王國棟，張 姍，狄 娜，穆玉明*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830000；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院超聲科，廣東 廣州 510120)

卵巢移植技術(shù)為卵巢功能衰退患者提供了一種保存生育能力的有效方法[1-2]。移植后卵巢部位血管生成速度和密度直接影響卵巢存活和功能恢復(fù)[3]，但長期以來缺乏在體評價(jià)移植后卵巢新生血管狀態(tài)的無創(chuàng)方法[4]。LI等[5]發(fā)現(xiàn)，通過連接腫瘤血管特異性配體，以靶向造影劑進(jìn)行超聲造影，可檢測腫瘤新生血管。抗苗勒管激素(anti-Mullerian canal hormone, AMH)僅由卵巢顆粒細(xì)胞特異性分泌,其他組織少有表達(dá)[6-7]。本研究嘗試通過制備具有卵巢組織靶向性的AMH-靶向納米泡(AMH-targeting nanobubble, AMH-NB)，實(shí)現(xiàn)在體無創(chuàng)評價(jià)大鼠移植后卵巢新生血管。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 選取SD雌性大鼠10只，鼠齡7～8周，體質(zhì)量200～220 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，倫理審查批準(zhǔn)編號(hào)(SYSU-LACUC-2019-B463)。以3%戊巴比妥鈉腹腔注射(45 mg/kg體質(zhì)量)麻醉動(dòng)物，摘除兩側(cè)卵巢后，立即將一側(cè)卵巢皮質(zhì)移植到右側(cè)腹股溝區(qū)皮下，之后荷包縫合皮膚，建立大鼠自體卵巢移植模型[8]。將手術(shù)次日記為移植后第1天。

1.2 材料與設(shè)備 造影劑聲諾維(SonoVue，Bracco公司)，AMH抗體(北京Bioss公司)，免疫組織化學(xué)一抗CD34(Abcom公司)，二抗即用型山羊抗兔二步法試劑盒，熒光二抗為AF-488，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板。納米泡粒徑檢測儀ZETASIZER Nano-ZS90，GE-vivid 7超聲診斷儀，高頻探頭i13L，頻率14 MHz。

1.3 制備非靶向微泡(non-targeting nanobubble, N-NB)和AMH-NB 采用“薄膜水化法”制備N-NB[9]，以“親和素-生物素”橋接法構(gòu)建AMH-NB[10]。采用共聚焦顯微鏡檢測AMH是否與納米泡連接。

1.4 超聲造影 術(shù)后第7天麻醉并保定動(dòng)物，選取造影模式，機(jī)械指數(shù)0.06，記錄時(shí)間為10 min，經(jīng)尾靜脈團(tuán)注6×106/ml造影劑0.1 ml，對全部大鼠分別隨機(jī)采用3種造影劑(SonoVue、N-NB和AMH-NB)進(jìn)行3次檢查，每次間隔30 min。由2名分別具有工作7、8年工作經(jīng)驗(yàn)的超聲醫(yī)師采用雙盲法分析數(shù)據(jù)，通過造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線獲取峰值強(qiáng)度(peak intensity, PI)和達(dá)峰時(shí)間(time to peak, TTP)。

1.5 病理和免疫熒光分析 完成造影后，取9只大鼠，分為3組(每組3只)，每組分別注入1種造影劑，之后處死動(dòng)物，留取移植后卵巢組織。參照劉艷麗等[11]方法以4%甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋切片，行HE染色，并以SP法行CD34免疫組織化學(xué)染色。于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(HP)計(jì)數(shù)呈棕黃色的陽性血管, 取平均值作為卵巢微血管密度[4](microvascular density, MVD)。制備冰凍切片，厚度為5 μm，經(jīng)甲醇固定，加入一抗AMH抗體(1∶100稀釋)，放入濕盒內(nèi)4℃過夜；之后加入熒光二抗AF-488(1∶100稀釋)，顯色，脫水，封片，觀察攜帶DiL的紅色微泡在血管內(nèi)外及其在組織間隙的微泡是否與AMH抗體結(jié)合。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料采用±s表示，行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；用單因素方差分析進(jìn)行多組比較，兩兩比較采用LSD法。采用Pearson相關(guān)性分析或線性回歸分析觀察PI、TTP與MVD的相關(guān)性：│r│≥0.8高度相關(guān)性, 0.5≤│r│<0.8中度相關(guān)性，0.3≤│r│<0.5低度相關(guān)性，0<│r│<0.3弱相關(guān)。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 N-NB和AMH-NB表征 納米泡肉眼觀為乳白色，光學(xué)顯微鏡下呈圓形結(jié)構(gòu)。表面連接AMH抗體后的AMH-NB在激光共聚焦顯微鏡下呈綠色環(huán)狀，分布均勻(圖1)。ZETASIZER Nano-ZS90及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測的N-NB、AMH-NB直徑、濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表1)。

表1 N-NB與AMH-NB微泡直徑及濃度比較(±s)

表1 N-NB與AMH-NB微泡直徑及濃度比較(±s)

圖1 N-NB和AMH-NB形態(tài)和粒徑分布曲線圖 顯微鏡下觀察，微泡分布均勻，NB表面成功攜帶AMH抗體表達(dá)綠色(×400)

圖2 超聲造影圖像及參數(shù)分析 白圈示ROI，AMH-NB超聲造影增強(qiáng)幅度高于SonoVue及N-NB (*：P<0.05)

2.2 二維超聲及超聲造影 二維超聲觀察，移植后卵巢均見包膜形成。圖2為SonoVue、N-NB及AMH-NB超聲造影圖像，單因素方差分析3組間造影參數(shù)PI、TTP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.04、666.17，P均<0.05，表2)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 病理 肉眼觀察移植物表面呈粉紅色具有光澤,可見豐富血管爬行其上，卵巢移植成功率為100%。光鏡下移植后卵巢中可見未凋亡的卵泡，其形態(tài)正常。免疫組織化學(xué)CD34結(jié)果顯示移植后卵巢組織的MVD平均值為(61.20±6.84)/HP(圖3)。激光共聚焦觀察，組織免疫熒光AMH-NB進(jìn)入組織間隙與AMH結(jié)合，呈黃色(圖4)。

2.4 相關(guān)性分析與線性回歸分析 移植后卵巢MVD與AMH-NB造影所見PI、TTP呈高度相關(guān)(r=0.84、-0.84,P均<0.05)，SonoVue(r=0.67、-0.71，P均<0.05)、N-NB(r=0.65、-0.68，P均<0.05)造影所見PI、TTP分別與MVD呈中度相關(guān)(圖5)。

3 討論

AMH與卵巢移植物的存活及卵泡功能密切相關(guān)。研究[12]顯示，通過檢測AMH水平，可評價(jià)移植卵巢是否成活。血管相關(guān)抗體如CD31和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)被廣泛用于血管靶點(diǎn)，但并無特異性，且卵巢移植物屬乏血供器官，常規(guī)血管相關(guān)靶點(diǎn)并不能敏感識(shí)別其內(nèi)新生血管，故本研究以AMH作為靶向超聲造影的靶點(diǎn)。

制備靶向超聲造影劑是實(shí)現(xiàn)靶向顯影的前提。本研究所制備的造影劑N-NB及AMH-NB粒徑均達(dá)到納米級(jí)；NB攜帶抗體后粒徑明顯大于非靶向納米泡，濃度也明顯低于非靶向納米泡，可能是攜帶抗體過程中需要反復(fù)離心和洗滌納米泡所致，但AMH-NB的粒徑仍為納米級(jí)且濃度仍維持在2.9×108/ml，而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所用微泡濃度為6×106/ml，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)并無影響。

表2 采用3種造影劑進(jìn)行超聲造影所見大鼠移植卵巢組織參數(shù)PI、TTP比較(±s)

表2 采用3種造影劑進(jìn)行超聲造影所見大鼠移植卵巢組織參數(shù)PI、TTP比較(±s)

造影劑種類PI(dB)TTP(s)SonoVue4.15±0.8328.71±1.18N-NB6.16±0.4454.35±1.73AMH-NB7.93±0.6542.53±1.74F值83.04666.17P值<0.01<0.01

圖3 病理組織學(xué)分析 A.光鏡下觀察HE染色片(×200)可見卵泡形態(tài)正常； B.CD34免疫組織化學(xué)染色(×400)見移植后卵巢新生血管表達(dá)，呈棕黃色

研究[13]表明，納米泡的血管外滲能力優(yōu)于普通微泡，其PI更高。本研究顯示N-NB的PI較SonoVue增強(qiáng)1.5倍(6.16±0.44 vs 4.15±0.83)，可能因?yàn)榧{米泡粒徑較小，能克服普通微泡的局限性，通過血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入卵巢組織間隙，增強(qiáng)滲透效應(yīng)，利于保留，實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向作用[14]，集聚的納米泡表現(xiàn)出較持續(xù)的超聲增強(qiáng)顯影效果，這一特性也為納米泡靶向探測卵巢特異性表達(dá)分子奠定了基礎(chǔ)。GAO等[15]報(bào)道，與非靶向納米泡相比，靶組織對靶向納米泡的攝取增強(qiáng)。本研究AMH-NB造影所示PI較N-NB增高1.3倍(7.93±0.65 vs 6.16±0.44)，組織免疫熒光成像顯示NB在移植后卵巢組織間隙中呈現(xiàn)高度聚集狀態(tài)，提示AMH-NB與AMH成功結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)了AMH-NB的靶向性，與LI等[16]的研究結(jié)果一致，提示AMH是良好的分子影像學(xué)靶點(diǎn)。本研究針對大鼠自體移植卵巢，理論上亦適用于同樣分泌AMH的異體移植卵巢[17]，通過AMH-NB可實(shí)現(xiàn)對移植后卵巢組織的靶向顯影，并增強(qiáng)靶組織攝取解決了以往微泡不能進(jìn)入組織間隙實(shí)現(xiàn)全面顯影的難題。

圖4 病理組織免疫熒光(×400) 細(xì)胞核DAPI染色表達(dá)藍(lán)色熒光，AMH抗體染色表達(dá)綠色熒光，攜帶Dil的微泡表達(dá)紅色熒光。SonoVue紅色微泡不進(jìn)入組織；N-NB紅色微泡可在卵巢組織間隙表達(dá)，不與AMH結(jié)合；AMH-NB的組織間隙有大量紅色微泡表達(dá)，在Merge中可與AMH結(jié)合，呈棕黃色

圖5 相關(guān)性分析 SonoVue、N-NB、AMH-NB造影所示PI與MVD的線性回歸方程(A～C)及SonoVue、N-NB、AMH-NB造影所示TTP與MVD的線性回歸方程(D～F)

本研究SonoVue造影所示TTP明顯早于NB，其原因如下：①SonoVue是血池顯像劑，通過血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入組織需要一定時(shí)間[18]；②血管管徑越小，其阻力越大[19-20]，NB較SonoVue灌注的血管更細(xì)小、阻力更大，導(dǎo)致TTP延遲。AMH-NB的TTP較N-NB提前，可能是進(jìn)入組織間隙的AMH-NB微泡能夠快速與AMH結(jié)合，故TTP較快。通過比較TTP進(jìn)一步驗(yàn)證了AMH-NB可增強(qiáng)移植后卵巢組織的靶向顯影。

既往研究[21]于大鼠卵巢移植后第3天觀察到毛細(xì)血管芽，5～10天可見完整的微血管網(wǎng)。MVD是評價(jià)新生血管的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。本研究通過CD34染色證實(shí)卵巢移植物存在新生血管表達(dá)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示AMH-NB造影所示PI、TTP值與MVD呈高度相關(guān)，而SonoVue和N-NB造影所示PI、TTP值與MVD呈中度相關(guān)，表明以AMH-NB進(jìn)行超聲造影能有效量化評價(jià)大鼠移植卵巢的微血管密度。

本研究的不足之處：未能確定AMH-NB超聲造影最佳造影參數(shù)；僅觀察了移植后 7天卵巢早期新生血管，AMH-NB超聲造影對移植后卵巢的長期檢測效果有待驗(yàn)證。