向立剛 ，汪漢成，鄭蘋，蔡劉體，余知和

1 長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；

2 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081

煙草赤星病是由鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌引起的煙株生長后期主要葉部真菌性病害，在我國各個煙區(qū)均有發(fā)生，輕發(fā)病煙田發(fā)病率一般在10%以下，重發(fā)病煙田發(fā)病率可達(dá)50%，少數(shù)地塊在發(fā)病嚴(yán)重的年份煙田發(fā)病率接近100%，每年因煙草赤星病所造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百萬元。目前已知引起煙草赤星病的鏈格孢有Alternaria alternata、A. longipes、A. tenuissim、A. yaliinficiens和A. tabacicola等[1-4]。 該病原菌在大田期和烘烤期均會對煙葉造成嚴(yán)重危害。了解煙葉內(nèi)生及葉際病原菌種類對指導(dǎo)煙草赤星病的防治具有重要意義。

葉際作為一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其可利用的營養(yǎng)成分極少，且單日溫濕度波動大，紫外線強(qiáng)度高，微生物的生存條件極為嚴(yán)苛[5-6]。但即使如此，植物葉際也有著豐富的微生物種群，其中包括各類有益菌和部分病原菌[7]。葉際微生物群落的穩(wěn)定直接影響植物的健康。相關(guān)研究表明，病原菌的侵染與病害的發(fā)生通常會導(dǎo)致葉際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而葉際微生態(tài)的健康與否也會間接影響植株抵御病原菌的能力。隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對于葉際微生態(tài)的研究逐步深入，開始從微觀角度揭示葉際微生物的組成與多樣性，以及其與外界因素間的相互作用。羅路云等研究表明隨著白粉病病情等級的增加，南瓜葉際細(xì)菌群落α 多樣性指數(shù)呈現(xiàn)先降后升的趨勢[8]。劉暢等發(fā)現(xiàn)感染赤星病的煙葉葉際優(yōu)勢細(xì)菌為泛菌屬和假單胞菌屬[9]。徐慧等[10]對云南煙草葉片內(nèi)生及葉際真細(xì)菌的多樣性研究表明，假單胞菌屬，芽孢桿菌屬和鏈格孢屬為云南絕大多數(shù)地區(qū)煙草葉片內(nèi)生及葉際優(yōu)勢菌屬。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，增加了人們對于葉際微生物的關(guān)注度，為葉片內(nèi)生及葉際微生物的研究提供了全新的思路與方法。

目前人們對于煙草微生物群落的研究大都聚集于大田鮮樣，如研究拮抗菌劑對煙株及土壤微生物的影響[11-14]、種植模式對煙株根際土壤微生物的影響[15-17]以及感病前后煙株不同部位微生物群落的改變[18-19]等。而缺乏對烤房內(nèi)感赤星病烤后煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)的了解。陳乾麗等[20]對烤后不同霉變程度的煙葉葉際真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性研究發(fā)現(xiàn)，不同霉變程度的煙葉葉際真菌群落組成存在較大差異，曲霉屬為不同霉變程度煙葉中的優(yōu)勢菌屬。本文研究了健康與感赤星病烤后煙葉內(nèi)生及葉際真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性差異，其結(jié)果對烘烤期煙草赤星病的防治具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019 年8 月于貴州省黔東南州感赤星病嚴(yán)重的煙田隨機(jī)選取3 株明顯感染赤星病的成熟期煙株（種植品種‘云煙87’），用消毒過后的剪刀在同一煙株上剪取7 級病級煙葉和0 級健康煙葉樣品，病級分類參考侯爍等[21]煙草赤星病病級分類方法。分別將兩類葉片做好標(biāo)記放入烤房直至烘烤完成，用無菌取樣袋收集樣品，0 級健康組（HJ）樣品編號分別為JXY1、JXY2 和JXY3，7 級赤星病組（HB）樣品編號為BXY1、BXY2 和BXY3。采集樣品快速帶回實驗室置于-80℃冰箱保存。

1.2 煙葉樣品DNA 提取

稱取烤后煙葉樣品0.5 g，采用Qiagen 公司的植物組織DNA 提取試劑盒（Qiagen，69104）抽提煙葉樣品微生物基因組總DNA，具體步驟按照操作說明進(jìn)行。提取完成后，使用NanoDrop 2000 檢測抽提DNA 的濃度和純度。

1.3 擴(kuò)增及測序

以提取樣品DNA 為模板，采用引物ITS1F （5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R （5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）對 真 菌18S rRNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的ITS1 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系為20 μL：20 ng/μL 模板DNA 1 μL，5 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，5×FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL， Fast Pfu 聚合酶0.4 μL， BSA（牛血清白蛋白）0.2 μL，滅菌ddH2O 11.8 μL。反應(yīng)程序參數(shù)：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測合格后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用Illumina 公司Miseq PE300 平臺進(jìn)行高通量測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

原始測序序列使用Trimmomatic 軟件進(jìn)行質(zhì)控，篩出低質(zhì)量的序列；使用 Usearch (version 7.0 http://drive5.com/usearch/) 對相似度≥97% 的序列進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類，并在聚類過程去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/） 參 照Unite（Release 7.2 https://unite.ut.ee/index.php）真菌數(shù)據(jù)庫對每條序列進(jìn)行物種分類注釋。通過對樣品進(jìn)行 Alpha 多樣性分析、物種組成及差異分析等，了解赤星病烤后煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性。反映樣本真菌群落豐富度的指數(shù)包括Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)，Sobs 指數(shù)為實際觀測到的OTU 數(shù)，Chao1 指數(shù)為利用chao1 算法估計樣本中所含的OTU 數(shù)目，Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)越大群落豐富度越高；反映樣本真菌群落多樣性的指數(shù)包括Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)，Shannon 指數(shù)越大或Simpson 指數(shù)越小群落多樣性越高。Coverage 指數(shù)表示測序的覆蓋度，其值越高樣品中序列被測出的概率越高，測序結(jié)果的真實性越高。Alpha 多樣性指數(shù)采用 軟 件mothur （https://mothur.org/wiki/calculators）計算。同時在各個分類水平上對所注釋物種進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS 序列測序深度分析及數(shù)據(jù)質(zhì)控

稀釋曲線（Rarefaction curve）展示了不同樣品間多樣性的差異，用來檢驗測序結(jié)果是否合理。樣本曲線延伸終點橫坐標(biāo)為該樣本的測序數(shù)量。本試驗中6 個樣本的稀釋曲線在測序深度為30,000 時就趨于平緩（圖1），曲線趨于平緩表明測序已趨于飽和，測序深度已足夠，增加測序數(shù)據(jù)無法再找到更多的OTU，因此，此次測序深度已經(jīng)覆蓋到樣品中的絕大多數(shù)物種，測序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)的真實情況。

圖1 稀釋曲線（OTU 水平Sobs 指數(shù)）Fig. 1 Rarefaction curve (Sobs index of OTU level)

表1 為原始序列優(yōu)化處理信息表，試驗中兩組6個樣本共得到215,781 條高質(zhì)量片段序列，54,468,693個堿基，單一樣本序列條數(shù)在32,640～38,424 之間，平均序列長度為253 bp。赤星病組3 個樣本共得到111,156 條序列，28,510,893 個堿基，單一樣本序列條數(shù)在35,764～38,424 之間，平均序列長度為257 bp；健康組3 個樣本共得到104,625 條序列，25,957,800個堿基，單一樣本序列數(shù)在32,640～37,225 之間，平均序列長度為245 bp。

表1 樣本序列優(yōu)化信息Tab. 1 Sample sequence optimization information

2.2 OTU 聚類分析

在97%的相似度水平對樣品序列進(jìn)行OTU 聚類，赤星病組煙葉樣本共鑒定到真菌的3 個門，15 個綱，26 個目，37 個科，57 個屬，73 個種，98 個OTU；健康組煙葉樣本共鑒定到真菌的5 個門，22 個綱，44 個目，75 個科，140 個屬，182 個種，274 個OTU（表2）。

表2 煙葉樣本真菌群落各級別分類單元數(shù)量Tab. 2 Number of taxonomic taxa with the fungal communities in tobacco leaves

2.3 真菌群落基本組成及多樣性分析

真菌群落組成分析表明，赤星病烤后煙葉樣品中鏈格孢屬Alternaria為最優(yōu)勢菌屬，在BXY1、BXY2和BXY3中的相對豐度分別為87.91%、77.22%和78.92%；其次為紅醇母屬Rhodotorula，在BXY1、BXY2和BXY3中的相對豐度分別為11.60%、21.25%和20.25%。健康烤后煙葉樣品中紅醇母屬在JXY1和JXY2中為最優(yōu)勢菌屬，其相對豐度分別為91.00%和86.94%，在JXY3中為優(yōu)勢菌屬相對豐度為20.92%。JXY3中的最優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬，相對豐度為50.95%。JXY1中Unclassified_k_Fungi相對豐度占4.41%，Alternaria相對豐度為0.76%。JXY2中相對豐度大于1%的菌屬有Unclassified_k_Fungi（1.94%）、Alternaria（1.88%）和Unclassified_f_Incertae_sedis_o_Pleosporales（1.29%）。JXY3中相對豐度大于1%的菌屬有Unclassified_f_Incertae_sedis_o_Pleosporales（3.98%）、Unclassified_k_Fungi（1.99%）、Unclassified_f_Mycosphaerellaceae（2.94%）、Wallemia（1.29%）、unidentified_f_Incertae_sedis_o_Trichosphaeriales（1.24%）、曲霉屬Aspergillus（8.81%）和Unclassified_o_Pleosporales（1.16%）。

樣品Alpha 多樣性指數(shù)見表3，所有樣品的Coverage 指數(shù)均高于0.99，表明序列被檢測出的概率高，測序結(jié)果能夠代表樣本中實際的真菌群落分布。豐富度指數(shù)中Sobs 指數(shù)健康組樣品高于赤星病組樣品，Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)健康組樣品高于赤星病組樣品（BXY2 除外），結(jié)果表明健康組樣品中真菌群落豐富度高于赤星病組樣品真菌群落。多樣性指數(shù)中Shannon 指數(shù)健康組樣品（JXY1 除外）高于赤星病組樣品，Simpson 指數(shù)健康組樣品（JXY3 除外）高于赤星病組樣品，表明健康組樣品真菌群落多樣性整體高于赤星病組樣品真菌群落。

表3 不同樣品真菌群落Alpha 多樣性指數(shù)（OTU level）Tab. 3 Alpha diversity index of fungal communities in different samples (OTU level)

2.4 Beta 多樣性分析

屬水平的主成分分析（圖3a）結(jié)果表明，導(dǎo)致樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異的主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別占全部影響因素的96.25%和3.7%，健康組樣品與赤星病組樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著性差異，而健康組樣品中BXY3 樣品與其余兩樣本存在較大差異，赤星病組中3 樣品間無顯著性差異。ANOSIM 相似性分析（圖3b）結(jié)果表明，赤星病組煙葉組內(nèi)樣品差異性較小，健康組煙葉組內(nèi)樣品差異性較大，但兩組煙葉的組內(nèi)差異小于兩組組間的差異。

圖2 不同樣品真菌群落屬水平的相對豐度Fig. 2 The relative abundance of fungal communities of different samples at genus level

圖3 不同樣品真菌群落屬水平Beta 多樣性分析Fig. 3 Analysis on the Beta diversity of fungal communities of different samples at genus level

2.5 LEfSe 多級物種差異判別分析

LEfSe 多級物種差異判別分析結(jié)果表明，當(dāng)LDA 閾值為4 時，健康組與赤星病組煙葉真菌群落從門到屬共有19 個不同分類水平上的真菌存在顯著性差異。赤星病組煙葉中子囊菌門Ascomycota、座囊菌綱Dothideomycetes、假球殼目Pleosporales、格孢腔菌科Pleosporaceae 和鏈格孢屬，健康組煙葉中Capnodiales 目、Eurotiomycetes綱、散囊菌目Eurotiales、Trichocomaceae 科、曲霉屬Aspergillus、擔(dān)子菌門Basidiomycota、微球黑粉菌綱Microbotryomycetes、Sporidiobolales 目和Incertae_sedis_o_Sporidiobolales 科等，是造成健康烤后煙葉與赤星病烤后煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異的主要菌群。

圖4a LEfSe 物種差異分析（多級物種層級樹）Fig. 4a LEfSe species difference analysis (Multistage species hierarchical tree map)

圖4b LEfSe 物種差異分析（LDA 判別結(jié)果）Fig. 4b LEfSe species difference analysis (LDA discriminant results)

3 討論

微生物群落的Alpha 多樣性指數(shù)用于反映微生物群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度。一般而言，微生物群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，微生態(tài)環(huán)境越穩(wěn)定，群落的多樣性指數(shù)也就越高[22]。本研究中，赤星病烤后煙葉真菌群落豐富度與多樣性較健康烤后煙葉真菌群落降低，說明健康烤后煙葉中真菌群落結(jié)構(gòu)優(yōu)于赤星病烤后煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)。亦表明，赤星病病害的發(fā)生改變了煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)，降低了其真菌多樣性，這與煙株感青枯和黑脛病后微生物多樣性變化趨勢一致[23-24]。

物種組成結(jié)果表明，健康與赤星病烤后煙葉中優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬和紅醇母屬，但在健康與赤星病烤后煙葉中相對豐度存在較大的差異，赤星病烤后煙葉中二者相對豐度之和大于90%，其余真菌屬的總相對豐度不到10%。鏈格孢屬作為煙草赤星病的重要病原菌，在赤星病烤后煙葉中為絕對優(yōu)勢菌屬，因此病原菌數(shù)量是病害發(fā)生的主要影響因素之一。紅醇母屬廣泛存在于自然界中，如海洋[25]、腸道[26]、煙株莖稈[27]等，部分可用于發(fā)醇，還有報道紅醇母屬部分菌株可導(dǎo)致地黃根腐病[28]。所有樣本中均出現(xiàn)了部分Unclassified Fungi，這可能是由于數(shù)據(jù)庫中包含的真菌種類有限，導(dǎo)致數(shù)據(jù)庫外的真菌無法匹配。部分煙葉上出現(xiàn)了曲霉屬真菌，該菌為烤房中常見的真菌，通常能夠?qū)е聼熑~霉變[29]。劉暢等[30]發(fā)現(xiàn)大田感赤星病煙葉內(nèi)生及葉際真菌的優(yōu)勢菌屬主要為鏈格孢屬、莖點霉屬、鐮刀菌屬、赤霉屬和枝孢霉屬等。徐慧等[10]發(fā)現(xiàn)云南省5 個地區(qū)健康煙葉內(nèi)生及葉際真菌包括鏈格孢屬、枝孢霉屬、鐮刀菌屬和莖點霉屬等。健康煙葉中鏈格孢屬的存在表明并非所有鏈格孢真菌都能導(dǎo)致煙葉感赤星病。莖點霉屬真菌可導(dǎo)致煙葉發(fā)生莖點霉葉斑病，赤霉屬真菌可導(dǎo)致小麥赤霉病、玉米穗腐病和水稻惡苗病等，部分枝孢霉屬真菌則是人類致病菌。通過比較分析可看出，赤星病烤后煙葉經(jīng)烤房高溫烘烤后莖點霉屬、鐮刀菌屬、赤霉屬和枝孢霉屬等病原菌從煙葉樣品上消失或成為非優(yōu)勢菌屬。而紅醇母屬真菌則在烘烤過程中成為了赤星病烤后煙葉中繼鏈格孢之后的優(yōu)勢菌屬和健康烤后煙葉中的絕對優(yōu)勢菌屬，因此結(jié)合紅醇母屬的特性，推測其可能在煙葉烘烤過程中起到發(fā)醇煙葉產(chǎn)生特殊芳香氣味的作用。該推測將在后續(xù)研究中加以驗證。

赤星病烤后煙葉組內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)差異性較大，健康烤后煙葉組內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)差異較小。其可能是由于感病后病原菌的侵入削弱了煙葉本身的防御能力，環(huán)境中真菌侵入導(dǎo)致其真菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了較大程度的改變。為此，健康烤后煙葉中真菌群落結(jié)構(gòu)組內(nèi)差異較小。

4 結(jié)論

經(jīng)高通量測序技術(shù)分析表明：1.赤星病烤后煙葉內(nèi)生及葉際優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬和紅醇母屬；2.健康烤后煙葉內(nèi)生及葉際優(yōu)勢菌屬為紅醇母屬；3.健康烤后煙葉上也存在鏈格孢屬，但其相對豐度很低；4.赤星病烤后煙葉內(nèi)生及葉際真菌群落多樣性低于健康烤后煙葉。然而本文僅僅對赤星病烤后煙葉進(jìn)行了研究，并未對烘烤前新鮮感赤星病煙葉進(jìn)行采樣分析其真菌群落，今后將加強(qiáng)對新鮮感赤星病煙葉真菌群落的研究，已明確烘烤過程對感赤星病煙葉真菌群落的影響，進(jìn)而改進(jìn)煙葉烘烤的各類參數(shù)，以此控制烘烤過程中赤星病的擴(kuò)展。