妥曉梅，朱東麗,2，陳曉峰，榮譽，郭燕，楊鐵林,2

研究報告

骨質疏松易感SNP rs4325274通過增強子遠程調控基因的功能機制研究

妥曉梅1，朱東麗1,2，陳曉峰1，榮譽1，郭燕1，楊鐵林1,2

1. 西安交通大學生命科學與技術學院，生物醫(yī)學信息工程教育部重點實驗室，生物醫(yī)學信息與基因組學中心，西安 710049 2. 浙江西安交通大學研究院，杭州 311215

骨質疏松癥是一種典型的多基因復雜疾病，遺傳力高達85%，其發(fā)病率已躍居常見疾病的第5位。盡管已經鑒定出大量骨質疏松易感SNP，但大多數(shù)SNP位點位于基因組非編碼區(qū)，且功能機制未知。本研究旨在通過生物信息學分析和功能實驗探究骨質疏松非編碼功能性易感SNP rs4325274的分子調控機制。首先，通過表觀注釋發(fā)現(xiàn)該SNP所在區(qū)域處在增強子上，eQTL和Hi-C分析結果發(fā)現(xiàn)SNP調控的潛在靶基因是；然后，利用多種數(shù)據(jù)庫進行Motif預測，并結合GEO數(shù)據(jù)庫中的ChIP-seq數(shù)據(jù)分析進行了驗證，結果發(fā)現(xiàn)轉錄因子更傾向于結合SNP rs4325274-G堿基；進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了該SNP對基因表達的增強作用；最后，利用shRNA敲低轉錄因子實驗，檢測靶基因的表達變化。以上研究結果初步解析了非編碼區(qū)功能性SNPrs4325274作為增強子遠程調控基因表達的分子機制，為復雜疾病非編碼易感SNP的遺傳調控研究提供新思路。

SNP rs4325274；基因；轉錄因子；骨質疏松癥發(fā)生機制

骨質疏松癥是一種世界范圍內流行的全身性骨代謝性疾病，以骨量減少和骨組織微結構損壞為特征[1]。由于其高發(fā)病率、高死亡率以及高醫(yī)療花費[2~4]，骨質疏松癥已成為當前亟需解決的公共健康問題之一。但至今骨質疏松癥的遺傳發(fā)病機制仍不清楚。因此，開展骨質疏松癥的基礎研究，深入探索其分子致病機制，對骨質疏松癥的預防和臨床治療有著重要意義。

(SRY-box transcription factor 6)基因是SRY相關轉錄因子D亞家族的成員，在軟骨細胞分化、軟骨形成和軟骨內骨形成中起著非常重要的調控作用[5,6]。當和基因同時缺失時，小鼠胚胎會發(fā)展成嚴重的泛發(fā)性軟骨發(fā)育不良，在胚胎發(fā)育16.5天左右死亡[5]。另外，和協(xié)同基因調節(jié)軟骨中II 型膠原()的表達來控制軟骨的重塑，在治療骨關節(jié)炎中軟骨退變和軟骨損傷修復中具有重要的臨床應用價值[7,8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)基因參與了軟骨形成和成骨的耦合調控作用[9]，這提示基因可能在骨質疏松發(fā)生過程起著非常重要的作用。

骨質疏松癥的臨床診斷和評估主要以骨密度(bone mineral density, BMD)為依據(jù)[10]，其遺傳力高達0.6~0.8[11]。目前，國際上已有多項全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)發(fā)現(xiàn)位于染色體11p15區(qū)的基因內部及上下游區(qū)的多個SNPs位點與股骨頸、腰椎和手腕骨密度等骨質疏松癥表型顯著關聯(lián)[12~15]。但對于這些風險SNPs在骨質疏松癥發(fā)生過程中的功能及作用機制至今尚不清楚。本課題組前期從骨質疏松癥遺傳因素聯(lián)合會(genetic factors for osteoporosis consortium, GEFOS)下載和整理了所有與骨質疏松癥相關表型的所有GWAS 數(shù)據(jù)，通過精細定位分析，篩選到基因上游區(qū)域中一個潛在的骨質疏松癥易感causal SNP rs4325274位點，已有研究報道了該SNP位點與足跟部骨密度[16]和全身骨密度[17]表現(xiàn)出顯著的關聯(lián)性，值分別為1.60×10–42和1.73×10–13，但該SNP潛在的功能機制有待進一步研究。本研究將結合生物信息學分析以及功能實驗，探究骨質疏松癥易感SNP rs4325274調控基因表達的分子機制，以期為進一步解析骨質疏松癥的發(fā)生機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

成骨細胞來源的U2OS細胞，用含有10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

菌株感受態(tài)細胞DH5a購自北京天根生化技術有限公司；雙熒光素酶報告基因載體PGL-3 Basic、內參海腎載體phRL和ViaFect轉染試劑均購自美國Promega公司；定點突變試劑盒購自北京天恩澤技術有限公司；限制性內切酶，DNA ligation Mix，ExDNA 聚合酶均購自日本TaKaRa公司；膠純化回收試劑盒購自上海GENEray公司；血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒，無內毒素質粒小量中提提取試劑盒均購自北京天根生化技術有限公司。

1.3 表觀功能注釋

利用ANNOVAR軟件注釋causal SNP rs4325274的基因組位置，利用WashU Epigenome Brower (http://epigenomegateway.wustl.edu/)在線網(wǎng)站，選取成骨細胞及GM12878的表觀調控數(shù)據(jù)，包括各類激活型組蛋白修飾如H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac、P300以及DNase I 超敏感位點等，對SNP rs4325274所在區(qū)域進行功能注釋。

1.4 順式表達數(shù)量性狀(expression quantitative trait locus, eQTL)分析

利用福明翰心臟研究(Framingham Heart Study, FHS)中的全血eQTL數(shù)據(jù)(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/ eqtl/original_submissions/FHS_eQTL/)進行eQTL分析。

1.5 高通量染色質互作(high-throughput chro-matin interaction analysis, Hi-C)分析

結合本實驗室測得成骨細胞的Hi-C 數(shù)據(jù)、ChIP-seq 測序數(shù)據(jù)(doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.25.114272)，利用實驗室搭建的分析平臺進行了Hi-C 分析，以期得到與SNP rs4325274 所在區(qū)域顯著互作的成環(huán)片段。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗

1.6.1 野生型和突變型兩種熒光素酶重組載體構建

構建含啟動子片段的PGL3熒光素酶報告載體，正確載體命名為promoter-Luc+。然后，構建含SNP rs4325274片段的promoter-Luc+重組載體。NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對結果顯示SNP位點為C堿基，故將構建好的重組載體命名為rs4325274-C-promoter-Luc+，在此基礎上利用定點突變試劑盒進行C→G定點突變。首先，在CE Design V1.03網(wǎng)站上設計SNP rs4325274定點突變引物，然后根據(jù)基因定點突變試劑盒(D0206)操作說明書進行定點突變反應，正確載體命名為rs4325274-G-promoter-Luc+。相關引物序列見表1。

1.6.2 報告基因載體的轉染及熒光素酶活性檢測

分別將構建好的promoter-Luc+、rs4325274- C-promoter-Luc+和rs4325274-G-promoter- Luc+熒光素酶報告基因載體與內參海腎質粒(phRL) 共轉染至成骨系細胞U2OS中，根據(jù)Dual Luciferase Reporter Assay System操作說明書，利用化學發(fā)光儀檢測rs4325274兩種堿基型增強子對基因啟動子的調控活性，以確定其是否對基因有增強子作用。

表1 實驗所用引物序列

、和下劃線分別表示d III、I和I酶切位點。

1.7 Motif預測分析

從meme suite網(wǎng)站(http://meme-suite.org/doc/ meme.html?man_type=web)下載整理最新的人類轉錄因子Motif 數(shù)據(jù)庫，包括JASPAR 2018、HO-COMOCOv11、SwissRegulon和TRANSFAC四個權威數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行Motif 預測，分析能夠與增強子上目標SNP rs4325274結合的轉錄因子，以及SNP rs4325274不同堿基型的改變是否會影響轉錄因子的結合情況。利用GEO數(shù)據(jù)庫里的ChIP-seq數(shù)據(jù)集分析在SNP rs4325274位點處是否有轉錄因子的結合信號。

1.8 轉錄因子shRNA敲低實驗

首先在U2OS細胞中，對SNP rs4325274進行了分型，利用血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取U2OS細胞的基因組DNA作為模板進行PCR擴增，將得到的PCR產物送北京擎科生物科技有限公司進行測序檢測SNP基因型。

本研究選取文獻[19]已報道的-shRNA寡核苷酸序列為shRNA序列：-shRNA1：5?-GGCAGAAGAACCCTAGCAA-3?，-shRNA2：5?-GGTCTTCACCTCAGACACT-3?，sh-NC：5?-GTT-CTCCGAACGTGTCACGT-3?，構建到miR-30骨架上，經I和R I雙酶切克隆到pcDNA3.1表達載體上，酶切及測序鑒定驗證，即構建好sh--1，sh--2和sh-NC (空白對照)表達質粒。然后用ViaFect轉染試劑分別轉染U2OS細胞。轉染48h后，提取細胞總RNA，反轉錄，用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測的敲低情況及基因mRNA水平的表達情況。qRT-PCR檢測引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 表觀注釋提示SNP rs4325274處于成骨細胞相關增強子上

利用ENCODE數(shù)據(jù)庫里的成骨細胞及GM12878的ChIP-seq數(shù)據(jù)對篩選出的SNP rs4325274所在區(qū)域進行表觀注釋，利用WashU可視化工具作圖，發(fā)現(xiàn)SNP rs4325274周圍富集了多個具有較強的激活型組蛋白標記，如H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac，以及轉錄激活因子P300和DNase I 超敏感位點(DHS) (圖1)，提示SNP rs4325274處于增強子元件內，初步推斷該SNP所在區(qū)域可能是一個增強子。

2.2 eQTL和Hi-C分析發(fā)現(xiàn)易感SNP rs4325274作用的靶基因可能是SOX6基因

研究發(fā)現(xiàn)，基因組可折疊成環(huán)使得直線物理位置較遠的增強子和靶基因的啟動子在三維結構上接近，進而發(fā)揮調控作用[20,21]。為了證明易感SNP rs4325274與靶基因之間的關系，利用FHS中5257個人的全血eQTL數(shù)據(jù)進行了eQTL分析，結果發(fā)現(xiàn)SNP rs4325274 (= 2.06×10–12)與基因之間的關系較顯著。利用本課題組前期對成骨細胞高分辨率的Hi-C測序數(shù)據(jù)及搭建好的Hi-C分析流程，數(shù)據(jù)分辨率為2 kb，發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)SNP rs4325274與基因存在遠程互作(圖2)。

圖1 SNP rs4325274組蛋白注釋結果(采用Wash U基因組瀏覽器可視化)

eQTL分析和Hi-C分析結果表明，易感SNP rs4325274所調控的靶基因可能是基因。

2.3 rs4325274對SOX6基因表達具有增強子調控活性

分別將包含rs4325274(C/G)不同等位基因的片段(約0.8 kb)及基因啟動子區(qū)片段(約1.2 kb)克隆到熒光素酶報告基因載體(PGL3-Basic)上，與內參海腎質粒(phRL)共轉染至U2OS細胞中，檢測其熒光素酶活性。結果發(fā)現(xiàn)，相比只含基因啟動子的載體，含SNP不同等位基因的重組載體表達活性顯著增強，且含有G堿基的載體表達活性相比C堿基的載體表達活性顯著增強(圖3)，這進一步證實了SNP rs4325274所在的片段是作為一個增強子來調控基因表達，而且不同等位基因調控活性有差異，其中G等位基因的調控活性更高。

圖2 Hi-C數(shù)據(jù)分析結果示意圖

2.4 Motif預測發(fā)現(xiàn)rs4325274結合轉錄因子HNF1A

根據(jù)JASPAR 2018、HOCOMOCOv11、Swiss-Regulon和TRANSFAC四個權威數(shù)據(jù)庫對SNP rs4325274 (G/C)序列進行轉錄因子預測，結果同時在SwissRegulon和TRANSFAC數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)SNP rs4325274都結合轉錄因子，而且轉錄因子更傾向于結合rs4325274-G等位基因(圖4)。因此，推測SNP rs4325274通過不同基因型結合轉錄因子的活性對增強子具有潛在的激活作用。

圖4 轉錄因子HNF1A結合DNA序列和SNP位置

*：SNP rs4325274位點。

圖3 雙熒光素酶報告基因活性檢測rs4325274的增強子活性結果

數(shù)據(jù)為均值 ± 標準差；*：<0.05；**：< 0.01。

圖5 ChIP-seq數(shù)據(jù)分析結果(采用IGV工具可視化)

為了驗證rs4325274可能與轉錄因子結合，從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得轉錄因子的ChIP-seq數(shù)據(jù)(NO：GSM2534454)，利用IGV (Inte-grative Genomics Viewer)工具可視化作圖，發(fā)現(xiàn)rs4325274位于ChIP信號富集區(qū)(圖5)，這一結果進一步說明了rs4325274可能會結合轉錄因子。

2.5 HNFIA敲低后SOX6表達降低

對SNP rs4325274在U2OS細胞中進行了分型，分型結果顯示rs4325274在U2OS細胞中是雜合型(G/C)(圖6)，確保了后續(xù)敲低實驗的進行。

為進一步探究SNPrs4325274是否通過影響轉錄因子結合機制調控靶基因的表達，本研究構建了-shRNA敲低載體，轉染至U2OS細胞，利用qRT-PCR檢測基因的表達情況。結果表明，與陰性對照shRNA轉染細胞相比，在轉錄因子敲低的U2OS細胞中，基因的表達顯著降低(圖7)。這一結果提示可能是SNP rs4325274調控機制中的潛在調節(jié)因子，通過目標SNP-轉錄因子–靶基因的調控機制，進而導致疾病的發(fā)生。轉錄因子與SNP rs4325274等位基因的特異性結合需進一步實驗去驗證。

圖6 rs4325274在U2OS細胞中的分型結果

圖7 在U2OS細胞中敲低HNFIA對SOX6表達的影響

數(shù)據(jù)為均值 ± 標準差；***：<0.001；**：<0.01。

3 討論

骨質疏松癥是一種受多基因調控的復雜疾病[11]，其遺傳力高達85%[22]。隨著基因組技術的發(fā)展，大規(guī)模GWAS的開展，已經成功鑒定了大量與骨質疏松癥骨密度相關聯(lián)的易感變異位點。目前，破譯這些易感位點影響疾病發(fā)生的功能機制，進而為臨床轉化提供潛在治療靶點，是后GWAS時代的研究熱點和難點[23]。

近年來，隨著ENCODE[24,25]和Roadmap[26]計劃結果的陸續(xù)公布，提供了大量人類基因組上的各種表觀調控信息，這為解析非編碼區(qū)疾病位點的功能提供了新的契機。本研究利用ENCODE數(shù)據(jù)對骨質疏松易感SNP rs4325274進行表觀注釋，發(fā)現(xiàn)SNP rs4325274位于增強子區(qū)域。為進一步證明易感SNP rs4325274與靶基因之間的關系，利用eQTL分析和Hi-C分析發(fā)現(xiàn)易感SNP rs4325274所調控的靶基因可能是基因。在此基礎上通過功能實驗證實該SNP確實對基因表達有增強子調控活性，并發(fā)現(xiàn)rs4325274-G等位基因表達活性比rs4325274-C等位基因顯著增強。

研究表明，SNP影響疾病易感性的機制之一就是通過影響轉錄因子與DNA的結合調控基因表達[27]，在骨質疏松癥發(fā)生機制中已有相關研究報道。Xiao等[28]研究證明轉錄因子特異性結合rs9547970的主等位基因A而非等位基因G，通過該機制調控基因的轉錄活性，從而影響骨形成。基因上的rs4317882與骨密度關聯(lián)，該研究者[29]同時又證實了轉錄因子可特異性結合rs4317882的風險等位基因A而非等位基因G。本課題組前期在解析骨質疏松癥熱點區(qū)域13q14.11中易感SNP位點的機制時，證明rs9533090-C等位基因可以大量招募激活型轉錄因子，提高其增強子活性，從而增強骨質疏松明星基因表達的機制[30]。

為進一步探究易感SNP rs4325274位點調控基因表達的機制，本研究利用多種數(shù)據(jù)庫進行了Motif預測，發(fā)現(xiàn)SNP rs4325274結合的轉錄因子，并結合ChIP-seq數(shù)據(jù)分析進行驗證，發(fā)現(xiàn)rs4325274位于轉錄因子ChIP信號富集區(qū)，進一步利用shRNA干擾轉錄因子，發(fā)現(xiàn)在基因敲低的細胞中，基因的表達顯著降低。由此推測骨質疏松易感SNP rs4325274可能通過影響與轉錄因子的特異性結合來調節(jié)基因表達。后續(xù)本課題組會進一步通過染色質互作(chromosome conformation capture, 3C)實驗和染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)等實驗來深入探究該SNP位點與轉錄因子及靶基因基因之間的作用機制，并在細胞水平和動物模型深入探究基因在骨質疏松癥發(fā)病中的真正作用機制。

綜上所述，本研究初步解析了非編碼區(qū)功能性SNPrs4325274作為增強子遠程調控基因表達的分子機制。研究結果將有助于為復雜疾病非編碼易感SNP的遺傳調控研究提供新思路，并為骨質疏松癥的藥物開發(fā)和治療提供潛在的藥物靶點。

[1] Lamichhane AP. Osteoporosis-an update., 2005, 44(158): 60–66.

[2] Reginster JY, Burlet N. Osteoporosis: a still increasing prevalence., 2006, 38(2 Suppl. 1): S4–9.

[3] Morales-Torres J, Gutiérrez-Ure?aS.The burden of osteo-porosis in latinamerica., 2004, 15(8): 625– 632.

[4] Nguyen TV, Center JR, Eisman JA. Osteoporosis: under-rated, underdiagnosed and undertreated., 2004, 180(S5): S18–22.

[5] Smits P, Li P, Mandel J, Zhang ZP, Deng JM, Behringer RR, de Crombrugghe B, Lefebvre V. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage for-mation., 2001, 1(2): 277–290.

[6] Smits P, Dy P, Mitra S, Lefebvre V. Sox5 and Sox6 are needed to develop and maintain source, columnar, and hypertrophic chondrocytes in the cartilage growth plate., 2004, 164(5): 747–758.

[7] Renard E, Porée B, Chadjichristos C, Kypriotou M, Maneix L, Bigot N, Legendre F, Ollitrault D, De Crombrugghe B, Malléin-Gérin F, Moslemi S, Demoor M, Boumediene K, Galéra P. Sox9/Sox6 and Sp1 are involved in the insulin-like growth factor-I-mediated upregulation of human type II collagen gene expression in articular chondrocytes., 2012, 90(6): 649–666.

[8] Liu J, Wang HW, Chen Y, Yu HL, Wang Q, Yang HF, Ma JX, Xiang LB. Regulatory effect ofandon the growth and differentiation properties into chondrocytes of MPCs in primary OA articular cartilage, 2014, (5): 477–481.劉軍, 王洪偉, 陳語, 于海龍, 王琪, 楊會峰, 馬駿雄,項良碧.和基因轉染對人原發(fā)性骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨間充質祖細胞增殖和成軟骨分化的調控作用. 局解手術學雜志, 2014, (5): 477–481.

[9] Zhang Y, Yang TL, Li X, Guo Y. Functional analyses reveal the essential role of SOX6 and RUNX2 in the communication of chondrocyte and osteoblast., 2015, 26(2): 553–561.

[10] Livshits G, Deng HW, Nguyen TV, Yakovenko K, ReckerRR, Eisman JA. Genetics of bone mineral density: evidence for a major pleiotropic effect from an inter-continental study., 2004, 19(6): 914– 923.

[11] Peacock M, Turner CH, Econs MJ, Foroud T. Genetics of osteoporosis., 2002, 23(3): 303–326.

[12] Rivadeneira F, Styrkársdottir U, Estrada K, Halldórsson BV, Hsu YH, Richards JB, Zillikens MC, Kavvoura FK, Amin N, Aulchenko YS, Cupples LA, Deloukas P, Demissie S, Grundberg E, Hofman A, Kong A, Karasik D, van Meurs JB, Oostra B, Pastinen T, Pols HA, Sigurdsson G, Soranzo N, Thorleifsson G, Thorsteinsdottir U, Williams FM, Wilson SG, Zhou YH, Ralston SH, van Duijn CM, Spector T, Kiel DP, Stefansson K, Ioannidis JP, Uitterlinden AG. Twenty bone-mineral-density loci identified by large-scale meta-analysis of genome-wide association studies., 2009, 41(11): 1199–1206.

[13] Hsu YH, Zillikens MC, Wilson SG, Farber CR, Demissie S, Soranzo N, Bianchi EN, Grundberg E, Liang LM, Richards JB, Estrada K, Zhou YH, van Nas A, Moffatt MF, Zhai GJ, Hofman A, van Meurs JB, Pols HA, Price RI, Nilsson O, Pastinen T, Cupples LA, Lusis AJ, Schadt EE, Ferrari S, Uitterlinden AG, Rivadeneira F, Spector TD, Karasik D, Kiel DP. An integration of genome-wide association study and gene expression profiling to prioritize the discovery of novel susceptibility Loci for osteoporosis-related traits., 2010, 6(6): e1000977.

[14] Tan LJ, Liu R, Lei SF, Pan R, Yang TL, Yan H, Pei YF, Yang F, Zhang F, Pan F, Zhang YP, Hu HG, Levy S, Deng HW. A genome-wide association analysis implicates SOX6 as a candidate gene for wrist bone mass., 2010, 53(9): 1065–1072.

[15] Villalobos-Comparán M, Jiménez-Ortega RF, Estrada K, Parra-Torres AY, González-Mercado A, Pati?o N, Castillejos- López M, Quiterio M, Fernandez-López JC, Ibarra B, Romero-Hidalgo S, Salmerón J, Velázquez-Cruz R.A pilot genome-wide association study in postmenopausal mexican- mestizo women implicates the RMND1/CCDC170 locus is associated with bone mineral density., 2017, 2017: 5831020.

[16] Morris JA, Kemp JP, Youlten SE, Laurent L, Logan JG, Chai RC, Vulpescu NA, Forgetta V, Kleinman A, Mohanty ST, Sergio CM, Quinn J, Nguyen-Yamamoto L, Luco AL, Vijay J, Simon MM, Pramatarova A, Medina-Gomez C, Trajanoska K, Ghirardello EJ, Butterfield NC, Curry KF, Leitch VD, Sparkes PC, Adoum AT, Mannan NS, Komla-Ebri DSK, Pollard AS, Dewhurst HF, Hassall TAD, Beltejar MG, Adams DJ, Vaillancourt SM, Kaptoge S, Baldock P, Cooper C, Reeve J, Ntzani EE, Evangelou E, Ohlsson C, Karasik D, Rivadeneira F, Kiel DP, Tobias JH, Gregson CL, Harvey NC, Grundberg E, Goltzman D, Adams DJ, Lelliott CJ, Hinds DA, Ackert-Bicknell CL, Hsu YH, Maurano MT, Croucher PI, Williams GR, Bassett JHD, Evans DM, Richards JB. An atlas of genetic influences on osteoporosis in humans and mice., 2019, 51(2): 258–266.

[17] Medina-Gomez C, Kemp JP, Trajanoska K, Luan J, Chesi A, Ahluwalia TS, Mook-Kanamori DO, Ham A, Hartwig FP, Evans DS, Joro R, Nedeljkovic I, Zheng HF, Zhu K, Atalay M, Liu CT, Nethander M, Broer L, Porleifsson G, Mullin BH, Handelman SK, Nalls MA, Jessen LE, Heppe DHM, Richards JB, Wang C, Chawes B, Schraut KE, Amin N, Wareham N, Karasik D, Van der Velde N, Ikram MA, Zemel BS, Zhou YH, Carlsson CJ, Liu Y, McGuigan FE, Boer CG, B?nnelykke K, Ralston SH, Robbins JA, Walsh JP, Zillikens MC, Langenberg C, Li-Gao R, Williams FMK, Harris TB, Akesson K, Jackson RD, Sigurdsson G, den Heijer M, van der Eerden BCJ, van de Peppel J, Spector TD, Pennell C, Horta BL, Felix JF, Zhao JH, Wilson SG, de Mutsert R, Bisgaard H, Styrkársdóttir U, Jaddoe VW, Orwoll E, Lakka TA, Scott R, Grant SFA, Lorentzon M, van Duijn CM, Wilson JF, Stefansson K, Psaty BM, Kiel DP, Ohlsson C, Ntzani E, van Wijnen AJ, Forgetta V, Ghanbari M, Logan JG, Williams GR, Bassett JHD, Croucher PI, Evangelou E, Uitterlinden AG, Ackert-Bicknell CL, Tobias JH, Evans DM, RivadeneiraF.Life-Course genome-wide association study meta-analysis of total body BMD and assessment of age-specific effects., 2018, 102(1): 88–102.

[18] Chau D, Ng K, Chan TS, Cheng YY, Fong B, Tam S, Kwong YL, Tse E. Azacytidine sensitizes acute myeloid leukemia cells to arsenic trioxide by up-regulating the arsenic transporter aquaglyceroporin 9., 2015, 8: 46.

[19] Pelletier L, Rebouissou S, Paris A, Rathahao-Paris E, Perdu E, Bioulac-Sage P, Imbeaud S, Zucman-Rossi J. Loss of hepatocyte nuclear factor 1alpha function in human hepatocellular adenomas leads to aberrant activa-tionof signaling pathways involved in tumorigenesis., 2010, 51(2): 557–566.

[20] Krijger PHL, de Laat W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome., 2016, 17(12): 771–782.

[21] Lane JM, Russell L, Khan SN. Osteoporosis., 2000, (327): 139–150.

[22] Boudin E, Fijalkowski I, Hendrickx G, Van Hul W. Genetic control of bone mass., 2016, 432: 3–13.

[23] Huang QY. Genetic study of complex diseases in the post-GWAS era., 2015, 42(3): 87–98.

[24] ENCODE Project Consortium.An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome., 2012, 489(7414): 57–74.

[25] Ding N, Qu HZ, Fang XD. The ENCODE project and functional genomics studies., 2014, 36(3): 237–247.丁楠, 渠鴻竹, 方向東. ENCODE計劃和功能基因組研究.遺傳, 2014, 36(3): 237–247.

[26] Bernstein BE, Stamatoyannopoulos JA, Costello JF, Ren B, Milosavljevic A, Meissner A, Kellis M, Marra MA, Beaudet AL, Ecker JR, Farnham PJ, Hirst M, Lander ES, Mikkelsen TS, Thomson JA.The NIH roadmap epigenomics mapping consortium., 2010, 28(10): 1045–1048.

[27] Kilpinen H, Waszak SM, Gschwind AR, Raghav SK, Witwicki RM, Orioli A, Migliavacca E, Wiederkehr M, Gutierrez-Arcelus M, Panousis NI, Yurovsky A, Lappalainen T, Romano-Palumbo L, Planchon A, Bielser D, Bryois J, Padioleau I, Udin G, Thurnheer S, Hacker D, Core LJ, Lis JT, Hernandez N, Reymond A, Deplancke B, Dermitzakis ET. Coordinated effects of sequence variation on DNA binding, chromatin structure, and transcription., 2013, 342(6159): 744–747.

[28] Xiao SM, Gao Y, Cheung CL, Bow CH, Lau KS, Sham PC, Tan KC, Kung AW. Association of CDX1 binding site of periostin gene with bone mineral density and vertebral fracture risk., 2012, 23(7): 1877–1887.

[29] Xiao SM, Kung AW, Gao Y, Lau KS, Ma A, Zhang ZL, Liu JM, Xia W, He JW, Zhao L, Nie M, Fu WZ, Zhang MJ, Sun J, Kwan JS, Tso GH, Dai ZJ, Cheung CL, Bow CH, Leung AY, Tan KC, Sham PC. Post-genome wide association studies and functional analyses identify association of MPP7 gene variants with site-specific bone mineral density., 2012, 21(7): 1648–1657.

[30] Zhu DL, Chen XF, Hu WX, Dong SS, Lu BJ, Rong Y, Chen YX, Chen H, Thynn HN, Wang NN, Guo Y, Yang TL.Multiple functional variants at 13q14 risk locus for osteoporosis regulate RANKL expression through long- range super-enhancer., 2018, 33(7): 1335–1346.

The osteoporosis susceptible SNP rs4325274 remotely regulates thegene through enhancers

Xiaomei Tuo1, Dongli Zhu1,2, Xiaofeng Chen1, Yu Rong1, Yan Guo1, Tielin Yang1,2

Osteoporosis is a typical polygenic disease, and its heritability is as high as 85%. The incidence of osteoporosis has jumped to the fifth among the common diseases. Although a large number of osteoporosis-susceptible SNPs have been identified, most of them are in the non-coding regions of the genome and the functional mechanisms are unknown. The purpose of this study was to explore the function of non-coding osteoporosis-susceptible SNP rs4325274 and dissect the molecular regulatory mechanisms through integrating bioinformatics analysis and functional experiments. Firstly, we found the SNP rs4325274 resided in a putative enhancer element through functional annotation. eQTL and Hi-C analysis found that thegene might be a potential distal target of rs4325274. We conducted the motif prediction using multiple databases and verified the result using ChIP-seq data from GEO database. The result showed that the transcription factorcould preferentially bind to SNP rs4325274-G allele. We further demonstrated that SNP rs4325274 acted as an enhancer regulatinggene expression by using dual-luciferase reporter assays. Knockdown ofdecreased thegene expression. Taken together, our results uncovered a new mechanism of a non-coding functional SNP rs4325274 as a distal enhancer to modulateexpression, which provides new insights into deciphering molecular regulatory mechanisms underlying non-coding susceptibility SNPs on complex diseases.

SNP rs4325274;gene; transcription factor; mechanism of osteoporosis

2020-05-26;

2020-09-04

國家自然科學基金面上項目(編號：31771399，31970569)，中國博士后基金項目(編號：2019M650261)，陜西省自然科學基礎研究計劃項目(編號：2020JQ-026)和浙江省自然科學基金(編號：GF18C060003)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31771399, 31970569), China PostdoctoralScience Foundation (No. 2019M650261), Natural Science Basic Research Plan in Shaanxi Province of China (No. 2020JQ-026), and the Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (No. GF18C060003)]

妥曉梅，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：疾病分子遺傳機制的基礎研究。E-mail: xmt18392079044@stu.xjtu.edu.cn

楊鐵林，博士，教授，研究方向：生物信息分析及復雜疾病遺傳致病機制研究。E-mail: yangtielin@xjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-098

2020/9/10 7:21:15

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200908.1130.004.html

(責任編委: 周鋼橋)