帥 良,廖玲燕,段振華,宋慕波,梁園麗,謝玉花,劉云芬

(賀州學(xué)院,食品與生物工程學(xué)院/食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院,廣西賀州 542899)

百香果(PassifloraeduliaSims)是西番蓮科西番蓮屬的草質(zhì)藤本植物,廣泛種植于熱帶亞熱帶地區(qū),是我國(guó)主要的熱帶水果之一[1-2]。百香果是典型的藥食同源的高品質(zhì)水果,具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。目前百香果主要用作鮮食,其余用來(lái)生產(chǎn)果汁,而果皮則被作為廢棄物處理。實(shí)際上,百香果果皮約占鮮果重50%～55%,有研究表明,百香果果皮中含有豐富的碳水化合物、多糖、黃酮及酚類(lèi)物質(zhì),特別是果膠和粗纖維含量較高[3-4],因此有必要對(duì)百香果果皮進(jìn)行進(jìn)一步加工利用。

多糖廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中,具有多種藥理活性[5],例如抗氧化衰老[6]、抗腫瘤[7]、增強(qiáng)免疫力[8]等。提取植物多糖的方法很多:熱水浸提法[9-10]、稀酸提取法[11]、微波提取法[12-13]、超高壓提取法[14]、亞臨界提取法[15]等。這些方法有的成本低,操作簡(jiǎn)便,但效率很低;有的需要嚴(yán)格控制試劑用量,有的則對(duì)設(shè)備要求高,而超聲波提取法[16]可以有效縮短提取時(shí)間,排除其他溶劑的干擾,增大提取效率,原因可能是超聲波可以產(chǎn)生熱效應(yīng)和機(jī)械剪切效應(yīng),加速物質(zhì)在溶劑中的擴(kuò)散溶解,空化效應(yīng)可以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),加速多糖的溶解,且超聲波還能產(chǎn)生其他次級(jí)效應(yīng),如熱效應(yīng)、乳化效應(yīng)、凝聚效應(yīng)以及化學(xué)效應(yīng)等[17]。近年來(lái),采用超聲波提取方法已經(jīng)從多種生物中提取出了多糖,如紫蘇葉[18]、毛木耳[19]、口蘑[20]等。

百香果果皮多糖的傳統(tǒng)提取方法有微波提取[2]、熱水浸提法[21],也有用超聲波提取百香果果膠的報(bào)道[22],但利用超聲波提取百香果果皮多糖的工藝及多糖體外抗氧化活性的研究報(bào)道較少。

本研究采用超聲波法提取百香果果皮多糖,通過(guò)進(jìn)行液料比、超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度4個(gè)單因素試驗(yàn)來(lái)確定影響多糖得率的主要因素,采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,并對(duì)多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行分析,為百香果果皮的進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫百香果 購(gòu)買(mǎi)于廣西壯族自治區(qū)賀州市水果批發(fā)市場(chǎng),本研究取其干燥果皮作為供試材料;三氯甲烷 分析純,廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究中心;苯酚、抗壞血酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵 分析純,成都市科龍化工試劑廠(chǎng);硫酸、水楊酸 分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 色譜純,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;鐵氰化鉀 分析純,汕頭市光華化學(xué)廠(chǎng);磷酸二氫鈉 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;活性炭、正丁醇、過(guò)氧化氫、磷酸氫二鈉、無(wú)水乙醇 分析純,廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心;三氯乙酸、無(wú)水葡萄糖 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)。

KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;KDC-40低速離心機(jī) 安徽中佳科學(xué)儀器有限公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;FA2004B電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波輔助法提取果皮多糖 提取方法參考張麗紅[18]和黎云龍等[23],略有修改。稱(chēng)取1 g百香果干燥果皮粉末于50 mL錐形瓶中,按照一定液料比加水,在一定超聲功率和超聲溫度下,超聲一定時(shí)間,抽濾得到粗多糖提取液。向上述提取液加入0.5 g活性炭,攪拌均勻,40 ℃恒溫水浴加熱15 min,抽濾得到多糖脫色液。Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1,mL/mL)與多糖脫色液等體積混合,用磁力攪拌器震蕩35 min,再3000 r/min 離心10 min,收集上清液即為脫色脫蛋白的多糖提取液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在超聲功率150 W、超聲時(shí)間20 min、超聲溫度60 ℃時(shí),考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL∶g)對(duì)百香果果皮多糖得率的影響;在液料比40∶1 mL∶g、超聲時(shí)間20 min、超聲溫度60 ℃時(shí),考察超聲功率(50、100、150、200、250 W)對(duì)百香果果皮多糖得率的影響;在液料比40∶1 mL∶g、超聲功率150 W、超聲溫度60 ℃時(shí),考察超聲時(shí)間(15、20、25、30、35 min)對(duì)百香果果皮多糖得率的影響;在液料比40∶1 mL∶g、超聲功率150 W、超聲時(shí)間20 min時(shí),考察超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)對(duì)百香果果皮多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以液料比(A)、超聲功率(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲溫度(D)為主要影響因素,多糖得率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnen試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,按照表1進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 多糖得率的測(cè)定 多糖得率的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[24]。稱(chēng)取1 g標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖(使用前于105 ℃烘干至恒重),用少量水溶解后定容至1 L,于4 ℃冰箱中保存。使用時(shí)稀釋4倍得250 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(μg/mL),在490 nm處測(cè)得的吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

吸取1 mL脫色脫蛋白多糖提取液,稀釋40倍后參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定方法測(cè)定多糖得率,平行測(cè)定5次,并根據(jù)公式(1)計(jì)算百香果果皮多糖的得率:

式(1)

式中：x-標(biāo)曲上對(duì)應(yīng)濃度(mg/mL);V1-為比色測(cè)定時(shí)吸取樣液體積(1 mL);V2-為提取液總體積(mL);N-為稀釋倍數(shù)(40);m-為百香果果皮質(zhì)量(g)。

1.2.5 百香果果皮多糖抗氧化活性分析

1.2.5.1 百香果果皮多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定 測(cè)定方法參考蔣得旗等[25]、She等[26]的方法,略有改動(dòng)。準(zhǔn)確移取2 mL 0.2 mol/L DPPH溶液,分別加入1.2 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣液(0、0.5、1、1.5、2 mg/mL),充分混勻后,于室溫黑暗條件下放置30 min,取上清液測(cè)定517 nm處的吸光值A(chǔ)2,同法測(cè)定樣液加無(wú)水乙醇的吸光值A(chǔ)1以及純水加DPPH溶液的吸光值A(chǔ)0,按照公式(2)計(jì)算百香果多糖對(duì)DPPH自由基的清除率。配制同濃度的維生素C(VC)溶液且按照上述操作步驟進(jìn)行VC對(duì)DPPH自由基的清除率的測(cè)定,與百香果多糖對(duì)DPPH自由基的清除率進(jìn)行對(duì)比。

式(2)

1.2.5.2 百香果果皮多糖對(duì)羥自由基的清除能力測(cè)定 測(cè)定方法參考李霞等[2]、廖玲燕等[27]的方法,略有改動(dòng)。依次向具塞試管中準(zhǔn)確移取0.5 mL 0.15 mol/L的FeSO4溶液、2 mL 2 mmol/L的水楊酸溶液、2.5 mL蒸餾水和1 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣液(0、0.5、1、1.5、2 mg/mL),充分混勻后加入1 mL 6 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng),于37 ℃下反應(yīng)1 h,取上清液在510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)2,同法測(cè)定用水代替H2O2溶液的吸光值A(chǔ)1,以及用水代替樣液的吸光值A(chǔ)0,按照公式(3)計(jì)算百香果多糖對(duì)羥自由基的清除率。配制同濃度的VC溶液且按照上述操作步驟進(jìn)行VC對(duì)羥自由基的清除率的測(cè)定,與百香果多糖對(duì)羥自由基的清除率進(jìn)行對(duì)比。

式(3)

1.2.5.3 百香果果皮多糖還原力的測(cè)定 具體操作參考廖玲燕[27]等的方法,略有改動(dòng)。準(zhǔn)確移取1 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣液(0、0.5、1、1.5、2 mg/mL),依次加入0.2 mL 0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液和0.5 mL 1%的K3Fe(CN)6,震蕩混勻,50 ℃下水浴20 min后取出,快速冷卻,加入1 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng),取0.1 mL上清液加入0.2 mL1%的FeCl3和3 mL蒸餾水,充分搖勻后靜置5 min,于700 nm處測(cè)定吸光值,用吸光值表示還原力。配制同濃度的VC溶液且按照上述操作步驟進(jìn)行VC的還原力測(cè)定,并與百香果多糖還原力進(jìn)行對(duì)比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)隨機(jī)重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,用Excel 2016軟件進(jìn)行作圖,方差分析采用SPSS 19.0進(jìn)行,顯著水平P<0.05,極顯著水平P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)百香果果皮多糖得率的影響 由圖1可知,多糖得率隨著液料比的增大呈增大趨勢(shì),原因可能是多糖屬于水溶性物質(zhì),溶劑越多,溶解多糖能力越強(qiáng),在液料比達(dá)到40∶1時(shí),得率達(dá)到最大,為5.441%;此后液料比的增大使得吸附作用增強(qiáng)從而導(dǎo)致多糖提取率略有下降[28],因此最佳提取液料比選擇40∶1 mL/g。

圖1 液料比對(duì)百香果果皮多糖得率的影響Fig.1 Effect of the liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharide from passion fruit peel

2.1.2 超聲功率對(duì)百香果多糖得率的影響 由圖2可知,當(dāng)超聲功率在50～150 W時(shí),得率呈上升趨勢(shì),在150 W時(shí)達(dá)到最大為5.432%;此后超聲功率增大,得率略有降低,也有可能是由于超聲功率過(guò)大,導(dǎo)致溫度過(guò)高,多糖被氧化破壞,產(chǎn)生雜質(zhì),致使提取率下降[29],所以選擇提取功率為150 W。

圖2 超聲功率對(duì)百香果果皮多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharide from passion fruit peel

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)百香果多糖得率的影響 由圖3可知,當(dāng)超聲時(shí)間在15～20 min時(shí),多糖得率增大,20 min時(shí)達(dá)到最大值為5.484%,可能原因是隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用增大,多糖溶解增多;此后隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),得率維持在一個(gè)較低水平,原因可能是超聲波的空化作用和機(jī)械作用造成多糖分子的降解和破壞,使大量雜質(zhì)滲出,導(dǎo)致提取率下降[30]。因此選擇適宜的超聲時(shí)間為20 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)百香果果皮多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharide from passion fruit peel

2.1.4 超聲溫度對(duì)百香果多糖得率的影響 由圖4可知,隨著超聲溫度的上升,多糖得率呈先升后降的趨勢(shì),在60 ℃時(shí)得率達(dá)最大值為5.405%。造成這種現(xiàn)象的原因可能是溫度升高,分子熱運(yùn)動(dòng)加快,使多糖能夠快速溶解,而溫度過(guò)高,則引起多糖的氧化分解[30]。所以最佳提取溫度為60 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)百香果果皮多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of polysaccharide from passion fruit peel

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 回歸模型的建立與分析 用Design-Expert 8.0軟件隨機(jī)產(chǎn)生BOX-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,對(duì)考察因素及其水平進(jìn)行設(shè)計(jì),并測(cè)得29次的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示,統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得超聲波提取多糖提取率對(duì)自變量(液料比、超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度)的二次多項(xiàng)回歸模型方程為Y=5.06+0.97A+0.027B+0.10C-0.033D+0.12AB-0.027AC-0.31AD-0.094BC-0.0025BD+0.054CD-0.30A2-0.0278B2-0.037C2-0.16D2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

由表3可以看出,此模型P<0.001,達(dá)到高度顯著水平;失擬項(xiàng)P=0.1190,不顯著,模型的確定系數(shù)R2=0.9667,說(shuō)明模型的擬合程度良好。且由各因素一次項(xiàng)F值可知影響多糖得率的因素的主次順序?yàn)?液料比(A)>超聲時(shí)間(C)>超聲功率(D)>超聲溫度(B)。一次項(xiàng)液料比A和二次項(xiàng)A2對(duì)多糖得率影響達(dá)到高度顯著水平(P<0.001),交互項(xiàng)AD對(duì)多糖得率影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)二次項(xiàng)D2對(duì)多糖得率影響達(dá)到顯著水平(P<0.05),其他項(xiàng)均不顯著。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Various analysis of response surface design

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)回歸分析結(jié)果做出體現(xiàn)另外兩個(gè)因素及其交互作用影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)3D圖,如圖5～圖10所示。響應(yīng)曲面坡度的陡峭程度表明隨著影響因素的變化,其對(duì)應(yīng)響應(yīng)值的變化情況,如果坡度相對(duì)平緩,表明響應(yīng)值可以忍受條件的變化;如果坡度較陡,表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的變化非常敏感;而等高線(xiàn)的情況可以反映出交互作用的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素的交互作用顯著,圓形則相反[31]。

圖5 液料比和超聲溫度對(duì)多糖提取效果影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surfaces and contours for liquid-solid ratio and ultrasonic temperature effects on polysaccharide extraction

由圖5可知,響應(yīng)曲面陡峭,液料比與超聲溫度的交互作用對(duì)多糖得率的影響較大,從等高線(xiàn)形狀可以看出液料比對(duì)多糖得率的影響較大。

由圖6可知,響應(yīng)曲面陡峭,液料比與超聲時(shí)間的交互作用的作用對(duì)多糖得率的影響較大,從等高線(xiàn)形狀可以看出液料比對(duì)多糖得率的影響較大。

圖6 液料比和超聲時(shí)間對(duì)多糖提取效果影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surfaces and contours for liquid-solid ratio and ultrasonic time effects on polysaccharide extraction

由圖7可知,響應(yīng)曲面陡峭,液料比和超聲功率的交互作用對(duì)百香果果皮多糖得率的影響顯著,從等高線(xiàn)形狀可以看出液料比對(duì)多糖得率的影響較大。

圖7 液料比和超聲功率對(duì)多糖提取效果影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surfaces for liquid-solid ratio and ultrasonic power effects on polysaccharide extraction

由圖8可知,響應(yīng)曲面陡峭,超聲溫度和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)百香果果皮多糖得率的影響較大,但不顯著,從等高線(xiàn)地形狀可知超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響較大。

圖8 超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)多糖提取效果影響的響應(yīng)面Fig.8 Response surfaces for ultrasonic temperature and ultrasonic time effects on polysaccharide extraction

由圖9可知,響應(yīng)曲面陡峭,超聲溫度和超聲功率的交互作用對(duì)百香果果皮多糖得率的影響較大,但不顯著,從等高線(xiàn)形狀可知超聲功率對(duì)多糖得率的影響較大。

圖9 超聲溫度和超聲功率對(duì)多糖提取效果影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surfaces for ultrasonic temperature and ultrasonic power effects on polysaccharide extraction

由圖10可知,響應(yīng)曲面陡峭,超聲時(shí)間和超聲功率的交互作用對(duì)百香果果皮多糖得率的影響較大,但不顯著,從等高線(xiàn)形狀可知超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響較大。

圖10 超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)多糖提取效果影響的響應(yīng)面Fig.10 Response surfaces for ultrasonic time and ultrasonic power effects on polysaccharide extraction

2.2.3 最佳提取工藝的驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面模型及數(shù)據(jù)結(jié)果,分析得到超聲提取百香果果皮多糖的最佳提取工藝條件:料液比50∶1 (mL/g),超聲溫度69.98 ℃,超聲時(shí)間17.16 min,超聲功率100.01 W,預(yù)測(cè)百香果果皮多糖得率為6.09%,同時(shí)考慮到實(shí)際操作的局限性,將工藝參數(shù)修正為液料比為49∶1 (mL/g),超聲溫度為69 ℃,超聲時(shí)間為15 min,超聲功率為105 W。在此修正條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得百香果果皮多糖的平均得率為5.890%,與預(yù)測(cè)結(jié)果接近,提示本響應(yīng)面法得到的回歸模型有效、可靠,得到的工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 百香果果皮多糖體外抗氧化能力分析

2.3.1 百香果果皮多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的影響 由圖11可知,隨著質(zhì)量濃度的增大,百香果果皮多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸提高,在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí),清除率為32.8%,IC50為3.149 mg/mL,清除率相對(duì)較低,可能原因是多糖純度不夠[32];而VC對(duì)DPPH的清除率在0～0.5 mg/mL的范圍內(nèi)急劇增加,達(dá)到95.9%,此后維持在此水平。

圖11 百香果果皮多糖對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig.11 The scavenging effect of polysaccharide from passion fruit peel on DPPH radical

2.3.2 百香果果皮多糖對(duì)羥自由基清除能力的影響 如圖12所示,隨著質(zhì)量濃度的升高,果皮多糖對(duì)羥自由基的清除能力呈上升趨勢(shì)。當(dāng)濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí),清除率為59%,IC50為1.436 mg/mL。而VC對(duì)羥自由基的清除能力在0～1.5 mg/mL的范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì),在1.5 mg/mL時(shí)達(dá)到100%。

圖12 百香果果皮多糖對(duì)羥自由基清除能力的影響Fig.12 The scavenging effect of polysaccharide from passion fruit peel on hydroxyl radical

2.3.3 百香果果皮多糖還原能力的影響 如圖13所示,在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),VC和百香果果皮多糖的還原能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)。當(dāng)濃度為2 mg/mL時(shí),VC和百香果果皮多糖的吸光值分別為1.679、0.34,雖然多糖還原能力較VC弱,但也表現(xiàn)一定的還原能力,原因可能是多糖中含有酚類(lèi)等物質(zhì),這些物質(zhì)在多糖的還原性中起作用。

圖13 百香果果皮多糖還原能力Fig.13 Reducing force of polysaccharide from passion fruit peel

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面方法優(yōu)化百香果果皮多糖的超聲提取工藝,建立多糖提取的二次多項(xiàng)式回歸模型。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析處理,得到影響多糖提取率的因素的主次序?yàn)?液料比(A)>超聲時(shí)間(C)>超聲功率(D)>超聲溫度(B),其中液料比影響高度顯著。綜合考慮實(shí)際條件,確定超聲波提取百香果果皮多糖的最佳提取條件為:液料比 49∶1 mL/g,超聲時(shí)間為15 min,超聲功率為105 W,超聲溫度為69 ℃,在此條件下,多糖得率為5.890%。另外體外抗氧化研究結(jié)果表明,百香果果皮多糖具有一定的抗氧化活性,在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH和羥自由基的清除率分別為32.8%、59%,活性呈量效依賴(lài)關(guān)系。同時(shí),該多糖還具有較好的還原能力,在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí),果皮多糖吸光值為0.34。

超聲波輔助提取方法通過(guò)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用,可以提高多糖的得率。利用此方法提取百香果果皮多糖,具有省時(shí),高效的特點(diǎn),但關(guān)于百香果果皮多糖結(jié)構(gòu)解析及其抗氧化機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。以上研究結(jié)果為百香果果皮多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)生產(chǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。