李媛 劉明明 張堅

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，微循環(huán)研究所，北京 100005

糖尿病是以血糖升高為主要臨床特征的內(nèi)分泌系統(tǒng)綜合征，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。糖尿病動物模型是研究糖尿病病因機(jī)制及防治策略的重要基礎(chǔ)。嚙齒類動物中，大、小鼠因其體型較小、遺傳學(xué)背景明確及對實驗條件反應(yīng)一致，是目前糖尿病研究中應(yīng)用最廣泛的模型來源動物。本綜述擬對傳統(tǒng)和基于基因編輯和遺傳育種新技術(shù)的糖尿病大、小鼠模型建模方法進(jìn)行比較，并探討其在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 經(jīng)典糖尿病及并發(fā)癥動物模型

經(jīng)典糖尿病模型常采用鏈脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶等胰島β細(xì)胞毒性藥物和特殊飲食誘導(dǎo)。STZ可通過β細(xì)胞表面葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2進(jìn)入胞內(nèi)，引起DNA烷基化，激活多聚ADP-核糖基化，導(dǎo)致胞內(nèi)NAD+和ATP耗竭，抑制β細(xì)胞功能；STZ還可使ATP去磷酸化增強(qiáng)，為黃嘌呤氧化酶提供底物，形成超氧自由基、過量過氧化氫(H2O2)和羥自由基，損傷β細(xì)胞。四氧嘧啶同屬β細(xì)胞毒劑，通過氧化還原反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽生成超氧陰離子、H2O2和羥自由基，直接損傷β細(xì)胞。特殊飲食法多采用高糖高脂飼料誘發(fā)模型動物胰島素抵抗。在特殊飲食基礎(chǔ)上聯(lián)合β細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)，可使模型動物在胰島素抵抗基礎(chǔ)上出現(xiàn)β細(xì)胞損傷。

與糖尿病分型一致，用于糖尿病研究的動物模型主要分為1型糖尿病、2型糖尿病等。單次大劑量或多次小劑量腹腔注射β細(xì)胞毒劑可引起β細(xì)胞廣泛破壞，激活胰島免疫應(yīng)答，與1型糖尿病發(fā)病機(jī)制相似，是目前應(yīng)用最廣泛的1型糖尿病模型構(gòu)建方法。采用特殊飲食誘導(dǎo)輔以小劑量β細(xì)胞毒劑，可使模型動物表現(xiàn)出糖尿病典型表型及超重、高血脂、高胰島素血癥和胰島素抵抗等特征，是較為常用的2型糖尿病模型建立方法。

此外，尚有學(xué)者通過其他方法制備糖尿病動物模型(如應(yīng)用柯薩奇B病毒感染小鼠致胰島細(xì)胞炎性反應(yīng)及β細(xì)胞壞死，誘導(dǎo)1型糖尿病動物模型[1]；采用高脂飲食聯(lián)合低劑量地塞米松，抑制胰島素與受體結(jié)合，影響葡萄糖攝取和利用，建立2型糖尿病模型[2])。因糖尿病發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性和β細(xì)胞毒性藥物介導(dǎo)的多臟器非特異性受累，上述糖尿病及其并發(fā)癥大、小鼠傳統(tǒng)模型并不能完全復(fù)現(xiàn)人類疾病進(jìn)程(表1、2)，具有部分局限性[3-14]。

2 基因編輯技術(shù)建立的糖尿病動物模型

近年來，基于ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9等遺傳工程和基因編輯技術(shù)，對糖代謝相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)或組成進(jìn)行修飾改造，并通過育種技術(shù)使編輯后的基因組傳遞給子代，引起子代動物出現(xiàn)糖尿病典型表現(xiàn)，為糖尿病研究提供了動物模型更優(yōu)選擇。

目前，用于基因編輯技術(shù)的靶基因主要包括胰島素受體(IR)、胰島素底物受體1(IRS-1)、胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4(GLUT-4)等。IR基因缺失純合子(IR-/-)小鼠出生后即出現(xiàn)輕度胰島素抵抗伴β細(xì)胞增生，IR+/-/IRS-1+/-雙基因敲除的雜合體小鼠可發(fā)生顯性糖尿病，伴有高胰島素血癥和胰島β細(xì)胞增生，存在明顯胰島素抵抗。GK-/-小鼠為非肥胖l型糖尿病模型動物，與具有胰島素抵抗表型的IRS-1-/-小鼠雜交，其后代可表現(xiàn)為胰島素分泌異常[15]。敲除IGF-1R基因的純合子(IGF-1R-/-)小鼠短期內(nèi)可出現(xiàn)胰島素抵抗。MKR小鼠IGF-1R雜交型受體的形成導(dǎo)致其胰島素受體功能異常，表現(xiàn)為顯著胰島素抵抗、高血糖、β細(xì)胞功能紊亂及脂代謝紊亂[16]。GLUT-4基因缺失的小鼠表現(xiàn)出明顯胰島素抵抗和高血糖。上述利用遺傳育種和基因編輯新技術(shù)建立的糖尿病動物模型具有良好的遺傳穩(wěn)定性，同時在一定程度上彌補(bǔ)了經(jīng)典糖尿病建模方法在模型誘導(dǎo)機(jī)制和糖尿病表型特異性方面的缺陷。

表1 糖尿病大、小鼠模型構(gòu)建方法及特點

表2 糖尿病并發(fā)癥模型構(gòu)建方法及特點

3 基于新技術(shù)的糖尿病及并發(fā)癥動物模型應(yīng)用

早時項胰島素分泌不足是人類2型糖尿病早期重要臨床表現(xiàn)。在誘發(fā)型糖尿病動物模型中，現(xiàn)有2型糖尿病動物模型較少能復(fù)現(xiàn)早期胰島β細(xì)胞功能受損的病理表型，有學(xué)者應(yīng)用每3 d注射30 mg/kg STZ聯(lián)合高脂飲食改良了經(jīng)典2型糖尿病動物模型的誘導(dǎo)方法，使其更適合研究人類2型糖尿病的病因?qū)W和疾病進(jìn)程[17]。此外，STZ誘導(dǎo)劑量具有周齡依賴性，選擇周齡適配的STZ誘導(dǎo)劑量有助于提高糖尿病模型穩(wěn)定性[18]。

在自發(fā)性糖尿病動物模型中，BTBR ob/ob糖尿病小鼠模型早期即可產(chǎn)生視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)和功能受損，隨著疾病進(jìn)展出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管改變，故其較其他2型糖尿病動物模型更適合糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究[9]。SDT(spontaneously diabetic Torii)肥胖大鼠經(jīng)1/2腎切除術(shù)后，可出現(xiàn)殘腎功能受損等慢性腎病表現(xiàn)，故適于作為糖尿病腎病早期發(fā)病研究的動物模型[12]。KK-Ay/Ta小鼠予20%酪蛋白飲食后，其尿酸、葡萄糖和甘油三酯水平顯著升高，適合用于研究高尿酸血癥與胰島素抵抗間的內(nèi)在聯(lián)系[19]。胰島素分泌過少(insulin hyposecretion，IHS)小鼠存在非炎性β細(xì)胞體積減小，表現(xiàn)為非肥胖自發(fā)性糖尿病，適用于探索胰島素分泌缺陷未知基因[20]。此外，SDT肥胖大鼠存在腦萎縮和認(rèn)知功能損害，并表現(xiàn)出抑郁樣行為[21]，同時存在周圍神經(jīng)病變[22]和中樞神經(jīng)紊亂，可用于糖尿病與帕金森病、阿爾茨海默病或抑郁癥等神經(jīng)退行性疾病關(guān)系的研究[14]。

基因編輯技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)建模方法的局限性。傳統(tǒng)化學(xué)誘導(dǎo)1型糖尿病動物模型僅能復(fù)制血糖升高表型，未能復(fù)現(xiàn)自身免疫病因和疾病演變進(jìn)程，而通過人HLA-A*02:01/HLA-DQ8雙轉(zhuǎn)基因和遺傳育種技術(shù)獲得的MHC Ⅰ類、MHC Ⅱ類和胰島素基因缺乏的YES小鼠可復(fù)現(xiàn)人類1型糖尿病的自身免疫進(jìn)程[23]。MKR小鼠因骨骼肌胰島素信號通路受損，可同時出現(xiàn)骨骼肌、脂肪組織和肝組織胰島素抵抗，伴高脂血癥和脂質(zhì)堆積，與人類2型糖尿病脂肪代謝障礙的病理機(jī)制相似[10]。GK/IRS-1雙基因敲除小鼠可表現(xiàn)為糖耐量減退、肝細(xì)胞和β細(xì)胞葡萄糖敏感性下降，與人類2型糖尿病癥狀相似[15]。腺病毒DJ/8靶向敲除肝臟低密度脂蛋白受體(IDOL-AAV-DJ/8)的BTBR Lepob小鼠可同時表現(xiàn)糖尿病腎病和動脈粥樣硬化的病理表型，適用于研究糖尿病腎病和動脈粥樣硬化治療策略[24]。10～14周齡Tally-Ho小鼠存在中度高胰島素血癥、高脂血癥和肥胖，更適合遲發(fā)型2型糖尿病的研究[25]。FATZO小鼠予高脂飲食后可出現(xiàn)高血糖和高膽固醇血癥，肝組織出現(xiàn)脂肪變性、小葉炎性反應(yīng)、氣球樣變和纖維化等病理改變，適用于研究糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病[26]。E3L.GK+/-小鼠予高脂飲食喂養(yǎng)后，空腹血糖、膽固醇和甘油三酯水平顯著升高，發(fā)生嚴(yán)重動脈粥樣硬化，故E3L.GK+/-小鼠是研究糖尿病合并動脈粥樣硬化的理想動物模型[27]。TspocKO(Nr5a1-Cre+/-，Tspofl/fl)小鼠因腎上腺素升高導(dǎo)致肝葡萄糖生成增加，表現(xiàn)為持續(xù)高血糖，同時，該模型動物對促腎上腺皮質(zhì)激素缺乏反應(yīng)，可作為研究糖尿病與應(yīng)激壓力的模型選擇[28]。

上述糖尿病傳統(tǒng)動物模型改良、遺傳育種技術(shù)和新的基因編輯建立的糖尿病動物模型為深入研究糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步闡明遺傳、環(huán)境和免疫因素在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用提供了較為理想的實驗動物工具。同時，有助于糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防和早期干預(yù)研究及新的糖尿病治療藥物的研發(fā)。

4 結(jié)語和展望

糖尿病及其并發(fā)癥動物模型作為人類代謝疾病的模擬工具廣泛應(yīng)用于相關(guān)基礎(chǔ)研究。因種屬差異性，目前仍缺乏可完全模擬和復(fù)現(xiàn)人類糖尿病及其并發(fā)癥疾病進(jìn)程的動物模型。傳統(tǒng)模型構(gòu)建方法存在諸多弊端，如缺乏統(tǒng)一模型建立和成模判斷標(biāo)準(zhǔn)、僅能復(fù)現(xiàn)人類糖尿病及并發(fā)癥部分表型等，故具有部分局限性?；诨蚓庉嫼瓦z傳育種新技術(shù)構(gòu)建的糖尿病及其并發(fā)癥動物模型，在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的缺陷，更符合糖尿病及其并發(fā)癥的疾病進(jìn)程機(jī)制。依據(jù)不同研究目的，選擇適合的糖尿病及其并發(fā)癥動物模型是研究結(jié)果可靠性和研究結(jié)論準(zhǔn)確性的重要保障，是進(jìn)一步闡明糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)，同時也是篩選新的糖尿病治療藥物的必要條件。