趙春麗，彭玉琳，周永強(qiáng)，薛 娟，王澤歡

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

山雞椒Litsea cubeba（Lour.）Pets.為樟科木姜子 屬植物，又名木姜子、山蒼樹、山蒼子，在我國南部省份云南、貴州、廣西、廣東等省分布較多[1,2]。在民間山雞椒的果實因風(fēng)味特殊多用于腌制各種食品，常作為食品香料使用[3]。木姜子屬植物在其根、莖、葉、花、果實、樹皮中普遍含有揮發(fā)油，具有抗菌和驅(qū)蟲的功效[4]。近幾年抗生素的使用過度，病原菌耐藥性逐漸增強(qiáng)，在天然藥物中尋找具有抑菌活性的物質(zhì)具有重要意義。山雞椒果實中也含有大量揮發(fā)油，故對其化學(xué)成分及抑菌活性進(jìn)行研究。本研究采用水蒸氣蒸餾法提取山雞椒果實揮發(fā)油，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gaschromatography massspectrometry，GC-MS）對其化學(xué)成分進(jìn)行分析并以峰面積歸一化法對各成分進(jìn)行定量，考察其抑菌活性，為山雞椒的進(jìn)一步開發(fā)及天然抑菌藥物的發(fā)現(xiàn)提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料、儀器與試劑

山雞椒果實采自云南省文山州富寧縣，該植物由貴州中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室王澤歡博士鑒定為樟科山雞椒（Litsea cubeba（Lour.）Pers.）的果實。菌種為貴州中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥實驗室菌種，分別為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌。

Agilent 7890B 型氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國 Agilent 公司）；PEGASUS HT 質(zhì)譜儀（美國 LECO 公司）；DB-5MS 毛細(xì)管柱（美國 Agilent 公司）；SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺（浙江蘇凈凈化）；DHP-9082型數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）；DSX-280KB30 型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；98-I-B 型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；800Y 型高速多功能粉碎機(jī)（廠家永康市鉑歐五金制品有限公司）；SQP 型萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

乙醚、葡萄糖、無水 Na2SO4、無水 KH2PO4、NaCl均為分析純由國藥集團(tuán)生產(chǎn)。瓊脂粉、蛋白胨、酵母粉由Solarbio 生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 山雞椒果實揮發(fā)油的提取 取約50g 山雞椒鮮藥材于粉碎機(jī)中粉碎，以山雞椒果實揮發(fā)油提取量為指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交優(yōu)化試驗，以加水量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，采取三因素三水平正交實驗確定最優(yōu)提取工藝。

1.2.2 GC-MS 分析條件

1.2.2.1 樣品制備 取100μL 樣品于1.5mL EP 管中，加入 900μL 乙醚，再加入無水 Na2SO4，渦旋 30s，小心移取上清液于2mL 進(jìn)樣瓶（甲烷硅基化的）中，GC-TOF-MS 檢測。

1.2.2.2 色譜條件 色譜柱DM-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；柱流速 1.0mL·min-1；進(jìn)樣量 1μL；分流比5∶1；載氣為He；柱溫箱采用程序升溫，起始溫度50℃保持 3min，以 5℃·min-1升溫至 130℃保持 3min;以 2℃·min-1升溫至 180℃保持 2min；以 1℃·min-1升溫至280℃保持5min；進(jìn)樣口溫度280℃；傳輸線溫度280℃；離子源溫度250℃；電離電壓-70eV；質(zhì)量范圍20～500；掃描速度10 每秒光譜；溶劑延遲2.6min。

1.2.3 體外抑菌實驗 用10% DMSO 水溶液作稀釋劑，制成不同體積比（80、40、20、10、5、0mg·mL-1）的山雞椒揮發(fā)油稀釋液。將藥敏紙片浸泡在上述濃度的揮發(fā)油稀釋液中30min, 瀝干貼于含菌平板上，每板貼5 片，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h,測量抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。

1.2.4 揮發(fā)油最小抑菌濃度（MIC）的測定 將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接于LB 培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h，白色念珠菌轉(zhuǎn)接于馬丁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24h 后，無菌條件下將各指示菌麥?zhǔn)媳葷岫日{(diào)至0.5。再次稀釋1000 倍，將各供試菌加入無菌96 孔板中，每孔100L 藥液，每行第1 孔加100μL藥液，混勻后移取100μL 到第二孔，以此類推至第7孔作為陰性對照（僅加肉湯不加菌液），8 孔作為陽性對照（僅加肉湯不加菌液）。1 孔至6 孔藥物濃度分別為 160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0mg·mL-1，37℃溫箱培養(yǎng)18h 后，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 山雞椒果實揮發(fā)油提取正交實驗結(jié)果

以加水量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）為影響因素，以揮發(fā)油為提取量，設(shè)計L9（34）正交優(yōu)化試驗，優(yōu)選揮發(fā)油的提取工藝，正交實驗因素水平見表1，正交實驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平表Tab.1 Factor level

表2 山雞椒揮發(fā)油提取正交試驗結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test for extraction of essential oil from Litsea cubeba（Lour.）Pets

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

根據(jù)正交試驗表及方差得到正交試驗結(jié)果:C＞B＞A，提取次數(shù)因素大于另兩因素，故認(rèn)為提取次數(shù)對結(jié)果影響最大，結(jié)合方差分析綜合考慮，確定最佳提取條件為:加水量為6 倍水、提取時間為2.5h、提取次數(shù)為2 次。

2.2 揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果

山雞椒果實揮發(fā)油經(jīng)檢測后得到總離子流圖見圖 1，通過 ChromaTOF 軟件（V4.3，LECO）和 NIST 數(shù)據(jù)庫質(zhì)譜確認(rèn)其主要成分，并采用峰面積歸一化法進(jìn)行相對定量，結(jié)果見表4。

圖1 山雞椒果實揮發(fā)油揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components in Litsea cubeba（Lour.）Pets fruit

表4 山雞椒果實化學(xué)成分表Tab.4 Chemical components of Litsea cubeba（Lour.）Pets fruit

25 2,3,6,7-四甲基辛烷 8.35 846 226571 0.11 26 十甲基環(huán)五硅氧烷 8.70 847 56449 0.03 27 對甲酚 8.74 922 4688681 2.19 28 四（三甲硅烷氧基）硅 9.00 882 56676 0.03 29 對甲基苯乙酮 9.67 842 484638 0.23 30 （Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛 10.25 893 1053591 0.49 31 香芹酮 10.39 890 1692054 0.79 32 檸檬腈 10.47 809 179771 0.08 33 甘油 10.54 839 769731 0.36 34 （E）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛 10.66 883 230678 0.11 35 （Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸甲酯 10.74 876 1296051 0.61 36 香茅醇 11.15 915 4024242 1.88 37 香葉酸甲酯 11.36 829 4512839 2.11 38 香葉醇 11.48 876 11342012 5.31 39 乙酸銫 12.10 971 141414 0.07 40 乙酸香葉酯 12.14 893 32450 0.02 41 反式石竹烯 12.84 810 161591 0.08 42 （E）-β-金合歡烯 13.08 809 106085 0.05 43 香葉酸 13.15 840 90295978 42.24 44 十三烷 14.86 875 673164 0.31 45 石竹素 14.88 918 3526464 1.65 46 十二酸 15.45 916 15563920 7.28 47 利比妥 16.15 945 5862112 2.74 48 鄰苯二甲酸二異丁酯 17.79 883 2930077 1.37 49 棕櫚酸 19.54 930 11852525 5.54 50 法尼酸 19.84 804 103676 0.05 51 硬脂氧基三甲基硅烷 21.33 898 5966869 2.79 52 正二十烷 24.10 854 159997 0.07 53 正十六烷 24.99 803 40114 0.02 54 六甲基二硅氧烷 26.74 855 37774 0.02 55 三（2,4-二叔丁基）亞磷酸苯酯 30.46 841 707329 0.33

使用 ChromaTOF 軟件（V4.3，LECO）和 NIST 數(shù)據(jù)庫質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊、質(zhì)譜匹配等分析[5]。通過GC-MS 對山雞椒揮發(fā)油成分的分析鑒定，共鑒定出揮發(fā)性成分55 種，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的為香葉酸（42.24%），三甲基苯氧基硅（8.96%），十二酸（7.28%），棕櫚酸（5.54%），香葉醇（5.31%），硬脂氧基三甲基硅烷（2.79%），利比妥（2.74%），對甲酚（2.19%），香葉酸甲酯（2.11%），香茅醇（1.88%），石竹素（1.65%），鄰苯二甲酸二異丁酯（1.37%），3-甲基-2-環(huán)己烯-1-酮（1.21%）。

2.3 山雞椒果實揮發(fā)油抑菌活性測定

山雞椒果實揮發(fā)油抑菌實驗結(jié)果見表5。

表5 山雞椒果實揮發(fā)油抑菌實驗結(jié)果（平均抑菌圈半徑：mm）Tab.5 Bacteriostatic test results of volatile oil from Litsea cubeba（Lour.）Pets fruit（average bacteriostatic circle radius： mm）

由表5 可知，山雞椒果實揮發(fā)油對實驗中的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念球菌3 種菌均有抑制作用，抑菌效果隨揮發(fā)油含量增加而增加，尤以含量到達(dá)80mg·mL-1時，3 種菌抑菌效果顯著增加，揮發(fā)油對枯草芽孢桿菌不敏感；揮發(fā)油濃度從20mg·mL-1增加到40mg·mL-1時，抑菌效果大幅增加，以大腸桿菌抑菌效果最為顯著。

為了保證實驗完整性，在以山雞椒揮發(fā)油稀釋液80mg·mL-1為最高濃度的基礎(chǔ)上，添加一組數(shù)據(jù)以160mg·mL-1為最大濃度，并選取了 80、40mg·mL-1一同作為同組實驗。

在原有的基礎(chǔ)上當(dāng)山雞椒揮發(fā)油稀釋液含量達(dá)到160mg·mL-1時，對實驗中的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念球菌3 種菌抑制作用增強(qiáng)，抑菌效果隨揮發(fā)油濃度增加而增加，以白色念球菌與金黃色葡萄球菌效果較為顯著；揮發(fā)油稀釋液對枯草芽孢桿菌依舊不敏感。

2.4 揮發(fā)油最小抑菌濃度測定

山雞椒果實揮發(fā)油最小抑菌濃度最終結(jié)果見表6。

表6 山雞椒果實最小抑菌濃度Tab.6 Minimum inhibitory concentration of Litsea cubeba（Lour.）Pets fruit

由表6 可知，山雞椒果實揮發(fā)油對供試菌有不同程度的抑制作用，對大腸桿菌最小抑菌濃度（MIC）為40mg·mL-1, 對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC）為20mg·mL-1，對枯草芽孢桿菌最小抑菌濃度（MIC）為160mg·mL-1，對白色念球菌最小抑菌濃度（MIC）為 5mg·mL-1。

3 結(jié)論

本實驗采用水蒸汽蒸餾法提取山雞椒果實揮發(fā)油，通過三因素三水平正交實驗確定了最優(yōu)提取工藝。采用GS-MS 聯(lián)用法對揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，鑒定出85 種揮發(fā)性成分，主要為香葉酸，占揮發(fā)油化學(xué)成分的42.24%。最終實驗得出山雞椒果實揮發(fā)油樣品質(zhì)量良好，并具有良好的抑菌活性，對本實驗中所用到的金黃色葡萄球菌、白色念球菌、大腸桿菌均有較好的抑菌作用。因此，山雞椒果實揮發(fā)油具有較大的藥用開發(fā)價值，其藥理作用及機(jī)制可以進(jìn)行更深入的研究，可開發(fā)具有不同治療作用的藥品，對于不同致病菌所導(dǎo)致的疾病達(dá)到一定的預(yù)防及治療作用。