肖衛(wèi)棉，查旭山△，王友發(fā)

濕疹作為一種常見(jiàn)皮膚炎癥反應(yīng)，可由多種因素引起，典型癥狀在兒童期開(kāi)始出現(xiàn)，發(fā)病程度輕重不一，容易反復(fù)發(fā)作且難于根治，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1-2］。濕疹發(fā)病機(jī)制不明，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞活化參與濕疹發(fā)病過(guò)程，并對(duì)此的臨床研究越來(lái)越多［3-4］。P 物質(zhì)（substance P，SP）/神經(jīng)激肽 1受體（neurokinin 1 receptor，NK1R）復(fù)合物參與濕疹、慢性蕁麻疹及慢性結(jié)腸炎等疾病過(guò)程［5-6］，同時(shí)也參與調(diào)控肥大細(xì)胞脫顆粒過(guò)程［7］。因此，探究濕疹過(guò)程中SP、NK1R 表達(dá)及其對(duì)肥大細(xì)胞活化的影響具有重要臨床意義。丹皮酚是從牡丹皮、芍藥、徐長(zhǎng)卿等草本植物中提取的一種生物活性物質(zhì)［8］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可祛風(fēng)、除濕、止癢、涼血活血，同時(shí)可緩解患者皮膚瘙癢、紅疹及皮膚滲出液中炎性浸潤(rùn)和細(xì)菌感染等癥狀，其抗炎、抗過(guò)敏作用在治療濕疹方面具有較好的療效［9-10］，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)建立濕疹小鼠模型，分析丹皮酚對(duì)其皮損組織SP/NK1R 表達(dá)及肥大細(xì)胞活化的影響，以期為濕疹的臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)C57BL 小鼠120 只，體質(zhì)量100～120 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為省科委2000A027。所有小鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：自然光照，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。小鼠自由進(jìn)食、飲水。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，批號(hào)為IACUC-01（20160917），實(shí)驗(yàn)符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 丹皮酚（EB03479，25 g/瓶）購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（P0768）購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司；小鼠SP 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（YS-E1627）購(gòu)自上海研生生化試劑有限公司；2,4-二硝基氯苯（DNCB，138630-100G）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；地塞米松（B25793-100 mg）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（ZN1970-IQN）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；類(lèi)胰蛋白酶（Tryptase）抗體（orb241128）購(gòu)自英國(guó)Biorbyt公司；NK1R抗體（ATA33963）購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司。蛋白電泳儀（型號(hào)1659001）、半干轉(zhuǎn)膜儀（Trans-Blot SD）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠濕疹模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)［11-13］構(gòu)建小鼠濕疹模型，具體操作方法為：取100 只小鼠，用5%DNCB 溶液40 μL涂于小鼠雙耳內(nèi)側(cè)致敏后，以1%DNCB 溶液40 μL涂于小鼠雙耳內(nèi)側(cè)，每隔4 d致敏1次，共5次后，肉眼觀察小鼠雙耳內(nèi)側(cè)皮膚性狀，若出現(xiàn)紅腫增厚或滲出現(xiàn)象表明模型建立成功。將模型建立成功的小鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為濕疹模型組，丹皮酚低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組［11］，另設(shè)陽(yáng)性藥物（地塞米松0.65 mg/kg）組，每組20 只。另取20 只小鼠，于小鼠雙耳內(nèi)側(cè)涂抹5%氯化納溶液每次40 μL，后期用1%氯化納溶液40 μL 涂抹，每隔4 d 涂抹1 次，共5 次，作為空白對(duì)照（Control）組。丹皮酚低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組均經(jīng)腹腔注射給予相應(yīng)劑量藥物0.5 mL，1次/d，共14 d；Control組和濕疹模型組經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 小鼠耳部濕疹皮損程度評(píng)分 各組小鼠末次給藥1 h后，參照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行皮損程度計(jì)分：5～6分，雙耳明顯紅腫增厚、角化結(jié)痂或滲出；3～4分，紅腫較輕、中度角化者或滲出不明顯；1～2 分，紅腫和滲出均不明顯，或者輕度角化；0 分，正常皮膚。每組小鼠評(píng)分取平均值。

1.2.3 小鼠皮損組織HE染色病理學(xué)檢測(cè) 各組小鼠在做完評(píng)分后處死，取雙側(cè)耳部組織，剪取0.5 g 置于-80 ℃冰箱中保存，其余組織置于4%多聚甲醛中固定，做石蠟切片。將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，HE 染色6 min，1%鹽酸乙醇分化15 s，蒸餾水漂洗3 min，梯度乙醇脫水3 min，二甲苯透明處理并用中性光學(xué)樹(shù)脂封片，光鏡下觀察各組耳部病變組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)SP含量 取小鼠耳部組織，于4 ℃冰箱中解凍后制成10%組織勻漿，離心后，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SP含量。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)耳部組織Tryptase 及NK1R表達(dá) 取石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)脫蠟、脫水，用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫酶滅活后，加入兔抗鼠一抗抗體（Tryptase、NK1R均為1︰500），于30 ℃孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST漂洗3次，加入1︰1 000的羊抗兔二抗溶液，室溫孵育1 h，經(jīng)TBST漂洗后，加SP 復(fù)合物和DAB 顯色劑，蘇木精-伊紅溶液復(fù)染，并進(jìn)行透明、封片。然后于400 倍光鏡下拍照，每片隨機(jī)讀取5 個(gè)視野，采用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量測(cè)量，結(jié)果以5個(gè)視野陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對(duì)小鼠耳部濕疹皮損程度及評(píng)分的影響 Control組，濕疹模型組，丹皮酚低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組耳部濕疹皮損評(píng)分分別為0分、（5.99±0.10）分、（4.88±0.09）分、（3.02±0.10）分、（2.05±0.09）分、（2.01±0.09）分（n=20，F(xiàn)=7 120.203，P＜0.01）。與Control 組相比，濕疹模型組小鼠耳部皮膚可見(jiàn)紅腫、角化結(jié)痂、滲出等損傷，皮損程度評(píng)分增加（P＜0.05）；與濕疹模型組相比，丹皮酚低、中、高劑量組耳部皮膚紅腫、角化結(jié)痂、滲出等損傷減輕，皮損程度評(píng)分降低（均P＜0.05），且丹皮酚各劑量組呈劑量依賴(lài)性；丹皮酚高劑量組與陽(yáng)性藥物組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 各組小鼠耳組織病理?yè)p傷程度觀察 Control組小鼠耳部皮膚組織結(jié)構(gòu)清楚，層次分明，表皮厚度正常；濕疹模型組小鼠表皮角化過(guò)度，真皮層可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；丹皮酚低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠表皮層角化及真皮層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善。見(jiàn)圖2。

2.3 丹皮酚對(duì)小鼠皮損組織中SP 含量的影響 與Control組相比，濕疹模型組小鼠耳部皮損組織SP表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與濕疹模型組相比，丹皮酚低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠耳部皮損組織SP 含量明顯降低（P＜0.05），且丹皮酚各劑量組呈劑量依賴(lài)性；丹皮酚高劑量組與陽(yáng)性藥物組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of SP contents and the expressions of NK1R and Tryptase between six groups表1 各組小鼠SP含量及NK1R、Tryptase表達(dá)結(jié)果比較（n=20，）

Tab.1 Comparison of SP contents and the expressions of NK1R and Tryptase between six groups表1 各組小鼠SP含量及NK1R、Tryptase表達(dá)結(jié)果比較（n=20，）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與濕疹模型組比較，c與丹皮酚低劑量組比較，d與丹皮酚中劑量組比較，P＜0.05

組別Control組濕疹模型組丹皮酚低劑量組丹皮酚中劑量組丹皮酚高劑量組陽(yáng)性藥物組F SP（ng/L）100.39±10.93 251.62±11.12a 201.00±12.13ab 174.82±11.16abc 144.55±10.96abcd 140.55±11.14abcd 442.620＊＊NK1R 0.39±0.13 1.62±0.12a 1.00±0.13ab 0.82±0.12abc 0.55±0.14abcd 0.54±0.14abcd 237.784＊＊Tryptase 0.32±0.14 1.86±0.16a 1.25±0.13ab 0.89±0.14abc 0.66±0.15abcd 0.67±0.15abcd 280.477＊＊

2.4 丹皮酚對(duì)小鼠皮損組織中NK1R 及Tryptase 表達(dá)的影響 與Control 組相比，濕疹模型組小鼠耳部皮損組織NK1R、Tryptase 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與濕疹模型組相比，丹皮酚低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠耳部皮損組織NK1R、Tryptase 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且丹皮酚各劑量組呈劑量依賴(lài)性；丹皮酚高劑量組與陽(yáng)性藥物組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1，圖3、4。

3 討論

3.1 各組小鼠模型建立情況及丹皮酚對(duì)濕疹模型小鼠的改善作用 濕疹是皮膚科常見(jiàn)炎癥性皮膚疾病，其發(fā)病率高，容易遷移，肥大細(xì)胞及炎癥介質(zhì)變態(tài)反應(yīng)參與濕疹的發(fā)病過(guò)程［14］。李雪松［15］發(fā)現(xiàn)丹皮酚軟膏可治療手部慢性濕疹，且在減輕手部脫屑、皸裂方面的療效優(yōu)于派瑞松。楊正生等［11］發(fā)現(xiàn)腹腔注射丹皮酚可治療小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎，降低其炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control 組相比，濕疹模型組小鼠肉眼可見(jiàn)耳部充血、腫脹等損傷，皮損程度評(píng)分明顯增高，HE 染色可見(jiàn)耳部皮損組織表皮角化、真皮水腫、炎癥浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，提示濕疹模型建立成功。與濕疹模型組相比，丹皮酚低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組小鼠耳部充血、腫脹等損傷減輕，皮損程度評(píng)分降低，表皮角化及真皮水腫、炎癥浸潤(rùn)等病理?yè)p傷程度明顯下降，表明丹皮酚可改善濕疹模型小鼠耳部組織紅腫、充血及表皮角化、真皮水腫等炎癥損傷。

3.2 丹皮酚對(duì)濕疹模型小鼠耳部組織SP 及NK1R表達(dá)的調(diào)控作用 SP 是皮膚肥大細(xì)胞重要的促分泌素，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒，促進(jìn)炎癥的發(fā)生［16］。NK1R 激活可介導(dǎo) SP 誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞募集，增強(qiáng)促炎反應(yīng)［17］。Tryptase是肥大細(xì)胞合成和分泌的特異性中性蛋白酶之一，常被用作肥大細(xì)胞活性標(biāo)志物，其陽(yáng)性表達(dá)可促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放活性物質(zhì)，增強(qiáng)炎癥狀態(tài)下結(jié)締組織重塑［18-20］。Choi 等［21］發(fā)現(xiàn)局部使用 SP 可緩解 DNCB 誘導(dǎo)的小鼠特異性皮炎癥狀。Zhan 等［5］發(fā)現(xiàn)SP 可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞積聚，濕疹患者中SP表達(dá)升高，而使用SP阻滯劑和NK1R阻滯劑可有效治療濕疹。李磊磊等［22］發(fā)現(xiàn)Tryptase 在斑禿患者皮損組織中表達(dá)增高，且Tryptase 陽(yáng)性表達(dá)的肥大細(xì)胞參與斑禿病理過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control 組相比，濕疹模型組小鼠耳部皮損組織中SP、NK1R、Tryptase 表達(dá)升高，提示濕疹模型小鼠SP、NK1R 表達(dá)增高，肥大細(xì)胞活性較高；而丹皮酚低、中、高劑量組小鼠耳部皮損組織中SP、NK1R、Tryptase 表達(dá)降低，且丹皮酚各組呈劑量依賴(lài)性，表明丹皮酚可抑制濕疹模型小鼠耳部皮損組織中SP、NK1R 表達(dá)，抑制肥大細(xì)胞活化，緩解濕疹小鼠皮膚炎性損傷。

綜上所述，丹皮酚可能通過(guò)抑制皮損組織中SP、NK1R 表達(dá)，抑制肥大細(xì)胞活化，緩解濕疹小鼠皮膚炎性損傷癥狀，為臨床治療濕疹提供一定的參考；但本研究也存在一定的不足，本研究未設(shè)置SP、NK1R 阻滯劑進(jìn)行研究，丹皮酚也可能通過(guò)其他途徑改善濕疹癥狀，這有待后續(xù)繼續(xù)研究。

Fig.1 Pictures showing eczema of ear skin of mice in three groups圖1 各組小鼠耳部皮膚濕疹圖

Fig.2 Pathological damage in ear tissue of mice in each group(HE,×200)圖2 各組小鼠耳部組織病理?yè)p傷情況（HE，×200）

Fig.3 Immunohistochemical staining of NK1R in ear tissue of mice in six groups(×400)圖3 各組小鼠耳部組織NK1R免疫組化染色結(jié)果（×400）

Fig.4 Immunohistochemical staining of Tryptase in the ear tissues of mice in six groups(×400)圖4 各組小鼠耳部組織Tryptase免疫組化染色結(jié)果（×400）