肖黃滿，尚海濤，張靜宇，郝成飛，劉軍艦，陳帥，張景虹，李忠廉△

梗阻性黃疸（obstructive jaundice，OJ）是由多種原因（如結(jié)石、腫瘤等）引起的膽管阻塞，出現(xiàn)皮膚、鞏膜進行性黃染伴小便發(fā)黃，可導(dǎo)致肝臟以及全身各系統(tǒng)一系列病理改變［1］。OJ可誘發(fā)膽汁淤積性肝損害，炎性細胞因子和游離氧自由基釋放，加劇肝損傷［2］。c-Jun氨基末端激酶（JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族的關(guān)鍵成員。研究表明，JNK信號蛋白與細胞凋亡過程密切相關(guān)［3］。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成員，可在凋亡的線粒體途徑中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）常在細胞凋亡時發(fā)生，其影響下游包括C/EBP同源蛋白（CHOP）、細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）、JNK和Bcl-2等蛋白的表達，參與調(diào)控細胞凋亡。加味大柴胡湯（MMDB）是在經(jīng)典方劑大柴胡湯（柴胡、黃芩、大黃、枳實、白芍、半夏、生姜）的基礎(chǔ)上加入茵陳、金錢草而成，已被證實能減輕OJ 大鼠中內(nèi)毒素所造成的肝損傷，下調(diào)瞬時受體電位通道（TRPC1）蛋白的表達，減輕鈣超載［4］。但加味大柴胡湯對肝細胞凋亡中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制是否有影響，特別是與JNK、Bcl-2信號蛋白的關(guān)系尚不明確。本研究通過加味大柴胡湯對OJ大鼠的干預(yù)，觀察大鼠肝功能及JNK、Bcl-2 信號蛋白的變化，進一步探討加味大柴胡湯對OJ 大鼠的影響，以期為OJ 肝損傷圍手術(shù)期的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康SPF級雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量220～260 g，購于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，飼養(yǎng)于干燥、通風(fēng)環(huán)境下，自由進食、飲水。中藥飲片購于天津市南開醫(yī)院中藥房，具體如下：柴胡15 g、黃芩10 g、大黃8 g、枳實10 g、白芍10 g、半夏10 g、生姜10 g、大棗10 g、茵陳25 g、金錢草15 g，每日1 劑，水煎 100 mL，所得 MMDB 含生藥量1 g/mL。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和血清總膽紅素（TBIL）試劑盒購自國藥生物化學(xué)研究所；兔源JNK、Bcl-2和β-actin一抗購于天津博誠科技公司；辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗購于美國Sigma 公司；其余常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純級別。TG16KR型低溫離心機購于長沙東旺實驗儀器有限公司；倒置相差顯微鏡購于日本Olympus 公司；JS-680D 型電泳、電轉(zhuǎn)、成像系統(tǒng)購于南京創(chuàng)睿儀器公司；VeritiFAST 型熒光定量PCR儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型建立及分組 將90 只健康成年SPF 級雄性大鼠編號，按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組（S 組）、OJ組（O組）和干預(yù)組（M組），每組30只。O組和M組均采用膽總管雙重結(jié)扎及離斷建立大鼠OJ 模型，實驗大鼠術(shù)前12 h禁食水，采取異氟烷吸入麻醉，經(jīng)腹正中沿劍突下切口進腹，牽拉十二指腸分離出膽總管，雙重結(jié)扎后離斷。S 組僅從相同部位入腹探查，游離膽總管并不予以結(jié)扎。S 組和O 組每日定時給予生理鹽水（10 μL/g）灌胃，M組在上述相同時間點給予加味大柴胡湯（10 μL/g）每日1次連續(xù)灌胃。于術(shù)后3 d、7 d、10 d，每組每次分別隨機取10只大鼠，采取異氟烷吸入麻醉，沿腹部正中進入腹腔，使用5 mL 注射器抽取腹主動脈血，離心后備用；充分顯露肝臟，剪開鐮狀韌帶至下腔靜脈前方，擠出大鼠肝臟。根據(jù)自然肝裂，取部分右肝下葉組織置于EP管中備用。

1.2.2 血清學(xué)分析 從大鼠腹主動脈血收集血液標(biāo)本靜置30 min 后3 000 r/min 離心10 min，用相應(yīng)試劑盒檢測AST、ALT、TBIL水平。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測肝組織中JNK、Bcl-2mRNA水平 以TRIzol一步法提取各組大鼠肝臟組織中的總RNA，除雜質(zhì)后反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，37 ℃ 50 min，85 ℃ 6 min，4 ℃ 6 min，-20 ℃保存。qPCR反應(yīng)體系為：SYBR Green Mix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，ROXⅡ校準(zhǔn)液0.4 μL，ddH2O 6.6 μL，cDNA 模板 1 μL，總體積為 20 μL。qPCR 條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，共50個循環(huán)。每組設(shè)置3個復(fù)孔。本實驗重復(fù)3次，以2-ΔΔCt法計算各目的基因的表達量，擴展引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence of real time PCR表1 實時定量PCR引物序列

1.2.4 免疫印跡法（Western blot）檢測肝組織中JNK、Bcl-2蛋白的表達 液氮研磨-80 ℃下保存的肝組織50 mg，加入1 mL RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），置于冰上裂解25 min，13 000 r/min離心30 min，吸上清液，測定樣品蛋白濃度，加入SDS-loading buffer，100 ℃金屬浴10 min，每孔上樣20 μg，進行電泳分析，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入JNK（1∶800）、Bcl-2（1∶2 000）和β-actin（1∶10 000）一抗4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶8 000）孵育1 h，洗膜，顯色液孵育2 min，成像儀上進行信號檢測，分析條帶。數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白陽性表達情況，計算比較各組蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 S組大鼠術(shù)后第2天大致恢復(fù)自主活動及飲食，反應(yīng)迅捷，耳朵、皮膚、尿液顏色正常；術(shù)后第3天解剖，可見大鼠腹腔手術(shù)區(qū)域輕度粘連，肝臟質(zhì)地軟，表面光滑；與術(shù)后7 d、10 d 解剖情況相比，未見明顯差異。O組大鼠術(shù)后第2天出現(xiàn)尾尖及耳緣黃染，精神狀態(tài)恢復(fù)較S組慢，活動能力差；可見大鼠尿液顏色變黃，食量及活動差；術(shù)后第3 天解剖大鼠見腹腔粘連較重，肝臟黃染明顯伴輕度腫大，結(jié)扎處近上部可見膽總管呈半透明囊狀擴張。M組大鼠術(shù)后第3天出現(xiàn)尾尖及耳緣輕度黃染，精神狀態(tài)恢復(fù)較慢，尿液顏色加深，食量及活動稍差；術(shù)后第3天解剖大鼠見腹腔粘連，肝臟黃染明顯伴輕度腫大，被膜緊張，膽總管擴張，與術(shù)后7 d、10 d解剖情況相比，上述現(xiàn)象加重。

2.2 各組大鼠血清AST、ALT、TBIL 水平比較 與S組同期比較，O 組及 M 組大鼠血清 AST、ALT、TBIL水平均升高（P＜0.05）；與O 組同期比較，M 組AST、ALT、TBIL水平均降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Serum AST,ALT and TBIL contents in three groups of rats表2 各組大鼠血清AST、ALT、TBIL水平 （n=10，）

Tab.2 Serum AST,ALT and TBIL contents in three groups of rats表2 各組大鼠血清AST、ALT、TBIL水平 （n=10，）

＊＊P＜0.01；a與S組比較，b與O組比較，P＜0.05

組別S組O組M組F AST（U/L）3 d 64.33±2.47 156.50±8.66a 118.64±10.50ab 333.823＊＊7 d 66.55±2.93 229.54±11.67a 163.13±13.63ab 609.740＊＊10 d 67.43±2.97 317.47±13.28a 208.32±12.28ab 1 405.108＊＊組別S組O組M組F ALT(U/L）3 d 30.64±2.92 95.87±6.38a 57.81±6.55ab 354.193＊＊7 d 32.37±3.48 153.51±6.49a 84.92±8.68ab 922.538＊＊10 d 33.66±2.84 237.52±8.89a 157.16±10.38ab 1 572.942＊＊組別S組O組M組F TBIL(μmol/L）3 d 10.57±1.41 48.73±3.31a 29.56±3.66ab 421.508＊＊7 d 11.27±1.38 78.51±4.48a 44.45±3.34ab 967.427＊＊10 d 12.88±1.57 97.71±5.01a 62.54±2.98ab 1 508.621＊＊

2.3 各組肝組織中JNK、Bcl-2mRNA 水平比較 O組、M組JNKmRNA水平均高于同期S組（P＜0.05）；M組JNKmRNA水平在同期均低于O組（P＜0.05）；O組、M組Bcl-2mRNA水平均低于S組（P＜0.05）；M組Bcl-2mRNA水平在同期均高于O組（P＜0.05），見圖1。

2.4 各組肝組織中JNK、Bcl-2 蛋白的表達水平比較 O 組、M 組JNK 蛋白表達水平在各時間點均高于S 組（P＜0.05）；M 組JNK 蛋白表達水平在各時間點均低于O 組（P＜0.05）；O 組、M 組Bcl-2 蛋白表達水平在各時間點均低于S 組（P＜0.05）；M 組Bcl-2蛋白表達水平在各時間點均高于O 組（P＜0.05）,見圖2、3。

Fig.1 The mRNA expressions of JNK and Bcl-2 in liver tissue of rats in each group圖1 各組大鼠肝組織JNK、Bcl-2 mRNA表達水平

Fig.2 The protein expressions of JNK and Bcl-2 in liver tissue of rats in each group圖2 各組大鼠肝組織JNK、Bcl-2蛋白表達水平

Fig.3 The expression levels of JNK and Bcl-2 in each group圖3 各組大鼠肝組織JNK、Bcl-2蛋白表達水平

3 討論

大柴胡湯是臨床上常用方劑之一，由柴胡、黃芩、大黃、枳實、白芍、半夏、生姜、大棗八味藥組成。在大柴胡湯中加味茵陳及金錢草，增加了利濕退黃的功效，既可疏利肝膽之氣滯，又可蕩滌腸胃之實熱［5］。黃疸病名首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》：“面色微黃，齒垢黃，爪甲上黃，黃疸也”［6］。其病因病機為：飲食無節(jié)或過量飲酒，或嗜食肥甘厚味，脾胃受損，脾健運功能減弱，化生無力，輸布水谷精微失調(diào)，濕濁而生，氣機受阻，郁而化熱，薰蒸肝膽，膽汁外溢乃發(fā)黃疸。OJ 是造成肝功能損害的主要原因，因膽道阻塞，膽汁流出受阻，膽汁聚集肝內(nèi)，引起肝細胞損傷和凋亡。AST、ALT、TBIL 等是較為敏感的肝細胞損傷指標(biāo)［7］。謝毅等［8］證實，精氨酸聯(lián)合加味大柴胡湯可能通過下調(diào)Toll樣受體4來降低內(nèi)毒素水平，從而減輕急性膽管炎大鼠的肝臟損害。陳念平等［9］發(fā)現(xiàn)大黃素能降低阻塞性黃疸時的腸道細菌移位率，對肝功能有明顯保護作用，可有效減輕OJ 時的肝纖維化。本研究結(jié)果顯示，O 組血清AST、ALT、TBIL 升高，在加味大柴胡湯干預(yù)后，上述指標(biāo)降低，表明加味大柴胡湯能改善模型大鼠的肝功能，減輕肝損傷。

為了探究ERS在OJ中的相關(guān)機制，本研究觀察了 MMDB 在 OJ 模型大鼠體內(nèi)對 JNK、Bcl-2 表達的影響。JNK是MAPK家族中的重要成員,在細胞ERS調(diào)節(jié)過程中起重要作用。JNK 被磷酸化激活后，能通過轉(zhuǎn)錄依賴或轉(zhuǎn)錄非依賴機制調(diào)控下游靶基因的表達或靶蛋白的活性而介導(dǎo)細胞凋亡［10］。JNK激活后可從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)位入核，通過磷酸化激活c-JUN、c-FOS 等轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達［11］。林銘斯［12］研究表明，加味茵芍散可通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-胰島素抵抗中的肌醇依賴酶1α（IRE1α）/JNK 信 號 通 路 抑 制 IRE1α 的 mRNA 及JNK1蛋白磷酸化表達水平，減輕非酒精性脂肪肝的病理變化程度。王茜等［13］發(fā)現(xiàn)，解毒護肝方對藥物性肝損傷大鼠有明顯的保護作用，其機制可能與調(diào)控Toll 樣受體3/TNF-α/JNK2 信號通路有關(guān)。本研究顯示，在術(shù)后3、7、10 d時OJ模型大鼠肝組織JNK的mRNA 及蛋白表達水平增強，加味大柴胡湯干預(yù)組在相同時間點，JNK表達減弱，表明黃疸模型組肝損傷凋亡明顯，加味大柴胡湯干預(yù)后可以減輕肝細胞的凋亡，這可能是通過抑制JNK的合成，減輕肝細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而緩解肝損傷凋亡。

Bcl-2 通常位于線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，其在ERS過程中表現(xiàn)出抑制細胞凋亡的作用［14］。JNK的凋亡誘導(dǎo)底物包括Bcl-2和Bim，它們分別可被JNK磷酸化抑制和激活［15-16］。目前，許多研究集中于Bcl-2 在調(diào)節(jié)T 細胞中三磷酸肌醇受體（IP3R）介導(dǎo)的Ca2+信號中的作用，因為TRPC1激活后IP3R 介導(dǎo)的Ca2+信號在免疫系統(tǒng)中具有非常重要的生理意義［17-18］。張貝貝等［19］發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖可通過抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞Bax的表達，增強Bcl-2的表達，從而抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡，在一定程度上可防治糖尿病血管病變。涂玥等［20］通過研究大黃附子湯，證實其可調(diào)節(jié)腎組織JNK/Bcl-2 信號通路，減少腎小管上皮細胞凋亡，改善腎間質(zhì)纖維化，最終延緩尿酸性腎病進展。與上述結(jié)果相似，本研究顯示，與假手術(shù)組相比，OJ 模型大鼠肝細胞中Bcl-2 的mRNA及蛋白表達水平降低，加味大柴胡湯干預(yù)后，Bcl-2蛋白水平較相同時間點模型大鼠高，表明O組大鼠肝組織發(fā)生損傷凋亡時，Bcl-2 表達下調(diào)，而加味大柴胡湯的干預(yù)又使Bcl-2 表達增加。因此，筆者考慮加味大柴胡湯可能通過調(diào)節(jié)JNK/Bcl-2 信號通路來減少肝細胞凋亡。

綜上所述，本研究雙重結(jié)扎大鼠膽總管成功建立OJ 大鼠肝損傷模型，血清AST、ALT、TBIL 水平及JNK、Bcl-2 表達水平發(fā)生變化，產(chǎn)生了ERS，加快細胞凋亡。加味大柴胡湯干預(yù)后能一定程度上改善大鼠肝功能，同時下調(diào)JNK 表達，提高Bcl-2 表達，這可能與調(diào)節(jié)JNK/Bcl-2 信號通路有關(guān)。加味大柴胡湯可通過減輕肝細胞的ERS，減少肝細胞凋亡，進而對肝臟起保護作用，但其是否通過其他氧化應(yīng)激反應(yīng)或途徑對肝細胞起到保護作用，尚待進一步研究。