[13]。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)松果體病理?yè)p傷的研究均較少。PCPA多用于制備失眠模型，其是通過(guò)抑制色氨酸氫化酶合成來(lái)減少5-羥色胺生成，從而導(dǎo)致睡眠-覺醒周期紊亂[14]。本課題組在前期采用PCPA腹腔注射致失眠模型研究中發(fā)現(xiàn)，PCPA對(duì)松果體組織病理及超微結(jié)構(gòu)有損傷，且會(huì)降低血清中褪黑素水平，從而引起晝夜節(jié)律失調(diào)，但其損傷機(jī)制尚不清楚。外源性適量補(bǔ)充褪黑素可促進(jìn)褪黑素分泌，改善機(jī)體的失眠[15]。因此，本研究選擇褪黑素為陽(yáng)性對(duì)照藥。檢測(cè)結(jié)果顯示，褪黑素可縮短PCPA致松果體損傷模型大鼠的入睡潛伏期、延長(zhǎng)其睡眠持續(xù)時(shí)間、提高其血清褪黑素水平，但褪黑素對(duì)松果體結(jié)構(gòu)損傷改善不明顯;異虎耳草素可顯著縮短大鼠的入睡潛伏期、延長(zhǎng)其睡眠持續(xù)時(shí)間，有效改善其受損松果體細(xì)胞排列紊亂、數(shù)目減少、空泡變性及線粒體腫脹、嵴斷裂、固縮等情況。

在哺乳動(dòng)物中，晝夜節(jié)律鐘機(jī)制由細(xì)胞自主轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路組成，在細(xì)胞質(zhì)中mClock和mBmal1的產(chǎn)物蛋白形成異二聚體，作用于mPer和mCry啟動(dòng)子的E-box區(qū)，啟動(dòng)mPer和mCry的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，為正反饋環(huán)路;隨著PER和CRY蛋白增多，經(jīng)磷酸化后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，可有節(jié)奏地抑制CLOCK ∶ BMAL1異二聚體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，從而抑制自身轉(zhuǎn)錄，為負(fù)反饋環(huán)路[16]。兩條環(huán)路共同調(diào)節(jié)機(jī)體晝夜節(jié)律。其中，Clock基因?yàn)樽钤绨l(fā)現(xiàn)的生物鐘基因，主要維持睡眠穩(wěn)態(tài)[17];Bmal1基因是轉(zhuǎn)錄起始的主要調(diào)節(jié)因子，并激活晝夜節(jié)律生物鐘基因表達(dá)[18];Per1基因的多態(tài)性與機(jī)體極端晝夜偏好相關(guān)[19];Per1和Per2基因共同調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律振蕩，并將晝夜節(jié)律周期限制在大約24 h內(nèi)[20];Per3基因與快速眼動(dòng)睡眠行為障礙相關(guān)[21];Cry1基因突變與家族性延遲睡眠障礙相關(guān)[22];Cry2基因主要調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律周期[23]。在本研究中，腹腔注射PCPA后，大鼠松果體中Bmal1、Per1基因表達(dá)顯著下調(diào)，Per3基因表達(dá)顯著上調(diào)，導(dǎo)致其機(jī)體晝夜節(jié)律紊亂。給予褪黑素干預(yù)后，模型大鼠松果體中Per2基因表達(dá)顯著上調(diào)，Clock、Per1、Per3、Cry1、Cry2基因表達(dá)顯著下調(diào)，推測(cè)褪黑素可能是上調(diào)Per2表達(dá)后，抑制了Clock的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。給予異虎耳草素干預(yù)后，模型大鼠松果體中Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2表達(dá)均不同程度地上調(diào)、Per3表達(dá)不同程度地下調(diào)，筆者推測(cè)異虎耳草素可能是通過(guò)上調(diào)負(fù)反饋環(huán)路中Per、Cry的表達(dá)從而發(fā)揮晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)作用，但在本研究結(jié)果中Clock、Bmal1表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，具體原因和調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究分析。

綜上所述，異虎耳草素可改善大鼠松果體結(jié)構(gòu)損傷，增加褪黑素的合成分泌，縮短大鼠入睡潛伏期、延長(zhǎng)其睡眠持續(xù)時(shí)間，上調(diào)松果體正向調(diào)節(jié)因子Clock、Bmal1和負(fù)向調(diào)節(jié)因子Per1、Per2、Cry1、Cry2及下調(diào)負(fù)向調(diào)節(jié)因子Per3表達(dá)。

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（收稿日期：2020-04-01 修回日期：2020-07-24）

（編輯：林 靜）