葉文斌，何玉鵬，宮崢嶸，陳耀年

(1.隴南師范高等?？茖W(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500；

2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 成縣 742500；

3.甘肅省農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 天水 741000)

中國是世界上農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)出的最大國家，隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，農(nóng)業(yè)種植物的固體廢棄物也隨之增加[1-2].近年來隨著國家對中藥材種植的政策支持，甘肅省大力實(shí)施隴藥振興計劃，明確支持建立中藥材生產(chǎn)基地，隴南道地中藥材紅芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)是主要的支持和推廣種植栽培品種，近3年光隴南紅芪種植面積已達(dá)6.7萬hm2以上，采挖面積4 000 hm2以上，年產(chǎn)量超過200萬t，產(chǎn)值達(dá)2億元以上，隴南已成為中國最大的紅芪生產(chǎn)、加工和銷售基地[3]，由于紅芪采挖和加工時會產(chǎn)生數(shù)量巨大的加工廢棄物，而這些加工廢棄物中主要有根、須、頭和加工時折斷的殘?jiān)?，而這些殘?jiān)诩庸ず蟛荒芗皶r處理，在堆積一段時間后當(dāng)作廢棄物廢棄或堆入田間用作肥料，大大的浪費(fèi)了紅芪資源，所以如何對紅芪加工廢棄物的無害處理和高效資源化利用研究是當(dāng)前面臨的一個主要問題.隴南武都紅芪為豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪變種的干燥根，性溫，味甘，具有補(bǔ)氣固表、利尿解毒、排膿、斂瘡生肌等功效[4]，以隴南市武都米倉山特產(chǎn)尤為著名，是中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，其主要成分為紅芪多糖，占紅芪總成分的23%～34%[5].中藥類多糖具有眾多的生理功能使其成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，紅芪多糖同其它藥用植物多糖一樣，具有廣泛的藥理作用，尤其在改善動物腦缺血的腦損傷和再灌注后腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能的保護(hù)[6-7]、急性心肌梗死大鼠心肌氧化損傷的修復(fù)、糖尿病心肌病心肌纖維化抑制和心肌組織氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)[8-10]、口腔癌細(xì)胞的抑制具有很好的作用[11]，而且具有依賴性低、毒副作用小、安全性高、療效好等特點(diǎn)[12-15].用紅芪加工廢棄物活性多糖對黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)壽命和抗氧化能力的研究報道較少.

本文以黑腹果蠅為材料，采用生存試驗(yàn)及統(tǒng)計分析方法研究和探討紅芪加工廢棄物活性多糖對果蠅壽命和抗氧化能力進(jìn)行評價，為開發(fā)無毒無副作用的抗氧化、抗衰老替代藥物和功能食品提供依據(jù)，也為紅芪加工廢棄物的再利用和綜合開發(fā)利用提供技術(shù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與主要儀器

黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)，由天水師范學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；紅芪加工廢棄物活性多糖主要成分為紅芪多糖，純度為99.38%，隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20160822)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(批號20170509)、MDA試劑盒(批號20170729)均購自南京建成生物工程研究所；酵母膏購自卡邁舒(上海)生物科技有限公司；恒溫生化培養(yǎng)箱(寧波東南儀有限公司)、高溫滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)、超凈工作臺(山東博客科學(xué)儀器有限公司)、L5紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)有限公司).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果蠅壽命測定 參考葉文斌等[16-17]的果蠅飼養(yǎng)方法，配制基本培養(yǎng)基.在基本培養(yǎng)基中添加紅芪加工廢棄物多糖形成質(zhì)量濃度為100、200、300和400 mg/L的處理培養(yǎng)基，設(shè)基本培養(yǎng)基為對照組.本試驗(yàn)考察果蠅的平均壽命，收集未交配的雌雄果蠅進(jìn)行隔離培養(yǎng)，參考葉文斌等[16-18]的方法，在分裝好的質(zhì)量濃度為100、200、300和400 mg/L的4種處理培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中接入果蠅，每瓶各接入50只，每一相同質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基各接10瓶(5♀，5♂)，以基本培養(yǎng)基為對照(CK)組，每天觀察統(tǒng)計記錄死亡個體數(shù)，計算后代數(shù)量的雌雄性別比，然后對統(tǒng)計的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，平均壽命用每組所有果蠅壽命之和除以果蠅總數(shù)來表示，最高壽命用每組最后4只果蠅生存時間的總和除以4來表示，比較其與前者死亡率的差異[16-18].

1.2.2 急性損傷下的果蠅存活時間測定 果蠅分組情況同方法1.2.1.用體積濃度為6%的葡萄糖溶液配制成摩爾濃度為20 mmol/L的百草枯溶液和用體積濃度為9%的H2O2溶液備用，將收集的果蠅(不分雌雄)分別隔離培養(yǎng)饑餓2 h后，接入培養(yǎng)管中，取配制的百草枯溶液和H2O2溶液2 mL滴在濾紙條上，然后放入果蠅培養(yǎng)管中觀察果蠅死亡數(shù)目，每隔4 h統(tǒng)計1次，直到試驗(yàn)果蠅全部死亡，記錄每組果蠅的平均存活時間、半數(shù)存活時間和最高存活時間，具體參考周意等[19]的方法.

1.2.3 果蠅抗氧化活性測定 本試驗(yàn)所使用的方法主要參考葉文斌等[16-18]的方法，取基本培養(yǎng)基和質(zhì)量濃度為100、200、300以及400 mg/L的5種處理培養(yǎng)基中適應(yīng)培養(yǎng)了15 d的果蠅，隨機(jī)各取雌雄50只，移入到空試管中，用乙醚麻醉后稱重，在4 ℃條件下研磨，將研磨后的勻漿高速冷凍離心機(jī)離心15 min后，取上清液使用試劑盒來測定紅芪加工廢棄物多糖對果蠅的體內(nèi)SOD活力、CAT活力和丙二醛MDA的含量.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS17.0軟件來統(tǒng)計，試驗(yàn)結(jié)果用單因素方差來進(jìn)行分析，P<0.05表示顯著差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示極顯著差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 紅芪加工廢棄物多糖對果蠅壽命的影響

不同質(zhì)量濃度紅芪加工廢棄物多糖對果蠅世代壽命的統(tǒng)計結(jié)果如圖1所示.隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅的壽命均呈現(xiàn)升高的趨勢.當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為100 mg/L時，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅的壽命，與對照組相比成顯著差異(P<0.05).多糖質(zhì)量濃度在200～400 mg/L時，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅壽命，都與對照組相比存在極顯著差異(P<0.01).在400 mg/L的紅芪多糖處理下果蠅壽命能延長約28 d左右，紅芪加工廢棄物多糖對果蠅世代雌雄性別比結(jié)果如表1所示，當(dāng)多糖的質(zhì)量濃度在100～400 mg/L之間時，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值接近1∶1，總體變化不明顯.所以結(jié)果表明紅芪加工廢棄物多糖對果蠅壽命的具有明顯的延長作用.

圖1 紅芪加工廢棄物多糖對果蠅世代壽命的影響Fig.1 Effect of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on generational life of fruit flies

表1 紅芪加工廢棄物多糖對果蠅世代性別比影響Tab.1 Effects of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on generation sex ratio of fruit flies

2.2 紅芪加工廢棄物多糖對急性損傷下果蠅存活時間的影響

不同質(zhì)量濃度紅芪加工廢棄物多糖對急性損傷下果蠅存活時間的影響結(jié)果如圖2和圖3所示.在百草枯和過氧化氫處理下，飼喂多糖質(zhì)量濃度在300～400 mg/L時F1-F4代果蠅存活時間與對照組相比存在顯著提高(P<0.05).飼喂多糖質(zhì)量濃度在400 mg/L時，百草枯和過氧化氫處理F1-F4代果蠅平均存活時間比對照增加了約6 h，半數(shù)存活時間比對照增加了約4 h，最長存活時間比對照增加了約5 h，與對照組相比存在極顯著差異(P<0.01).結(jié)果表明紅芪加工廢棄物多糖對百草枯和過氧化氫處理急性損傷下果蠅存活時間具有明顯的延長作用.

圖2 紅芪加工廢棄物多糖對百草枯急性實(shí)驗(yàn)果蠅存活時間的影響Fig.2 Effect of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on the survival time in paraquat treatment of fruit flies

圖3 紅芪加工廢棄物多糖對過氧化氫急性實(shí)驗(yàn)果蠅存活時間的影響Fig.3 Effect of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on the survival time in hydrogen peroxidetreatment of fruit flies

2.3 紅芪加工廢棄物多糖對果蠅超氧化物歧化酶活性的影響

不同質(zhì)量濃度紅芪加工廢棄物多糖對雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活性的影響結(jié)果如圖4所示.當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為100 mg/L時，與其他濃度相比，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活性都最低，與對照相比存在顯著差異(P<0.05)；隨著多糖濃度的升高，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活性均呈現(xiàn)出升高的趨勢，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度升高到200 mg/L時，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活性逐漸升高，與對照相比SOD活性升高存在顯著差異(P<0.05).當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為300～400 mg/L時，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅體內(nèi)SOD活性與對照相比存在極顯著差異的升高(P<0.01).

圖4 紅芪加工廢棄物多糖對果蠅超氧化物歧化酶活性的影響Fig.4 Effects of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on superoxide dismutase activity of fruit flies

2.4 紅芪加工廢棄物多糖對果蠅過氧化氫酶活性的影響

隨著紅芪加工廢棄物多糖質(zhì)量濃度的升高，多糖對雌、雄果蠅體內(nèi)CAT活性的影響結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅體內(nèi)的CAT活性均呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為100 mg/L時，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅體內(nèi)CAT活性明顯高于對照組，與對照組相比成顯著性差異(P<0.05)，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為400 mg/L時，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅體內(nèi)CAT活性對照相比升高成極顯著差異(P<0.01).

圖5 紅芪加工廢棄物多糖對果蠅過氧化氫酶活性的影響Fig.5 Effects of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on catalase activity of fruit flies

2.5 芪加工廢棄物多糖對果蠅丙二醛含量的影響

不同質(zhì)量濃度紅芪加工廢棄物多糖對雌、雄果蠅體內(nèi)MDA含量的影響如圖6所示.隨著多糖濃度的升高，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅體內(nèi)MDA含量均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢.當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為100 mg/L時，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅體內(nèi)的MDA含量低于對照組(P<0.01)；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為300～400 mg/L時，MDA含量與對照組相比低于對照組(P<0.01).這也說明，隨著多糖質(zhì)量濃度的升高紅芪加工廢棄物多糖對果蠅的清除MDA的能力逐漸提高，果蠅的抗氧化作用也逐漸增強(qiáng).結(jié)果表明紅芪加工廢棄物多糖能顯著提高F1-F4代雌、雄果蠅世代SOD和CAT活性和降低MDA含量，提高了果蠅的抗氧化能力和生命力.同時還發(fā)現(xiàn)，在不同多糖質(zhì)量濃度處理下雄性果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性均比雌性果蠅高，雌性果蠅體內(nèi)MDA含量低于雄性果蠅體內(nèi)的含量，這也說明，雄性果蠅的抗氧化能力強(qiáng)于雄性果蠅.

圖6 紅芪加工廢棄物多糖對果蠅丙二醛含量的影響Fig.6 Effects of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on malondialdehyde contents of fruit flies

3 結(jié)果與討論

紅芪多糖主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成[20]，具有很好的抗氧化活性[21]和較強(qiáng)的氧自由基、超氧陰離子、羥自由基清除能力，對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷具有很好的保護(hù)作用，在氧化低密度脂蛋白氧化損傷模型動物中具有明顯的抑制細(xì)胞凋亡和抗氧化應(yīng)急功能，顯著提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的活性[22-24].但在哺乳動物模型的數(shù)量和試驗(yàn)成本的限制下，壽命實(shí)驗(yàn)在哺乳動物模型中研究較少，而黑腹果蠅作為試驗(yàn)動物進(jìn)行壽命和急性損傷的評價研究，是因?yàn)榫哂羞z傳背景清楚、生存期短和繁殖量大的特點(diǎn)，而且飼養(yǎng)簡便和反應(yīng)靈敏，同時果蠅的代謝系統(tǒng)、生理功能和性別決定以及生長發(fā)育與哺乳動物基本相似[16-18]，故多應(yīng)用于生育力、衰老或壽命、功能保健食品評價等方面的研究[16-19].在藥物和功能食品研究中，果蠅常用作延緩衰老實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，特別是在遺傳生物學(xué)和毒理學(xué)研究中應(yīng)用較多[16-19].

本研究探討了不同質(zhì)量濃度的紅芪加工廢棄物多糖對黑腹果蠅壽命和急性損傷下果蠅存活時間，SOD和CAT兩種抗氧化酶的活力的影響，同時考察MDA含量的變化.試驗(yàn)結(jié)果表明，紅芪加工廢棄物能顯著提高F1-F4代雌、雄果蠅世代壽命，在質(zhì)量濃度為400 mg/L的紅芪多糖處理下能延長果蠅壽命約28 d，同時降低了果蠅體內(nèi)MDA含量，升高了SOD和CAT的活性.延長了急性損傷下果蠅存活的時間，在質(zhì)量濃度為400 mg/L的紅芪多糖飼喂過的果蠅在過氧化氫和百草枯急性氧化損傷下平均存活時間延長了約6 h，半數(shù)存活時間增加了約4 h，最長存活時間增加了約5 h，果蠅的抗氧化能力和生命力也得到了提高，雌性果蠅的抗氧化作用強(qiáng)于雄性果蠅，F(xiàn)1-F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值接近1∶1，總體變化不明顯.

果蠅的衰老與體內(nèi)MDA含量、SOD和CAT兩種抗氧化酶活力的水平密切相關(guān)[7-8]，積累過多的MDA會增加細(xì)胞膜的透性，破壞膜的完整性，導(dǎo)致其他大分子進(jìn)入細(xì)胞結(jié)合到細(xì)胞器和核膜上與不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，影響DNA合成及蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)[8-9]，從而導(dǎo)致衰老，甚至死亡[13].紅芪多糖是一種具有多種生物活性功能的大分子物質(zhì)，當(dāng)用多糖飼喂果蠅后，果蠅體內(nèi)SOD和CAT兩種抗氧化酶的活力和細(xì)胞膜過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物MDA含量都發(fā)生了較為明顯的變化，這種結(jié)果已經(jīng)表明紅芪多糖與果蠅壽命和衰老之間存在一定的關(guān)系.MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的的分解產(chǎn)物，是動物機(jī)體抗衰老評價的重要指標(biāo)之一，它的含量變化與抗氧化酶系中SOD和CAT兩種酶的活性密切相關(guān)，而紅芪加工廢棄物多糖能夠降低MDA，顯著升高SOD和CAT的抗氧化活性，這就提示多糖具有很好的清除自由基和減少脂質(zhì)過氧化過程的作用，起到延緩衰老，延長壽命和提高生命力的功效.MDA含量急劇降低，SOD和CAT的抗氧化活性顯著升高，這種現(xiàn)象可能是多糖分子參與機(jī)體復(fù)雜生物化學(xué)反應(yīng)，刺激果蠅主動啟動SOD和CAT清除體內(nèi)產(chǎn)生的MDA等自由基，促使升高了兩者的量，來主動增強(qiáng)果蠅的抗性，同時間接促進(jìn)壽命.這將為開發(fā)無毒無副作用的抗氧化、抗衰老替代藥物和功能食品提供依據(jù)，也為紅芪加工廢棄物的再利用和綜合開發(fā)利用提供技術(shù).