摘要：為進(jìn)一步探討利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)蜂毒肽的方法，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性、基因GC含量、合成蛋白加工需求等對蜂毒前溶血肽原基因序列進(jìn)行改造，并利用人工化學(xué)合成方法完成改造后全基因的合成。構(gòu)建蜂毒前溶血肽原與GST融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后分別在20、37 ℃條件下經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，并利用SDS-PAGE和Western Blot對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，表達(dá)體系成功表達(dá)了目的融合蛋白，在20 ℃條件下可獲得可溶性表達(dá)產(chǎn)物，為進(jìn)一步分離純化目的蛋白及獲得蜂毒肽提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蜂毒前溶血肽原;蜂毒肽;原核表達(dá);融合蛋白

中圖分類號：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0087-04

蜂毒肽（melittin）又稱蜂毒溶血肽，是蜂毒（bee venom）的主要活性成分之一[1]，在抗菌[2-3]、消炎[4]、抗腫瘤[5-6]乃至肌肉再生[7]等方面具有一定應(yīng)用價值。目前基因工程技術(shù)為蜂毒肽生產(chǎn)提供了新的途徑[8-9]，但從研究到生產(chǎn)仍有一定距離。

蜂毒前溶血肽原（melittin precursor/Prepromelittin）是prepromelittin基因的表達(dá)產(chǎn)物，在蜜蜂體內(nèi)合成后首先加工成蜂毒溶血肽原（蜂毒肽前體蛋白，promelittin），這是蜂毒肽的前體形式，可被進(jìn)一步水解而形成蜂毒肽[10]。蜂毒前溶血肽原由70個氨基酸殘基構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)主要包括信號肽（1～21 aa，aa為氨基酸個數(shù)的縮寫）、低復(fù)雜性區(qū)域（22～43 aa）和蜂毒肽結(jié)構(gòu)域（44～69 aa）[11]。與蜂毒肽相比，蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度，且對細(xì)胞的破壞能力小[12]，可以考慮作為利用基因工程方法在體外合成蜂毒肽的初始產(chǎn)物。

本研究通過全基因合成的方法合成了改造后的蜂毒前溶血肽原基因，構(gòu)建了蜂毒前溶血肽原與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）融合表達(dá)重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了目的融合蛋白，為利用基因工程方法生產(chǎn)蜂毒肽提供了一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

表達(dá)載體pGEX-4T-1、大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞及Pfu DNA聚合酶、緩沖液A（PBS，pH值7.4）、緩沖液B[8 mol/L尿素（urea）、50 mmol/L Tris-HCl（三羥甲基氨基甲烷與鹽酸配成的常用緩沖劑）、300 mmol/L 氯化鈉，pH值8.0]、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、蛋白Marker、TMB顯色試劑盒、Western Blot一抗、Western Blot二抗等分子生物學(xué)試劑均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因改造、合成及擴增 蜂毒前溶血肽原基因序列信息來自NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫（登錄號：NM_001011607），選擇其CDS序列，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好并考慮其序列GC含量、酶切位點等信息對蜂毒前溶血肽原基因進(jìn)行改造。利用CondonW等軟件對改造后的序列最優(yōu)密碼子使用頻率、GC含量（DNA的4種堿基中，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率）等進(jìn)行分析[13]。

根據(jù)改造后的基因序列，利用人工化學(xué)合成方法進(jìn)行全基因合成，設(shè)計并合成引物對合成基因進(jìn)行PCR擴增，所用引物序列如圖1所示。上游引物中引入EcoRⅠ酶切位點，下游引物中引入SalⅠ酶切位點?；蚣耙锖铣晒ぷ魑猩ど锕こ?/p>

（上海）股份有限公司完成。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用DNA純化試劑盒回收目的片段。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和Sal Ⅰ對回收的PCR產(chǎn)物及pGEX-4T-1載體進(jìn)行雙酶切，回收酶切后的目的片段及載體。利用T4 DNA連接酶將酶切后獲得的目的片段與載體進(jìn)行連接，獲得蜂毒前溶血肽原與GST融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含有50 μg/mL氨芐青霉素的平板培養(yǎng)過夜后，篩選陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定并由生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。

1.2.3 蛋白表達(dá) 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，42 ℃熱激90 s后涂布到含有50 μg/mL氨芐青霉素的平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆到含有50 μg/mL氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液D600 nm值達(dá)到0.6時，加入0.5 mmol/L的誘導(dǎo)劑（IPTG），分別置于20 ℃條件下培養(yǎng)過夜、37 ℃條件下培養(yǎng)6 h，以未添加誘導(dǎo)劑的菌液為陰性對照。

菌液經(jīng)離心后棄上清，收集菌體。在收集到的菌體中加入緩沖液A懸浮，使用超聲破碎儀使其充分溶解，離心，分別收集上清和沉淀。收集的沉淀使用緩沖液B進(jìn)行溶解。分別對收集的上清和沉淀溶解液處理后制備樣本，利用SDS-PAGE和Western Blot進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化后的基因序列信息

改造后的DNA序列長度為213 bp，在蜂毒肽對應(yīng)的核酸序列前加入1個密碼子AAC，使其表達(dá)Asn，從而形成Asn-Gly位點，用于通過羥胺裂解獲得蜂毒肽[8]。根據(jù)生物信息學(xué)分析可知，蜂毒前溶血肽原基因的表達(dá)產(chǎn)物末端氨基酸殘基為Gly，而蜂毒肽末端缺少Gly，故在改造后的序列中刪除了其對應(yīng)的密碼子GGT（圖2），保證了表達(dá)產(chǎn)物被酶切割后的蜂毒肽產(chǎn)物長度為26個氨基酸。改造后的序列中，大腸桿菌最優(yōu)密碼子使用頻率多在90%以上（占85%）（圖3），其GC含量為50.2%，且無異常GC峰。其序列中無一般順式作用元件（Cis-acting elements）序列。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切檢測

根據(jù)電泳結(jié)果可知，重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物主要是約5 000 bp和200 bp的2個片段（圖4）。其中大片段為載體質(zhì)粒，小片段為插入的基因片段。插入片段的測序結(jié)果與預(yù)定改造后的蜂毒前溶血肽原DNA序列一致（圖2），且能與pGEX-4T-1載體中的GST基因序列形成正確的讀碼框。重組質(zhì)粒圖譜如圖5所示。

2.3 蛋白表達(dá)檢測

含有重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel的工程菌在20 ℃和37 ℃條件下進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，2個溫度條件下的產(chǎn)物在約35 ku處均有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，大小與預(yù)期融合蛋白大小符合（圖6），由GST和蜂毒前溶血肽原構(gòu)成。為進(jìn)一步確定目的蛋白的表達(dá)情況，按照Western Blot步驟用TMB顯色試劑盒顯色。結(jié)果顯示，在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶（圖7），進(jìn)一步表明目的蛋白已成功表達(dá)。但在37 ℃培養(yǎng)條件下，目的蛋白主要出現(xiàn)在沉淀中，表明表達(dá)產(chǎn)物主要為包涵體形式存在。而在20 ℃條件下，上清液和沉淀中均出現(xiàn)了表達(dá)產(chǎn)物，說明此溫度下表達(dá)產(chǎn)物一部分以可溶性蛋白的形式存在，一部分以包涵體形式存在。

3 討論與結(jié)論

利用人工化學(xué)合成技術(shù)獲得全基因序列為基因的改造提供了方便。這種方法既可以縮短合成周期，又為序列的正確性提供了保障。同時，在進(jìn)行原核表達(dá)時，可以有效地根據(jù)原核生物密碼子偏好性及其他需要對目的片段的基因序列進(jìn)行優(yōu)化及定點突變，密碼子的優(yōu)化將有利于目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)高效精確地表達(dá)。蜂毒前溶血肽原基因CDS序列全長僅213 bp，可以按一定原則對其進(jìn)行充分改造，再利用上述方法將其合成，使之滿足在不同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的需要。對基因序列進(jìn)行改造過程中考慮到應(yīng)用羥胺裂解方法對GST-蜂毒前溶血肽原融合蛋白進(jìn)行處理以獲得蜂毒肽，所以在原序列上添加了相應(yīng)氨基酸對應(yīng)的密碼子（AAC），使表達(dá)產(chǎn)物中蜂毒肽結(jié)構(gòu)域前形成羥胺裂解位點（Asn-Gly）。若考慮通過其他酶或化學(xué)物質(zhì)從表達(dá)產(chǎn)物上將蜂毒肽切割下來，可以設(shè)計其他相應(yīng)密碼子，如利用腸激酶作用位點時[9]，可在蜂毒前溶血肽原基因中蜂毒肽對應(yīng)的序列首密碼子前添加GAC GAC GAC GAC AAG序列。已知多種酶或化學(xué)試劑在蜂毒前溶血肽原上沒有切割位點或在蜂毒肽結(jié)構(gòu)域沒有切割位點，可以按照此思路在蜂毒肽前溶血肽原基因中相應(yīng)位置添加對應(yīng)的密碼子序列[8]。

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)蜂毒肽被看作是獲得蜂毒肽的新途徑，研究者關(guān)注蜂毒肽對細(xì)胞的毒性，探索利用融合蛋白等方式實現(xiàn)蜂毒肽在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞中的表達(dá)?？紤]到蜂毒肽在蜜蜂體內(nèi)以其前體蛋白蜂毒前溶血肽原的形式表達(dá)，筆者設(shè)計了蜂毒前溶血蛋白原的全基因序列，期望以此降低其對細(xì)胞的破壞作用。為了便于從表達(dá)產(chǎn)物中分離目的蛋白，選擇了利用GST融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。構(gòu)建的蜂毒前溶血肽原與GST融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel能夠在不同溫度下進(jìn)行表達(dá)，其在20 ℃條件下表達(dá)的目的蛋白一部分以可溶性蛋白的形式存在，為進(jìn)一步分離純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行切割以獲得有活性的目的蛋白提供的方便。但由于GST標(biāo)簽自身相對分子質(zhì)量較大，而設(shè)計的目的蛋白又非常小，對相關(guān)下游試驗可能會有較大影響。考慮到設(shè)計的目的蛋白蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度，對細(xì)胞膜的破壞能力較低，也可以嘗試使用分子量較小的His標(biāo)簽。蜂毒前溶血肽原本身具有信號肽結(jié)構(gòu)，若有好的無標(biāo)簽分離純化目的蛋白的方法，也可以嘗試直接表達(dá)蜂毒前溶血肽原。而有關(guān)其表達(dá)量的提高及表達(dá)產(chǎn)物的處理等仍需進(jìn)一步研究。

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