扈若凡 徐少勇,2 沈涵,3 景策,4 賈愛(ài)華,5 魚(yú)馨文 邢影 梁聲茹 明潔 姬秋和

1空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安 710032; 2湖北文理學(xué)院襄陽(yáng)市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 441021; 3北京四季青醫(yī)院內(nèi)科 100097; 4首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科 100176; 5榆林市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科 718000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損害因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[1-2]。NAFLD已成為21世紀(jì)影響公眾健康的重要疾病之一，2016年的一項(xiàng)薈萃分析顯示，NAFLD的全球患病率為25.24%[3]。細(xì)胞角蛋白-18(CK-18)是一種肝臟蛋白質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，能夠反映非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中肝細(xì)胞凋亡的程度，并與NASH炎性反應(yīng)和肝纖維化程度密切相關(guān)。在《NAFLD防治指南(2018更新版)》中的推薦意見(jiàn)提出，CK-18持續(xù)升高的NAFLD患者是NASH的高危人群，建議通過(guò)肝組織活檢明確診斷[4]。研究發(fā)現(xiàn)，與未患2型糖尿病(T2DM)者相比，患有T2DM的NAFLD者基線(xiàn)CK-18水平明顯升高[5]。CK-18的測(cè)定可能是NAFLD人群中T2DM發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)有用指標(biāo)。但既往研究樣本量較小，研究結(jié)果可能有潛在的選擇性偏倚。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)空腹血糖與血清CK-18水平呈正相關(guān)，且這種相關(guān)性可能與NAFLD無(wú)關(guān)，但研究是在T2DM人群中進(jìn)行的[6]。因此有必要進(jìn)行大規(guī)模人群研究來(lái)驗(yàn)證。

本研究的目的是探討以超聲診斷的NAFLD人群中，血清CK-18水平是否與T2DM風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 根據(jù)2007—2008年中國(guó)糖尿病和代謝紊亂調(diào)查(CNDMDS)的結(jié)果，進(jìn)行為期至少5年的隊(duì)列研究?；€(xiàn)研究于2007年8月至2008年6月完成，后續(xù)研究于2012年6月至2013年10月完成。每次研究受試者都填寫(xiě)相同的問(wèn)卷。在陜西省西安地區(qū)(包括市、縣、鄉(xiāng)、村)的CNDMDS中共招募1 915名受試者，806名受試者(42.1%)同意參與研究并完成隨訪(fǎng)問(wèn)卷。排除了在基線(xiàn)時(shí)通過(guò)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)或自我報(bào)告的T2DM患者、糖尿病前期者、酒精過(guò)量攝入者、關(guān)鍵數(shù)據(jù)缺失、懷疑繼發(fā)于肝硬化或惡性腫瘤者、CK-18缺失者或血清CK-18異常者，最終共有457名受試者納入本研究作為研究人群。

糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)1999年WHO標(biāo)準(zhǔn)[7]。糖尿?。嚎崭寡恰?.0 mmol/L，或口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)餐后2 h血糖(2 hPPG)≥11.1 mmol/L或自我報(bào)告的正在服用降糖藥物。糖尿病前期：6.1 mmol/L≤空腹血糖<7.0 mmol/L 為空腹血糖受損(IFG)； 7.8 mmol/L≤2 hPPG<11.1 mmol/L為糖耐量減低(IGT)。正常血糖：空腹血糖<6.1 mmol/L且OGTT 2 hPPG< 7.8 mmol/L。NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)具備以下 3 項(xiàng)腹部超聲表現(xiàn)中的 2 項(xiàng)，且排除過(guò)量飲酒和其他影響因素：肝臟近場(chǎng)回聲彌漫性增強(qiáng)(“明亮肝”) ，回聲強(qiáng)于腎臟；肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)顯示不清；肝臟遠(yuǎn)場(chǎng)回聲逐漸衰減[8]。

根據(jù)上述納入標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入457名受試者。根據(jù)超聲對(duì)脂肪肝的診斷，分為NAFLD組(94例)和非NAFLD組(363例)。根據(jù)CK-18水平，NAFLD組被進(jìn)一步分為高CK-18-NAFLD組(48例)和低CK-18-NAFLD組(46例)。研究方案符合1975年《赫爾辛基宣言》的倫理準(zhǔn)則，經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院獨(dú)立倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者在研究開(kāi)始前均被告知并簽署了知情同意書(shū)。

1.2 數(shù)據(jù)采集 接受統(tǒng)一培訓(xùn)的醫(yī)生或護(hù)士使用標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷收集人口學(xué)資料、疾病個(gè)人史、家族史和生活方式的數(shù)據(jù)。本研究中吸煙者被定義為在其一生中至少吸煙100支的人；飲酒被定義為在1年內(nèi)每周攝入至少30 g酒精；定期體育鍛煉被定義為每周至少進(jìn)行3次體育活動(dòng)，每次至少30 min。

1.2.1 CK-18測(cè)量 使用M30凋亡酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(Apoptosis Biomarker Assay)試劑盒(Peviva，斯德哥爾摩，瑞典)和多功能酶標(biāo)儀Spectra Max 190 Molecular Devices(Tecan Trading AG，瑞士)測(cè)定血清CK-18。

1.2.2 人體測(cè)量學(xué)指標(biāo) 受試者赤足身著輕便衣物測(cè)量身高和體重。體重指數(shù)使用體重(kg)/身高2(m2)計(jì)算。腰圍測(cè)定要求受試者站立時(shí)體重均勻分布，并使用卷尺測(cè)量髂前上棘和第十二肋骨下緣之間中點(diǎn)的徑線(xiàn)，測(cè)得的腰圍精確到0.1 cm。在安靜環(huán)境下休息至少5 min后，使用臺(tái)式水銀血壓計(jì)測(cè)量右上臂兩次血壓。所有受試者禁食至少8 h，無(wú)糖尿病病史受試者進(jìn)行75 g OGTT，有糖尿病病史的受試者進(jìn)行饅頭餐試驗(yàn)以確保安全。采集空腹血測(cè)定甘油三酯、高密度脂蛋白-膽固醇、低密度脂蛋白-膽固醇、總膽固醇和胰島素。

2 結(jié)果

在參與基線(xiàn)研究的1 915名受試者中，806名受試者(42.1%)同意并完成5年隨訪(fǎng)研究。3組在年齡、吸煙史、運(yùn)動(dòng)史、糖尿病家族史、收縮壓和舒張壓上均無(wú)顯著性差異(P均>0.05)。然而，高CK-18-NAFLD和低CK-18-NAFLD組的性別、體重指數(shù)、空腹血糖、甘油三酯和高密度脂蛋白-膽固醇水平均顯著高于非NAFLD組(P均<0.001)，見(jiàn)表1。

457名受試者基線(xiàn)時(shí)血清CK-18水平為125.3 U/L(95%CI: 57.3～476.6)，數(shù)據(jù)分布如圖1所示。血清CK-18在高CK-18-NAFLD組為235.9(167.3，392.5)U/L，顯著高于非-NAFLD組[(120.6(87.6，186.3)U/L，F(xiàn)=116.019，P<0.001]。血清CK-18在低CK-18-NAFLD組[(105.2(75.6，116.9)]U/L和非NAFLD組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.457，P=0.068)，見(jiàn)圖2。

經(jīng)過(guò)5年的隨訪(fǎng)，457名受試者中有19例診斷為糖尿病。非NAFLD組、低CK-18-NAFLD組和高CK-18-NAFLD組的T2DM發(fā)病率分別為2.5%(9/363)、8.7%(4/46)和12.5%(6/48)。

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示，與非NAFLD組相比，經(jīng)多變量調(diào)整后，低CK-18-NAFLD組和高CK-18-NAFLD組T2DM相對(duì)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(RR)分別為3.37(95%CI: 1.05～10.86，P=0.042)和4.71(95%CI: 1.71～12.99，P=0.003)，見(jiàn)表2。

3 討論

本研究為后續(xù)研究，筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)，患有NAFLD的中國(guó)人群T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，NAFLD是T2DM的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[9]。這項(xiàng)早期研究的結(jié)果與其他既往的研究一致[10-12]。而本研究是基于人群并有5年隨訪(fǎng)期的隊(duì)列研究，結(jié)果也提示NAFLD人群患T2DM的5年風(fēng)險(xiǎn)更高。

表1 研究人群基線(xiàn)資料

表2 NAFLD與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的回歸分析

CK-18是肝臟主要的蛋白質(zhì)代謝中間產(chǎn)物，凋亡細(xì)胞會(huì)因細(xì)胞基質(zhì)的完整性喪失而大量釋放CK-18[13]。由于CK-18主要由caspase-3產(chǎn)生，而caspase-3在NASH肝中有活性[14]。因此NASH患者血清CK-18可能升高。表明CK-18在某種程度上可以作為反映NAFLD纖維化程度的一種生物標(biāo)志物[15-17]。Nagpal等[5]研究評(píng)估了肝活檢診斷的NAFLD患者的基線(xiàn)CK-18水平是否可以預(yù)測(cè)糖尿病的未來(lái)發(fā)展。然而，這項(xiàng)研究的樣本量較小(僅跟蹤了25例患者)。因此，作者無(wú)法推導(dǎo)出CK-18預(yù)測(cè)糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的RR值，并且無(wú)法在分析中校正相關(guān)影響因素。同時(shí)，研究人群中可能存在選擇偏倚，因?yàn)榻邮芨位顧z的受試者可能有更嚴(yán)重的NAFLD。此外，理想情況下，應(yīng)納入沒(méi)有任何NAFLD證據(jù)的健康人群作對(duì)照組[18]。盡管如此，這項(xiàng)初步研究仍然很有意義，因?yàn)樗砻骰€(xiàn)血清CK-18可用于預(yù)測(cè)NAFLD患者糖尿病的發(fā)展。

本研究是一項(xiàng)基于人群的隊(duì)列研究，結(jié)果證明NAFLD患者血清CK-18水平升高與T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高可能存在相關(guān)性。與非NAFLD組相比，低CK-18-NAFLD組和高CK-18-NAFLD組的RR值分別為3.37(95%CI: 1.05～10.86)和4.71(95%CI: 1.71～12.99)，提示在NAFLD人群中，高CK-18水平可能伴隨著更高的糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。盡管與高CK-18-NAFLD組相比，低CK-18-NAFLD組的T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)并未有顯著性差異(RR=1.682，95%CI：0.321～5.315)，這主要是因?yàn)闃颖玖坎蛔闼隆？紤]到以人群為基礎(chǔ)的隊(duì)列研究的困難，基于本研究的94例NAFLD患者的樣本量?jī)H能提供51.99%(RR=1.682,α=0.05，SD=1.25)的把握度。但是本研究提示CK-18在NAFLD中可能用于預(yù)測(cè)糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，未來(lái)仍需要更多和更大樣本量的相關(guān)研究。

與Nagpal等[5]的研究不同，本研究沒(méi)有使用肝活檢來(lái)證實(shí)NAFLD，意味著結(jié)論可能只能是暫時(shí)性的。NAFLD患者T2DM的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，提示應(yīng)尋找更準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)的方法來(lái)確定高危人群。超聲由于其便于實(shí)際應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，在脂肪肝的臨床篩查中得到了廣泛的應(yīng)用。CK-18檢測(cè)作為另一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)性研究，除可能為NASH與其他NAFLD的鑒別提供額外的信息外，還可能用于篩查糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此，建議首先使用超聲篩查NAFLD，如果可能的話(huà)，隨后使用CK-18檢測(cè)篩查有較高糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，以便在疾病早期提供積極的治療。

本研究設(shè)計(jì)相對(duì)嚴(yán)密，但仍有局限性。首先，隨訪(fǎng)率仍然相對(duì)較低(42.1%)，這是我國(guó)所有基于人群的隊(duì)列研究面臨的共同問(wèn)題。其次，本研究大多數(shù)受試者沒(méi)有肝纖維化的跡象，并且在高CK-18-NAFLD組中受試者的數(shù)量相對(duì)較少。最后，由于沒(méi)有進(jìn)行肝活檢，本研究無(wú)法定義一個(gè)合適的CK-18濃度切點(diǎn)來(lái)明確區(qū)分NASH和單純NAFLD，因此只能采用兩分法進(jìn)行分組研究。

綜上所述，本研究表明，超聲診斷的NAFLD患者CK-18水平與T2DM風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性。因?yàn)槌暫虲K-18檢測(cè)都是無(wú)創(chuàng)性檢查，建議首先使用超聲篩查NAFLD；如果可能，使用CK-18檢測(cè)篩查出具有更高糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)的人群，這將有助于在疾病的早期階段進(jìn)行積極主動(dòng)的管控。