向歡 ，王俊，陳勇，湯衛(wèi)榮，張凡，劉雷

1 四川農業(yè)大學農學院，成都市溫江區(qū)惠民路211號 611130；

2 四川省煙草公司德陽市公司，德陽市長江東路176號 618400

曬煙具有突出的香氣風格特色和良好的應用價值[1-4]。已有大量研究表明曬煙調制措施對煙葉質量和風格特色有顯著影響[5-9]，但與之相關的曬煙調制生理研究明顯較少[10-11]。光照是曬煙調制中必需的因素，也是曬煙與晾煙和烤煙在調制方法上最明顯的差異因素[12-13]；它不僅影響曬煙葉品質特色[6-9]，還影響曬煙的葉綠素含量和衰老相關生理指標[10-11,14]；然而調制期的光照與曬煙葉生理生化指標變化間的關系仍不清楚。

調制變黃期的曬煙葉處在光照、水分和溫度等環(huán)境因素的逆境脅迫下，煙葉葉綠素熒光參數(shù)指標會因此受到影響。葉綠素熒光參數(shù)對光照、水分和溫度等脅迫很敏感，通過測定葉綠素熒光參數(shù)可以實時、無損地了解葉片光合能力、光合系統(tǒng)能量傳遞狀況以及葉片所受脅迫的程度[15]；監(jiān)測葉綠素熒光參數(shù)已成為研究植物逆境反應的重要方法[16]。目前，關于曬煙調制期光照對葉綠素熒光參數(shù)和抗氧化指標的影響以及這些指標變化之間的聯(lián)系鮮見報道[17]。因此，本文測定了曬煙調制變黃期間不同光照射處理下曬煙的葉綠素含量、光合性能、葉綠素熒光參數(shù)、活性氧含量及抗氧化物酶活力，分析它們的變化規(guī)律和相互間的關系，以探索光照在曬煙調制變黃期的影響和作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試曬煙品種為“什煙1 號”，由四川省德陽市煙草公司提供。H2O2測定試劑盒（A064-1-1）產自南京建成生物工程研究所；各種常規(guī)化學試劑（AR）產自成都市科龍化工試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 曬煙栽培和調制

實驗在2018 年進行，地點為四川省什邡市師古鎮(zhèn)大泉坑村，栽培曬煙的田間行距100 cm、株距45～50 cm。煙葉采收調制期在5～6 月，以適熟的中部煙葉為實驗材料，煙葉采收標準為主脈呈現(xiàn)淺白色，葉片呈淡綠色至黃綠色。用鋼管搭建曬煙調制棚架、用無色透明塑料薄膜覆蓋棚頂，用多層黑色遮陽網(wǎng)遮蓋棚頂部的一半作為遮光處理（CK）區(qū)域、另一半留作光照處理區(qū)域；懸掛黑色遮陽網(wǎng)將CK 區(qū)域圍繞，以避免外來散射光的干擾。用LI-6400XT 便攜式熒光儀測得晴天正午時棚下光照處理區(qū)域光合有效輻射約為300～350 μmol·m-2·s-1，CK 區(qū)域的光合有效輻射約為10～20 μmol·m-2·s-1。將曬煙按單葉編竿方法編好，煙竿平分為兩組分別置于遮光處理區(qū)域和光照處理區(qū)域進行調制；其它調制條件和操作與當?shù)貢駸熒a習慣相同。實驗期間天氣狀況以晴天為主。

1.2.2 熒光參數(shù)測定

在實驗第1～7 d 內上午10:00 開始，以LI-6400XT（LI-COR，USA）便攜式光合熒光儀配上6400-40 熒光葉室用于測定煙葉的PS Ⅱ實際光化學效率（PhiPS2）、非光化學淬滅（qN）、光化學淬滅（qP）、電子傳遞速率（ETR）、PSII 最大光化學效率（Fv/Fm）等熒光參數(shù)。每次測定時從兩個處理下的中央?yún)^(qū)域各選取3～5 片煙葉，在每片煙葉的中段區(qū)域內選擇以主脈為對稱軸的左右2 個位點做重復測定。

1.2.3 生化指標測定

在實驗第1～9 d 內，每天從兩種處理中抽取已測過葉綠素熒光參數(shù)的煙葉，截取其中段區(qū)域（去除主葉脈）約50 g，經(jīng)天平稱重后分成約5 g /份、用錫箔紙包裹、編號并記錄重量后放入液氮中保存，用于測定葉綠素、H2O2、MDA 的含量和CAT、POD 的酶活性。參考熊慶娥的方法測定葉綠素和MDA 含量以及POD 和CAT 酶活性[18]。使用南京建成生物工程研究所H2O2測定試劑盒（比色法）測定H2O2含量。使用UV-2600（Shimadzu, Japan）紫外-可見分光光度計測定以上各指標的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013 求數(shù)據(jù)均值、誤差并制圖，用DPS7.05 分析樣本間差異顯著性，用SIMCA-P13 軟件做兩處理間的正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。

2 結果與分析

2.1 葉綠素含量分析

圖1 顯示：調制4 d 后CK 和光照處理的葉綠素含量分別比各自第1 d 時的含量降低了10%和15%，這表明在曬煙調制變黃初期的煙葉組織中仍然保有較多的葉綠素，具有接收光能的物質基礎。在實驗的第5～7 d 內兩種處理下的葉綠素下降速都明顯加快，到7 d 時CK 和光照處理的葉綠素含量已分別減少了57%和67%；由此可推測曬煙葉的光合能力將因葉綠素含量下降而降低。

圖1 不同天數(shù)內CK 和光照處理下煙葉葉綠素含量Fig. 1 Contrast of chlorophyll content under CK and light treatment with time

2.2 葉綠素熒光參數(shù)分析

圖2a 表明兩個處理下曬煙葉的實際光合效率（PhiPS2）都在下降，在實驗的第2～7 d 內CK 的PhiPS2 一直高于光照處理。兩處理的PhiPS2 都是在調制的前4 d 內有大幅下降，到第4 d 時CK 的 PhiPS2 比其第1 d 時低35%，而光照處理的PhiPS2降幅更大、比第1 d 時低了60%。圖2b 中兩個處理下煙葉的光合系統(tǒng)電子傳遞速率（ETR）同樣有大幅下降，在第2～5 d 內CK 的ETR 高于光照處理。到第4 d 時CK 煙葉的ETR 比第1 d 時下降了46%，而光照處理的ETR 較第1 d 時下降了約75%?？梢娫跁駸熣{制1～4 d 內光照處理下煙葉的PhiPS2 和ETR 都比在CK 中下降得更快；因此同CK 相比，光處理下煙葉所接收的光能中將會有較多的光能因PhiPS2 和ETR 下降而無法參與光合反應，將有利于過剩光激發(fā)能的形成。

圖2 不同天數(shù)內CK 和光照處理下煙葉的PhiPS2 和ETR Fig. 2 Contrast of PhiPS2 and ETR under CK and light treatment with time

兩種處理下煙葉光化學淬滅值（qP）都在下降（圖3a），在前4 天內最明顯；CK 處理第4 d 的光化學淬滅值（qP）較其第1 d 的qP 值已降了31%，而此時光照處理下的qP 值較其第1 d 下降了52%。在2～7 d 內光照處理的qP 值一直顯著低于CK、到第7 d 時比同期CK qP 值低38%。圖3b 中，CK 處理下煙葉第5d的非光化學淬滅（qN）值升到峰值、較其第1 d 的qN值上升了71%，而光處理下煙葉第4 d 時qN 值達到峰值、比其第1 d 升高了110.5%，顯著高于同期的CK處理。qP 和qN 的變化都表明調制中曬煙葉的光能利用率持續(xù)下降，而光照處理的降幅比CK 更大。在第4～7 d 內兩個處理的qN 都轉為下降，顯示光合系統(tǒng)中以熱的形式耗散掉的光能在減少；這或與同期內葉綠素含量明顯下降、并導致煙葉獲取的光能下降有關。

圖3 不同天數(shù)內CK 和光照處理下煙葉的qP 和qN Fig. 3 Contrast of qP and qN under CK and light treatment with time

由圖4 可見，在2～7 d 內CK 和光照處理下曬煙煙葉的Fv/Fm值均保持下降趨勢，到第7 d 時CK 的Fv/Fm值比其第1 d 下降了49%，而光照處理的Fv/Fm值下降了70%。正常煙株上的煙葉Fv/Fm值維持在0.8～0.84 之間，遇到逆境脅迫越重、則Fv/Fm值降幅越大。在第2～7 d 中光照處理的Fv/Fm值一直顯著低于CK 煙葉的Fv/Fm值，到第7 d 時比同期CK 的Fv/Fm值低43%，說明光照處理下煙葉光能轉化率下降幅度比CK 大；由此推測光照下煙葉所承受的調制逆境脅迫比CK的更嚴重。

圖4 不同天數(shù)內CK 和光照下煙葉的Fv/Fm Fig. 4 Contrast of Fv/Fm under CK and light treatment with time

2.3 H2O2、MDA 含量及抗氧化酶活性分析

兩種處理下煙葉中H2O2含量都呈先增后減的變化趨勢（圖5）；CK 中H2O2含量上升相對較緩，至第5 d 達峰值、約為第1 d 含量的4 倍；光照處理的H2O2含量上升相對較快，在第3 d 時就達峰值、約為其第1 d 含量的6 倍，極顯著高于同期對照。在調制第2～5 d 內，光照處理的H2O2含量顯著高于CK，表明光照處理下煙葉中的氧化脅迫大于CK。在第6～9 d 內CK 和光照處理的H2O2含量不再隨曬煙調制時間的延長而上升，轉而大幅下降；說明隨著調制時間的延長煙葉細胞對調制逆境脅迫的反應能力在下降。

圖5 不同天數(shù)內CK 和光照處理下煙葉的H2O2 含量Fig. 5 Contrast of H2O2 content under CK and light treatment with time

由圖6 可見，CK 的MDA 含量持續(xù)上升至第7 d出現(xiàn)峰值12.23 μmol·mg-1，光照處理下的MDA 含量在調制3 d 后便已極顯著高于遮光對照，并于第5 d達峰值19.06 μmol·mg-1，比CK 提前2 d 時間。兩個處理下的MDA 含量峰值相差7.69 μmol·mg-1。此變化表明光照處理下曬煙葉細胞發(fā)生細胞膜脂過氧化的進度明顯大于CK，細胞膜結構受損狀況將比CK 更嚴重。

圖6 不同天數(shù)內CK 和光照處理下MDA 含量Fig. 6 Contrast of MDA content under CK and light treatment with time

圖7a 中CK 的POD 酶活性在第6 d 時升到峰值55.04 U·g-1，而光照處理下調制3 d 后煙葉POD 酶活性升到峰值59.57 U·g-1，它比CK 中的峰值提前3 d出現(xiàn)。圖7b 中CAT 酶活性變化趨勢與POD 相似，CK 的CAT 酶活性峰值晚于、且低于光照處理。CAT和POD 的酶活性的變化暗示：光照處理下煙葉的抗氧化反應比CK 中出現(xiàn)得更早、更劇烈。

圖7 不同天數(shù)內CK 和光照處理下煙葉中POD 和CAT 酶活性 Fig. 7 Contrast of POD and CAT activity under CK and light treatment with time

在第6～9 d 中CK 和光照處理的CAT 和POD 的酶活性未隨調制時間增長而繼續(xù)升高，反而均出現(xiàn)大幅下降，到第9 d 時CAT 和POD 酶活性已低于它們第1 d 的水平，顯示此時煙葉的抗氧化能力都已明顯衰弱。

2.4 處理間OPLS-DA 分析

為分析遮光CK 處理和光照處理下煙葉中各種被測定指標間的相互關系及其對光、暗處理的響應狀況，本文以各指標為變量對1～7 d 內光照處理和遮光對照煙葉樣本群體進行了正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），得到了具有顯著性的OPLS-DA 模型，其對總方差的解釋能力為R2X（cum）= 0.959、R2Y（cum）= 0.621，預測能力為Q2（cum）= 0.398。繪制變量載荷圖（圖8a）和變量的VIP（Variable Importance）圖（圖8b）。

圖8 CK 和光照處理的OPLS-DA 模型中變量的載荷和VIP 分析Fig. 8 Loading plot and VIP plot on OPLS-DA model under CK and light treatment

變量載荷圖（圖8 a）中各指標變量所處的相限位置和彼此間鄰近程度的反映了指標變量與兩個處理間、以及指標彼此間的相關程度；其中 PhiPS2、ETR、qP、Fv/Fm和葉綠素（Chl）這5 個與光合作用密切相關的指標集中出現(xiàn)在與CK 相近的左上區(qū)域中、彼此間相互接近，說明它們彼此間相關性強；而H2O2、MDA、CAT 和POD 這4 種與細胞抗氧化有關的指標則較為集中地出現(xiàn)在圖中右下部更靠近光照處理所在的位置、且與qN 較近；這反映這些抗氧化指標以及qN 之間的相關性較強；同時還表明在CK 處理下煙葉的總體光合能力大于光照處理下的煙葉，而光照處理下煙葉的抗氧化反應比CK 中的更強烈。

圖8b 中PhiPS2、H2O2和MDA 這3 個 指 標 的VIP 值都在1.3 以上、明顯高于其它指標，說明它們是對光照處理反應最為敏感、變化最突出的指標。因為以上指標是代表葉細胞光合作用和抗氧化能力的重要指標，由此可知在曬煙調制1～7 d 內，光照處理可以對煙葉細胞的光合作用和抗氧化能力產生重大影響。

3 討論

前人研究表明光照能促進曬煙調制初期葉綠素含量的下降[14,23]。本研究也顯示光照處理下葉綠素含量下降速度比CK 快。在吳疆的研究中葉綠素含量在調制1～4 d 內就已明顯降低，而本文中葉綠素含量下降相對較緩。此差異很可能是實驗條件或取樣方法不同所致，如本研究中什邡煙區(qū)的生態(tài)環(huán)境、栽培品種、種植季節(jié)、栽培方法和采收、調制方法等多方面均與前者研究地萬源煙區(qū)不同，而這些條件的差異都能影響曬煙葉內物質成分[2,5,7,10-12,14]。

葉綠素熒光參數(shù)是反映植物光合能力和植物所承受的脅迫程度的重要指標[24-28]。本研究中發(fā)現(xiàn)曬煙葉在調制變黃期1～7 d 內有明顯的熒光信號，表明此時煙葉的葉綠素和光合系統(tǒng)仍然保有一定的工作能力。光照處理下曬煙葉的PhiPS2、ETR、qP 和Fv/Fm值都在調制過程中保持下降趨勢，此現(xiàn)象與煙葉葉綠素熒光參數(shù)在干旱或高光強脅迫下的變化規(guī)律相符合[19-21]。CK 中PhiPS2 和ETR 等多個與煙葉光合能力呈正相關的熒光參數(shù)在調制過程中也在下降，但降幅低于光照處理。本研究中的Fv/Fm和其它多項熒光參數(shù)變化狀況都表明光處理下煙葉所受脅迫程度更重。

H2O2和MDA 是植物逆境代謝的代表性物質，其含量高低與植物細胞所受脅迫程度密切相關[29-30]。調制初期CK 和光照處理中H2O2和MDA 濃度都有明顯上升，這與宮長榮、陳秋芳的研究結論相符[11,31]；CK 的H2O2和MDA 濃度都明顯低于光照處理，這說明調制期間的光照處理使煙葉細胞中的過氧化物濃度提高了、使細胞膜結構受損更重。

光照處理下煙葉中快速大量形成的H2O2還激發(fā)了煙葉抗氧化酶活性的上升，CAT 和POD 酶活性峰值比CK 中出現(xiàn)得更早、更高。1～7 d內光、暗兩種處理下煙葉中CAT 和POD 酶活性都是先升后降，這與陳秋芳、王宏輝研究結果相符[31-32]。結合前面分析的各項指標不難看出在5～7 d 內煙葉細胞在結構和功能上已受損或衰弱了；與此同時CAT 和POD 酶活性也快速下降，細胞最終將喪失抗氧能力。

本研究認為在曬煙調制初期，煙葉不僅有能力接收光合作用所需的光能，還接收到光照中的輻射熱能和大量超過煙葉光合作用所能利用的“過剩光激發(fā)能”，它們可造成光脅迫、光破壞和葉內氧化脅迫。其作用機理如圖9 示意：曬煙葉在變黃期受到失水、高溫、強光等逆境因素的脅迫，導致葉細胞的葉綠素含量和光合能力不斷地下降。因此，煙葉光合系統(tǒng)接收的一部分光能將無法利用、轉而成為“過剩光激發(fā)能”，經(jīng)光合系統(tǒng)轉化后釋放大量自由電子，它們與O2結合形成ROS 又使細胞內過氧化物（H2O2等）濃度上升。過氧化物的增加能促使細胞抗氧化反應加劇，使細胞內CAT 和POD 等抗氧化酶活性快速上升。然而，由于切斷了煙葉的水分和養(yǎng)分物質補充，細胞抗氧化系統(tǒng)清除ROS 能力難以持久、繼而衰弱。在另一方面，由于煙葉所處的調制逆境狀況不斷加重，使葉細胞中生成、積累更多的ROS。ROS 可使細胞膜脂發(fā)生過氧化產生MDA，造成細胞毒害、損害細胞結構和功能[33-34]。因此，光照處理下煙葉細胞的光合能力和抗氧化能力都因高濃度ROS 持續(xù)作用而明顯下降，最后失去對光照等環(huán)境逆境因素的反應能力。

圖9 光照對調制變黃初期的曬煙葉影響機制示意圖Fig. 9 Mechanism schemes of light effect on sun-cured tobacco leaf in the early stage of yellowing period

鄭昕、時向東等人的研究表明光照可提高煙葉香氣物質含量、安全性、香氣質和感官質量，但是過強的光照能使葉內物質轉化不充分、煙葉品質下降[5,9]。本研究顯示調制初期的光照可明顯改變煙葉的光合能力和抗氧化反應，繼而將影響到煙葉細胞中復雜的物質代謝乃至煙葉品質的形成。因此，如果進一步研究曬煙變黃期的光照條件與煙葉細胞中過剩光激發(fā)能的關系、細胞內過氧化物與煙葉品質的關系，將有助于合理控制曬煙調制過程的光照條件、優(yōu)化曬煙品質。

4 結論

在調制變黃初期曬煙葉的葉綠素仍可接收環(huán)境光能并傳遞給光合系統(tǒng)。調制脅迫使曬煙葉的光能利用率明顯下降，導致葉片所接收的部分光能無法被利用、轉而成為過剩光激發(fā)能。這可促進H2O2和MDA 等物質的形成和積累，CAT 和POD 等抗氧化酶活性也因此升高。光照對調制變黃期煙葉的PhiPS2、MDA和H2O2含量影響最大。調制變黃期的光照可明顯降低煙葉光合系統(tǒng)的工作能力、加劇煙葉中氧化脅迫狀態(tài)，促進胞內物質轉化。