鄒球龍,金 康,黎 琪,張?jiān)迄i,李曉敏,張忠鑫,印 鐵,*

(1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院,北京 102209;2.北京市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全源頭控制工程技術(shù)研究中心,北京 102209;3.蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,安徽蚌埠 233030;4.營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102209)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),又稱(chēng)嘔吐毒素,是谷物和飼料中常見(jiàn)的一種單端孢霉烯族毒素,主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生[1-3]。嘔吐毒素在代謝過(guò)程中抑制核酸和蛋白質(zhì)的合成,能引發(fā)人類(lèi)和動(dòng)物多種慢性疾病,如腸道炎癥、發(fā)育不良和生殖系統(tǒng)紊亂等,已經(jīng)被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為三類(lèi)致癌物之一[4-7]。目前,谷物中嘔吐毒素的脫除方法主要為物理吸附和理化降解等,當(dāng)前已知的物理吸附劑對(duì)嘔吐毒素吸附效果不佳,且吸附作用不具有特異性,容易造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失且毒素并沒(méi)未完全被降解,仍可能造成環(huán)境的二次污染;采用臭氧、紫外、輻照等理化手段對(duì)嘔吐毒素進(jìn)行降解的谷物,存在引入外源污染及降解產(chǎn)物安全性不明等問(wèn)題而被禁止作為食品及飼料原料進(jìn)入市場(chǎng)[8]。

由于生物脫毒法具有條件溫和、安全高效等特點(diǎn),我國(guó)允許將毒素超標(biāo)的糧食通過(guò)生物法脫除至限量標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)進(jìn)入飼料領(lǐng)域。隨著物理、化學(xué)脫毒手段弊端的不斷出現(xiàn)和人們對(duì)迅猛發(fā)展的生物技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的認(rèn)識(shí)增加,國(guó)內(nèi)外利用微生物進(jìn)行真菌毒素脫毒的研究正在逐步展開(kāi),而且相關(guān)研究成果表現(xiàn)出了良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景[8-12]。以嘔吐毒素的生物脫毒為例,動(dòng)物胃腸道微生物可將DON去環(huán)氧化,變成DOM-1,但是由于培養(yǎng)條件等限制并未得到純化菌株[13-15]。塔賓曲霉能夠通過(guò)羥基化對(duì)DON進(jìn)行轉(zhuǎn)化,但轉(zhuǎn)化產(chǎn)物未鑒定[16]。JUN等研究發(fā)現(xiàn)一株農(nóng)桿菌屬根瘤菌能夠?qū)ON氧化成3-keto-DON,使其毒性降至DON的十分之一以下[17]。Yoko等從麥田中分離到一株特殊的諾卡氏菌WSN05-2,它能將DON差向異構(gòu)化成3-epi-DON[18]。Karl等鑒定了水稻中的一個(gè)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶,通過(guò)在第3位C的羥基上連上一個(gè)葡萄糖基,來(lái)減小DON毒性[19]。近年來(lái)研究表明德沃斯氏菌(Devosiasp.)可以安全高效脫除嘔吐毒素,其產(chǎn)生兩種酶(DepA和DepB),DepA為氧化酶,DepB為還原酶,通過(guò)一步氧化與一步還原反應(yīng)達(dá)到將DON中3位羥基差向異構(gòu)的效果,形成嘔吐毒素立體異構(gòu)體(3-epi-DON),是目前已知的較為安全的嘔吐毒素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[20-24]。

發(fā)酵液中菌體濃度與其脫毒效率正相關(guān),本研究針對(duì)德沃斯氏菌生物量低導(dǎo)致脫毒成本高的問(wèn)題,通過(guò)響應(yīng)面方法對(duì)1株德沃斯氏菌(Devosiasp. 1.10745)的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,以期為進(jìn)一步利用德沃斯氏菌進(jìn)行DON生物脫毒的相關(guān)工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德沃斯氏菌(Devosiasp.)1.10745 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種保藏中心(CGMCC);酵母浸粉 安琪酵母股份有限公司;酵母膏 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨 英國(guó)OXOID公司;DON標(biāo)準(zhǔn)品 青島普瑞邦生物工程有限公司;磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵、硫酸錳等其他試劑 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf股份有限公司;MQD-B2T振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司;UV-8000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司);SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基):酵母提取物(5 g/L)、胰蛋白胨(10 g/L)、NaCl(10 g/L),121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:碳、氮源種類(lèi)和添加量按照各實(shí)驗(yàn)的方案設(shè)計(jì)配制;初始培養(yǎng)基母液無(wú)機(jī)鹽及微量元素添加量:磷酸氫二鉀2 g/L,硫酸銨3 g/L,硫酸鎂1 g/L,氯化鈣0.01 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L,硫酸錳0.01 g/L,pH7.0,115 ℃滅菌30 min。

1.2.2Devosiasp.培養(yǎng)條件 種子和發(fā)酵均采用250 mL三角瓶于30 ℃進(jìn)行搖瓶(240 r/min)培養(yǎng)。其中,種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)長(zhǎng)分別為24和40 h;種子及發(fā)酵培養(yǎng)基體積均為50 mL。

1.2.3 生物量的測(cè)定 德沃斯氏菌的發(fā)酵生物量以搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后液體培養(yǎng)基的OD600表示。

1.2.4 碳、氮源單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的選擇 在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,固定氮源(酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L)與無(wú)機(jī)鹽(NaCl 10 g/L)添加量水平,分別選取葡萄糖(10 g/L)、蔗糖(10 g/L)與糊精(10 g/L)3種物質(zhì)作為碳源,研究碳源種類(lèi)對(duì)Devosiasp.生長(zhǎng)的影響。

1.2.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的選擇 根據(jù)前期碳源單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定以蔗糖作為碳源,再選取酵母浸粉(安琪酵母,FM888)、酵母膏或玉米漿干粉混合作為氮源?；旌系粗?種物質(zhì)的添加量如表1所示,第9組為對(duì)照初始培養(yǎng)基。

1.2.5 部分因子試驗(yàn) 基于前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取蔗糖、酵母浸粉、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣以及硫酸亞鐵共8個(gè)因素,各因素均分別設(shè)計(jì)2個(gè)水平。采用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行部分因子試驗(yàn)(FFD,Fractional Factorial Design)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析與模型的建立,篩選影響德沃斯氏菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵培養(yǎng)基成分。培養(yǎng)基其它成分的添加量與原配方保持一致。8個(gè)因素的編碼及水平見(jiàn)表2。

表2 部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼及水平Table 2 Part factor test design factor coding and level

1.2.6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)FFD試驗(yàn)結(jié)果中顯著因子的效應(yīng)大小選取A(酵母浸粉)、B(酵母膏)與C(蔗糖)3個(gè)最大影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn),并確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和步長(zhǎng)。具體因素及水平見(jiàn)表3，硫酸胺、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣和硫酸亞鐵分別為2、2、0.7、0.02和0.02 g/L。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Experiment design for steepest climb

1.2.7 中心組合試驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的酵母浸粉、酵母膏和蔗糖3個(gè)因素的中心點(diǎn)分別為6、8和10 g/L。培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽及微量元素添加量同最陡爬坡試驗(yàn)。采用CCD(Central composite experimental design)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),編碼及水平見(jiàn)表4。

表4 中心組合實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 4 Central combination of experimental factors and levels

1.2.8 菌體對(duì)DON脫毒效果驗(yàn)證 將優(yōu)化后及對(duì)照組的菌液同時(shí)稀釋至OD600=2,分別取250 mL加入等體積的10 ppm的嘔吐毒素(最終生物量為OD600=1、DON為5 ppm),30 ℃反應(yīng)0.5h及1 h之后,同時(shí)加入0.5 mL甲醇終止反應(yīng),離心取上清進(jìn)行液相色譜檢測(cè)DON濃度并計(jì)算毒素脫除率。

1.2.9 DON的液相色譜檢測(cè)條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 SHIMADZU 5 μm C18反相柱(250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相為甲醇/水(體積比20/80),流速為1 mL/min;紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng)218 nm。取DON儲(chǔ)備液(1000 ppm)用流動(dòng)相分別稀釋至0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5和10 ppm的工作液,進(jìn)樣20 μL,重復(fù)測(cè)定三次取平均值。根據(jù)濃度與峰面積關(guān)系繪制DON標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出方程為:DON含量(y)=峰面積(x)/10412,決定系數(shù)R2=0.9994,此方程具有良好的線性關(guān)系。

1.2.10 DON脫除率計(jì)算 DON脫除率=(脫除前DON濃度-脫除之后DON濃度)/脫除前DON濃度×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)定重復(fù)3次取平均值,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和Design Expert 7.0等軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳、氮源單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 碳源的確定 培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分是菌種賴(lài)以生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ),碳源是微生物培養(yǎng)基的主要成分之一,它既是微生物生命活動(dòng)所需要的能源物質(zhì),同時(shí)又是代謝產(chǎn)物和構(gòu)成菌體細(xì)胞的主要元素的來(lái)源。如圖1所示,選用蔗糖作為碳源時(shí),Devosiasp.的OD600顯著(P<0.05)高于葡萄糖和糊精,故選擇蔗糖作為下一步試驗(yàn)的碳源。

圖1 碳源對(duì)生物量的影響Fig.1 Effect of carbon source on biomass注:不同小寫(xiě)字母表示具有顯著性差異,P<0.05。

2.1.2 氮源的確定 培養(yǎng)基中的氮源可以為微生物的生命活動(dòng)提供氮元素,用以合成蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等生命大分子物質(zhì)。如表5所示,第1、3、4號(hào)搖瓶中Devosiasp.的OD600值相對(duì)較高,且以第4號(hào)>第1號(hào)>第3號(hào)。綜合考慮成本與氮源物質(zhì)的穩(wěn)定性,選擇第1號(hào)酵母浸粉與酵母膏的組合作為部分因子試驗(yàn)中的基本氮源組成。

表5 氮源對(duì)生物量的影響Table 5 Effects of nitrogen sources on biomass

2.2 根據(jù)部分因子試驗(yàn)結(jié)果篩選主要因素

FFD試驗(yàn)可在多個(gè)影響因素中快速且有效地篩選出相對(duì)較為重要的因素,并提供如何組合該因素以改進(jìn)工藝的有效信息。如表6所示,采用Design Expert 7.0軟件對(duì)FFD試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各因素的主要效應(yīng)分析見(jiàn)表7。

表6 部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Rsults of part factor test design

表7 各因素的主要效應(yīng)Table 7 Main effect of each factor

通過(guò)方差分析,模型F值是5.25，P<0.05,表明模型是顯著的,由試驗(yàn)結(jié)果可知,在部分因子試驗(yàn)的培養(yǎng)基成分中,對(duì)德沃斯氏菌生物量有顯著影響的因素為B、AB和H。盡管A的影響未達(dá)差異顯著水平,但由于其與B的交互作用顯著,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)仍選用A作為考察的影響因素。

根據(jù)FFD試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,利用Design Expert 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,以Devosiasp.的生物量(以O(shè)D600表示)為響應(yīng)值,得到回歸方程為Y=3.58+0.1A+0.15B+0.004973C-0.069D-0.003286E+0.02F+0.006602G+0.22H-0.11AB。

由于部分因子試驗(yàn)無(wú)法確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否在最佳響應(yīng)值區(qū)域,因此,選取酵母浸粉、酵母膏和蔗糖作為影響因子進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn),以確定這3個(gè)因素的最優(yōu)響應(yīng)值區(qū)域；根據(jù)回歸方程系數(shù)判定，酵母浸粉、酵母膏與蔗糖均為正效應(yīng)，故應(yīng)增加其添加量。由于在FFD試驗(yàn)中，其余成分不具有顯著性，因此將其余成分固定在零水平,即磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸銨2 g/L、硫酸鎂0.7 g/L、氯化鈣0.02 g/L、硫酸亞鐵0.02 g/L。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡法的爬坡方向即為實(shí)驗(yàn)值的變化方向,變化步長(zhǎng)由各因素效應(yīng)值的大小決定,能經(jīng)濟(jì)、快速地接近最佳響應(yīng)值區(qū)域。最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,第2號(hào)的OD600達(dá)到最高,故選擇第2號(hào)的培養(yǎng)基添加量作為中心組合實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn),即酵母浸粉(A)6 g/L,酵母膏(B)8 g/L,蔗糖(C)10 g/L。

表8 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of steepest climb

2.4 中心組合試驗(yàn)及響應(yīng)面分析

響應(yīng)面法是目前最常用的微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法之一,可用于確定各因素及其交互作用在工藝過(guò)程中對(duì)指標(biāo)(響應(yīng)值)的影響,較為精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系,優(yōu)化各因素響應(yīng)值到最佳水平,以縮短優(yōu)化時(shí)間和提高應(yīng)用的可信度。

為檢驗(yàn)該三次多元回歸方程的有效性,進(jìn)一步對(duì)生物量的顯著性和多元回歸模型的方差進(jìn)行分析,其分析結(jié)果見(jiàn)表10。由表10可知,回歸模型檢驗(yàn)的P<0.01,表示該回歸模型極顯著;失擬項(xiàng)P>0.05為不顯著,決定系數(shù)R2=0.997,說(shuō)明回歸模型與實(shí)際情況擬合程度高,適合解釋和預(yù)測(cè)生物量。

表9 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 9 Results of central combination of experiment

表10 多元回歸模型方差分析表Table 10 Analysis of varianceanalysis of multiple regression model

由圖2可知,酵母浸粉和酵母膏對(duì)生物量的影響,其響應(yīng)面圖曲面坡度陡峭,等高線趨于橢圓形,說(shuō)明酵母浸粉和酵母膏交互作用對(duì)生物量的影響大,交互作用顯著。同理,由圖3和圖4可知,蔗糖與酵母浸粉和酵母膏的交互等高線圖呈明顯的橢圓形,說(shuō)明交互作用對(duì)生物量有顯著影響。

圖2 三次線性模型中酵母浸粉和酵母膏的響應(yīng)面和對(duì)應(yīng)的等高線Fig.2 Response surface plot and corresponding contour map of yeast extracts powder and yeast extract in the cubic linear model

圖3 三次線性模型中酵母浸粉和蔗糖的響應(yīng)面和對(duì)應(yīng)的等高線Fig.3 Response surface plot and corresponding contour map of yeast extracts powder and sucrose in the cubic linear model

圖4 三次線性模型中酵母膏和蔗糖的響應(yīng)面和對(duì)應(yīng)的等高線Fig.4 Response surface plot and corresponding contour map of yeast extracts and sucrose in the cubic linear model

通過(guò)數(shù)據(jù)分析得到回歸模型存在最大值點(diǎn),Y的最大估計(jì)值為21.62,各個(gè)因素的取值分別為酵母浸粉10.00 g/L,酵母膏6.49 g/L,蔗糖8.40 g/L。在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),共進(jìn)行4個(gè)重復(fù),得到OD平均值為21.66,與預(yù)測(cè)值21.62的相對(duì)誤差為0.185%。可見(jiàn),使用該回歸模型優(yōu)化德沃斯氏菌發(fā)酵培養(yǎng)基成分是可行的。

2.5 菌體對(duì)DON脫毒效果驗(yàn)證

在生物量為OD600=1、DON濃度為5 ppm的條件下,優(yōu)化前后單位菌體對(duì)DON的降解效率差異不顯著(圖5),故生物量提高也就直接反映出其脫毒能力的提高。

圖5 單位菌體對(duì)DON脫毒效率比較Fig.5 Compared with the detoxification efficiency of bacteria to DON

3 結(jié)論

本文以反應(yīng)脫毒效率的生物量為指標(biāo),通過(guò)碳源、氮源單因素試驗(yàn)確定了Devosiasp.生長(zhǎng)的最適碳、氮源及其添加量,利用部分因子試驗(yàn)選出酵母浸粉、酵母膏和蔗糖3個(gè)最大影響因素,經(jīng)最陡爬坡試驗(yàn)確定了3個(gè)因素水平的最佳響應(yīng)區(qū)域,再通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn),對(duì)最大影響因素建立了二次多元回歸模型,優(yōu)化了因素水平,得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:酵母浸粉10.00 g/L,酵母膏6.49 g/L,蔗糖8.40 g/L,硫酸銨2 g/L,磷酸二氫鉀2 g/L,硫酸鎂0.7 g/L,氯化鈣0.02 g/L和硫酸亞鐵0.02 g/L。經(jīng)驗(yàn)證,所得OD600為21.66,與預(yù)測(cè)值21.62基本相符,相對(duì)最初生物量(OD600)增長(zhǎng)了89.1%,即優(yōu)化后的發(fā)酵液對(duì)DON的脫除效率增加了89.1%。由此可見(jiàn),通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化德沃斯氏菌發(fā)酵培養(yǎng)基是行之有效的。后續(xù)將在此結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)行補(bǔ)料批次發(fā)酵條件優(yōu)化,進(jìn)一步提高Devosiasp.發(fā)酵培養(yǎng)的生物量,為該嘔吐毒素脫毒菌株工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。