楊飛，孟紅明，崔浩哲，范多青，王穎，劉珊珊，范子彥，唐綱嶺，趙蔚

1 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6號 450001；

2 云南中煙工業(yè)有限責任公司，昆明市五華區(qū)紅錦路181號 650023；

3 蘇州科技大學(xué)化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，蘇州市高新區(qū)科銳路1號 215009

順反異構(gòu)是一種重要的立體異構(gòu)現(xiàn)象?；衔锓肿又杏捎诰哂邢拗菩D(zhuǎn)的因素，使各個基團在空間的排列方式不同而出現(xiàn)順反異構(gòu)[1]，這些異構(gòu)體的性質(zhì)不完全相同?；衔锓肿又杏须p鍵或是環(huán)狀結(jié)構(gòu)經(jīng)常會有這種現(xiàn)象。其中雙鍵的順反異構(gòu)又以C=C 雙鍵最為常見，此外還有C=N 雙鍵、N=N 雙鍵、C=S 雙鍵等。構(gòu)型不同的化合物，生物活性差別較大，有時可能達到幾十甚至幾百倍[2]。例如，啶菌惡唑Z、E 異構(gòu)體雖然殺菌譜均較廣，有較好的抑菌活性，但對部分真菌活性存在差異[3]。滅多威E 體殺蟲活性也遠小于Z 體，對巢修尾蚜的室內(nèi)藥效測定表明，E 體僅為Z 體的1/40；對家蠅成蟲的藥效測定也表明E 體活性只有Z 體的1/10，且Z體較E 體穩(wěn)定[4]。又如辛硫磷Z 體對蚊幼蟲的殺蟲活性明顯優(yōu)于E 體，Z 體的殺蟲活性比E 體高約3倍[5]。

磷胺又名大滅蟲，在中性和弱酸性溶液中較穩(wěn)定，在堿性液中會迅速分解。磷胺對人、畜毒性大，屬高毒農(nóng)藥。磷胺對煙草上的害蟲和螨類具有強烈的觸殺和胃毒作用。磷胺為廣譜性有機磷殺蟲劑，可防治刺吸式口器和咀嚼式口器的多種害蟲。磷胺分子結(jié)構(gòu)中含有C=C，具有一對順反異構(gòu)體（圖1），其中順式異構(gòu)體具有較強活性[6]。速滅磷又名磷君，在堿性條件下分解較快。速滅磷為觸殺性，內(nèi)吸性殺蟲、殺螨劑。速滅磷分子結(jié)構(gòu)中含有C=C，具有一對順反異構(gòu)體（圖1），在植物體內(nèi)順式異構(gòu)體比反式異構(gòu)體代謝速度快，其順反異構(gòu)體毒性也不盡相同，順式異構(gòu)體比反式異構(gòu)體毒性大20 倍左右[7]。

圖1 磷胺和速滅磷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of phosphamidon and mevinphos

在國際煙草科學(xué)研究合作中心（Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco，CORESTA）農(nóng)用化學(xué)品咨詢委員會（Agro-Chemical Advisory Committee，ACAC） 制 定 的106 種 農(nóng) 用化學(xué)品指導(dǎo)性殘留限量表（Agrochemical Guidance Residue Levels，GRL）中，速滅磷和磷胺的限量均是按各異構(gòu)體總和計，速滅磷（E-速滅磷和Z-速滅磷之和）和磷胺（E-磷胺和Z-磷胺之和）的殘留限量分別為0.04 mg/kg 和0.05 mg/kg[8]。

目前未見關(guān)于磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體拆分和測定的報道。順反異構(gòu)體的拆分主要采用液相色譜（HPLC）[9-12]，該方法需要消耗大量有毒有害的有機溶劑，而且分析時間長。如李大婧等用HPLC 分離和測定了葉黃素的順反異構(gòu)體，分析時間長達30 分鐘，且消耗較多的有機溶劑[10]。近幾年來，作為一種新的分析技術(shù)，超臨界流體色譜（SFC）引起了研究人員越來越多的關(guān)注[13-14]。SFC 主要以超臨界CO2和少量的有機溶劑為流動相，與HPLC 相比，分析速度快、時間短、分離效率高。同時，SFC 的有機溶劑消耗量低于HPLC，更環(huán)保。這些優(yōu)點使得SFC 已廣泛應(yīng)用于不同基質(zhì)中手性化合物的分析，測定和制備分離[15-23]。

本文通過超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜（SFC-MS/MS）首次研發(fā)了一種環(huán)境友好，靈敏，快速的順反異構(gòu)體分離和測定的方法，用于選擇性拆分和測定煙草中的磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體。而且，SFC 和MS/MS 的組合可以進一步提高方法的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

20 個烤煙實際樣品全部來自2018 年度國家煙草專賣局農(nóng)殘普查分析樣品。所有樣品烘干后粉碎，并過2 mm（10 目）篩后貯存于棕色玻璃瓶中，4℃下保存。

E-磷胺標準品（CAS：297-99-4）、Z-磷胺標準品（CAS：23783-98-4），E-速滅磷標準品（CAS：298-01-1）、Z-速滅磷標準品（CAS：338-45-4）（純度＞98.0%，天津阿爾塔科技有限公司）。甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇和甲酸（色譜純，德國Merck 公司）；無水硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈉（NaCl）、N-丙基乙二胺（PSA）（分析純，上海安普實驗科技股份有限公司）；水為超純水；高純氮（純度＞ 99.99%，鄭州源正科技）；高純氬（純度＞99.99%，鄭州源正科技）。

ACQUITY 超臨界流體色譜儀、ACQUITY TQD四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧電離源，美國Waters公司）；Acquity UPC2Trefoil AMY1、Acquity UPC2Trefoil CEL1 和Acquity UPC2Trefoil CEL2 柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）（ 美 國Waters 公 司）；Chiralpak IG-3 柱（100 mm×3.0 mm，3.0 μm）（日本Daicel 公司）；VX200 渦旋振蕩儀（美國Labnet公司）；SG3-30K 高速離心機（德國sigma 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；CP224S電子天平（感量：0.0001 g，德國Sartorius 公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

樣品前處理過程采用本文作者之前的研究[24]。稱取2 g 樣品（精確至0.01 g）于50 mL 具蓋離心管中，加入10 mL 超純水和10 mL 乙腈，然后以2000 rpm 的速率渦旋振蕩2 min。向離心管中加入4 g 無水硫酸鎂和1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸二氫鈉，繼續(xù)以2000 rpm 的速率渦旋混合2 min。移取1 mL 上清液于1.5 mL 離心管中，加入150 mg 無水硫酸鎂及25 mg PSA 吸附劑，于漩渦混合振蕩儀上以2000 rpm 的速率振蕩2 min，以6000 rpm 的速率離心5 min。吸取上清液經(jīng)0.22 μm 有機相濾膜過濾，取200 μL 的濾液加入800 μL 的乙腈，混勻，進SFC-MS / MS 檢測。

1.2.2 基質(zhì)匹配標準工作溶液的配制

分別稱取10 mg 的E-磷胺，Z-磷胺，E-速滅磷，Z-速滅磷標準品于100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，制得E-磷胺、Z-磷胺、E-速滅磷和Z-速滅磷的質(zhì)量濃度均為100 μg/mL 的一級混合標準儲備液。

移取1.0 mL 一級混合標準儲備液于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，得到E-磷胺、Z-磷胺、E-速滅磷和Z-速滅磷的質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL 二級混合標準儲備液。

分別移取二級混合標準儲備液500 μL、200 μL、100 μL、50 μL、20 μL 至5 個10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，制得不同質(zhì)量濃度的標準工作溶液。

分別移取0.2 mL 標準工作溶液和0.2 mL 空白樣品提取液，混合后用乙腈稀釋至1 mL。各基質(zhì)匹配標準工作溶液中各異構(gòu)體的質(zhì)量濃度分別為10.0 ng/mL、4.0 ng/mL、2.0 ng/mL、1.0 ng/mL 及0.4 ng/mL。所有溶液避光儲存在-20℃的冰箱中。

1.2.3 加標樣品的制備

在最優(yōu)化的試驗條件下，通過對實際樣品的分析，選取1 個煙葉樣品作為空白樣品。添加不同含量（20 μL、100 μL、400 μL）的二級混合標準儲備液到2.0 g空白樣品中，獲得三個不同濃度的空白加標樣品，加標樣品中各異構(gòu)體的含量為0.01 mg/kg、0.05 mg/kg、0.2 mg/kg。然后在樣品中加入10 mL 甲醇并用渦旋振蕩混勻10 分鐘。之后，放置于通風櫥中在室溫下讓溶劑蒸發(fā)。加標樣品按照1.2.1 節(jié)方法處理，每個濃度水平重復(fù)測定5 次，連續(xù)測定3 天，采用基質(zhì)匹配標準工作曲線定量分析。

1.3 檢測條件

色 譜 柱：Acquity UPC2Trefoil AMY1 柱（150 mm×3 mm，2.5 μm）；背壓：13.79 MPa；柱溫：35℃；樣品室溫度：10℃；補償溶劑：0.1%甲酸的甲醇溶液，流速0.2 mL/min；進樣量：2 μL；流動相流速：2.0 mL/min；流動相：A 相為CO2，B 相為乙醇；梯度洗脫程序：初始至第2 分鐘CO2和乙醇的體積比由99% : 1%變成92% : 8%；第2 分鐘到第3.5 分鐘CO2和乙醇的體積比從92%:8%變成88% : 12%；第3.5 分中到第4 分鐘CO2和乙醇的體積比從88% : 12%變成99% : 1%；第4 分鐘到第5分鐘CO2和乙醇的體積比為99% : 1 %。質(zhì)譜掃描方式：正離子掃描；離子源：電噴霧電離源（ESI）；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；錐空氣流量：60 L/h；停留時間：100 ms；毛細管電壓：3.5 KV；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 磷胺和速滅磷的質(zhì)譜參數(shù)Tab. 1 MS parameters for phosphamidon and mevinphos

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采集采用MassLynxV4.1 軟件。平均值、回收率和相對標準偏差的計算采用Microsoft Excel 2007版軟件。

2 結(jié)果和討論

2.1 手性分離條件的優(yōu)化

2.1.1 手性柱的選擇

分別考察了四種不同的手性柱（Acquity UPC2Trefoil CEL1，Acquity UPC2Trefoil CEL2，Acquity UPC2Trefoil AMY1，Chiralcel IG-3）對磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體的分離情況[25,26]。Acquity UPC2Trefoil CEL1 和Acquity UPC2Trefoil CEL2 均為改性的多聚糖型固定相，其中Acquity UPC2 Trefoil CEL1 硅膠表面涂敷有纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯），Acquity UPC2Trefoil CEL2 硅膠表面涂敷有纖維素-三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯），Chiralpak IG-3硅膠表面共價鍵合有直鏈淀粉-三（3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯），Acquity UPC2Trefoil AMY1 硅膠表面共價鍵合有直鏈淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）。

當 使 用Acquity UPC2Trefoil CEL1 和Acquity UPC2Trefoil CEL2 時，不能實現(xiàn)磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體的完全分離。Acquity UPC2Trefoil AMY1，Chiralcel IG-3 均可實現(xiàn)對映體的分離，但是使用Acquity UPC2Trefoil AMY1 時，異構(gòu)體之間的分離度較好。從分離及色譜峰峰形綜合考慮，選用Acquity UPC2Trefoil AMY1 柱對磷胺和速滅磷異構(gòu)體進行分離（圖2）。

圖2 在四種不同色譜柱上磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體的SFC-MS/MS 色譜圖Fig. 2 Typical SFC-MS/MS chromatograms of isomers of phosphamidon and mevinphos on four columns

2.1.2 改性劑的影響

超臨界流體色譜以非極性的超臨界CO2流體為流動相，其對極性化合物的溶解性能和洗脫能力較弱，為增強流動相對分析物的溶解性能和洗脫能力，達到更好的分離效果和改善峰形，往往在超臨界二氧化碳流體中加入少量的極性有機溶劑（改性劑）[27,28]。在Acquity UPC2Trefoil AMY1 手性柱上，不添加任何改性劑即以純超臨界二氧化碳為流動相條件下（其他色譜條件為溫度35℃，系統(tǒng)背壓13.79 Mpa，流動相流速2 mL/min），磷胺和速滅磷均不能被洗脫（洗脫時間大于30 min）。這是由于這幾種物質(zhì)分子極性大，與手性柱產(chǎn)生較強的相互作用力使得洗脫困難造成的。如圖3 所示，本文對三種有機改性劑（甲醇、乙醇和異丙醇）對磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體在Acquity UPC2Trefoil AMY1 柱上的分離情況進行了考察。如圖3 所示，使用異丙醇作為改性劑后面一組峰的分離度較差，使用甲醇和乙醇作為改性劑均可以實現(xiàn)磷胺和速滅磷異構(gòu)體的基線分離，但乙醇更為環(huán)保。實驗中還考察了甲酸、乙酸和甲酸銨對磷胺和速滅磷異構(gòu)體分離的影響，結(jié)果表明，加入甲酸、乙酸等并沒有改善異構(gòu)體之間的分離度和響應(yīng)強度。因此，最終選擇乙醇作為流動相改性劑。

圖3 改性劑對磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體分離情況的影響Fig. 3 The effect of modifier solvent on the separation of isomers of phosphamidon and mevinphos

2.1.3 系統(tǒng)背壓的影響

系統(tǒng)背壓的變化會改變流動相的密度，從而影響對目標化合物的洗脫能力和選擇性。隨著系統(tǒng)背壓的升高，超臨界CO2流體密度隨著增加，對分析物的溶解和洗脫能力增強，目標物的保留時間隨著減小[29]。分別考察了不同的背壓（11.03 Mpa、12.41 Mpa、13.79 Mpa 和15.17 Mpa）對磷胺和速滅磷異構(gòu)體的分離情況。如圖4 所示，隨著背壓的增加，保留時間減小，但是背壓對異構(gòu)體的分離效率沒有顯著影響，磷胺與速滅磷異構(gòu)體的分離度幾乎不變。但是當背壓為13.79 MPa 時對映體的響應(yīng)強度最高，而且較高的壓力會縮短手性柱的使用壽命。因此，選擇13.79 Mpa 的系統(tǒng)背壓作為推薦值。

圖4 背壓對磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體分離情況的影響Fig. 4 The effect of ABPR on the separation of isomers of phosphamidon and mevinphos

2.1.4 柱溫的影響

一般情況下，在液相色譜中，隨著溫度的升高，目標化合物在固定相上的吸附/脫附會加快，從而加快樣品的分離。而在SFC 中，隨著柱溫的升高，超臨界CO2流體的密度和粘度降低，從而減慢了目標化合物在固定相上的吸附/脫附過程，導(dǎo)致保留時間延長[30,31]。在背壓13.79 MPa、流速2 mL/min 的條件下，研究了不同溫度（35℃、40℃、45℃、50℃）下磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體的分離效果。如圖5 所示，隨著溫度的升高，保留時間增加，但是異構(gòu)體之間的分離度幾乎不變。因此選擇35℃作為最優(yōu)色譜柱溫度。

圖5 柱溫對磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體分離情況的影響Fig. 5 The effect of column temperature on the separation of isomers of phosphamidon and mevinphos

2.1.5 磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體的洗脫順序

在優(yōu)化的色譜條件下分別將E-磷胺和E-速滅磷標準溶液注入SFC-MS/MS 中來鑒定每種異構(gòu)體的洗脫順序。磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體在手性柱（Acquity UPC2Trefoil AMY1）上按以下順序洗脫：E-速滅磷（1.33 min）、Z-速滅磷（1.48 min）、E-磷胺（2.37 min）、Z-磷胺（2.48 min）。在最優(yōu)化的分離條件下，煙草實際加標樣品的選擇離子色譜圖如圖6 所示。

圖6 煙草實際加標樣品的色譜圖(0.2 mg/kg)Fig. 6 Chromatogram of actual spiked samples of tobacco (0.2 mg/kg)

2.2 方法評價

2.2.1 基質(zhì)效應(yīng)[32]

以各個異構(gòu)體在煙草基質(zhì)中的線性方程斜率與其在乙腈中的線性方程斜率的比值來考察基質(zhì)效應(yīng)，當比值在0.9～1.1 之間時，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，當比值大于1.1 時為基質(zhì)增強效應(yīng)，小于0.9 則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果（表2）表明，各個異構(gòu)體的基質(zhì)效應(yīng)在0.10～0.75 之間，說明在煙草基質(zhì)中存在顯著的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，煙草樣品中所有異構(gòu)體的測定均使用基質(zhì)匹配標準溶液進行定量。

對樣品基質(zhì)進行稀釋可以降低基質(zhì)效應(yīng)。本文考察了不同稀釋倍數(shù)下烤煙樣品中各對映體的基質(zhì)效應(yīng)，由表2 可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，分析物的相對響應(yīng)強度（各樣品的響應(yīng)強度與標樣的響應(yīng)強度之比）也隨著增大，表明稀釋有助于減小基質(zhì)效應(yīng)。但是稀釋倍數(shù)過高，分析物濃度則降低，影響方法靈敏度。因此，選用乙腈將其稀釋5 倍進樣。

2.2.2 標準曲線、檢出限和定量限

選用空白煙葉試樣按1.2 節(jié)實驗步驟提取凈化后，添加不同級別的混合標準工作溶液配制成基質(zhì)匹配標準工作溶液，進行SFC-MS/MS 分析。通過各農(nóng)藥異構(gòu)體的峰面積對其濃度進行回歸分析，得到標準曲線、相關(guān)系數(shù)。標準曲線的形式為y=Ax+B，其中A 和B 分別表示為斜率和截距。對于每種異構(gòu)體，在各自的濃度范圍內(nèi)分析純?nèi)軇藴使ぷ髑€和不同基質(zhì)匹配的標準工作曲線，以確定該方法的線性關(guān)系。按信噪比（S/N）=3 確定方法檢出限，信噪比（S/N）=10 確定方法定量限。結(jié)果表明（表2），不同基質(zhì)中各異構(gòu)體線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)R2≥0.9922），LOD 和LOQ 范圍分別為0.6 μg/kg～1.7 μg/kg 和2.0 μg/kg～5.5 μg/kg，可以滿足定量分析的需要。

表2 各異構(gòu)體的線性方程、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限Tab. 2 Regression equation, matrix effect, LODs, and LOQs for the isomers of phosphamidon and mevinphos

2.2.3 方法的回收率及精密度

將空白煙葉樣品分成3 份，分別添加0.02 mL、0.1 mL 和0.4 mL 的混合標準溶液，每個濃度的樣品每天重復(fù)測定5 次，重復(fù)試驗3 天，按照1.2.1 節(jié)的方法進行前處理。通過空白樣品加標回收實驗來測試該方法的準確度和精確度，其精確度由重復(fù)性實驗確定，并以RSD 表示。通過比較同一天內(nèi)加標樣品的回收率的標準偏差來測量日內(nèi)精密度。通過分析三個不同日期的加標樣品來確定日間精確度。結(jié)果（表3）表明，在所有濃度水平下的加標回收率為84.7%～96.7%，日內(nèi)精密度（RSD）為2.0%～4.2%，日間精密度（RSD）為2.4%～4.3%。說明在所有濃度水平下均獲得令人滿意的回收率，且精密度良好，該方法適用于煙草中磷胺和速滅磷異構(gòu)體的分離和測定。

表3 方法的精密度和準確度Tab. 3 Accuracy and precision of the proposed method

采用本方法對20 個烤煙樣品進行了測定，所有樣品均未檢出磷胺和速滅磷的異構(gòu)體。

3 結(jié)論

本文采用超臨界流體色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用建立了分離和測定磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體的方法。在最優(yōu)化的實驗條件下，磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體的回收率在84.7%～96.7%之間，日內(nèi)精密度為2.0%～4.2%，日間精密度為2.4%～4.3%。該方法以CO2和乙醇作為流動相，綠色環(huán)保、簡單快速、靈敏度高、選擇性強、結(jié)果準確，在5 min 內(nèi)即可實現(xiàn)磷胺和速滅磷順反異構(gòu)體的基線分離，在實際樣品的批量檢測中有巨大的優(yōu)勢。