李毓玲 張 國 梁運嘯 農(nóng) 兵 梁列新 郭先文

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧市 530021，電子郵箱：1015886762@qq.com)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種臨床常見的功能性腸病，主要表現(xiàn)為慢性或復(fù)發(fā)性腹痛、大便性狀和排便習(xí)慣異常。該病在西方國家的患病率達22%，在我國的患病率也逐年升高[1-2]。根據(jù)臨床癥狀可將IBS分為腹瀉型、便秘型、混合型和未定型，臨床上以腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea irritable bowel syndrome，IBS-D)最常見，但其診斷主要依賴以癥狀學(xué)為主的羅馬Ⅳ診斷標準[3]，缺乏特異性的實驗室指標，導(dǎo)致臨床診治難度大。精準診治有賴于對疾病發(fā)病機制的詳盡認識，然而IBS-D的發(fā)病機制目前仍未明確。研究表明，基于腦-腸軸的“神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)”參與IBS-D的發(fā)病，其中免疫活化起著重要作用[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IBS患者外周血及腸黏膜中T淋巴細胞增多提示適應(yīng)性免疫激活[5-6]；IBS-D患者腸黏膜中T淋巴細胞等免疫細胞浸潤增多，也證實了免疫炎癥在IBS-D發(fā)生與發(fā)展的過程中的重要性[7]。在IBS-D患者腸黏膜中明顯增加的T淋巴細胞以CD4+、CD3+、CD8+細胞為主[8]。其中CD4+輔助性T細胞(T help cell，Th)活化導(dǎo)致免疫激活，影響IBS-D的發(fā)生和發(fā)展[8]。在功能上CD4+Th細胞可分化為多種細胞亞群，包括 Th1、Th2、Th17和最近發(fā)現(xiàn)的Th22細胞，它們分別選擇性表達干擾素γ、白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-17和IL-22[9]，但是目前關(guān)于這些CD4+T淋巴細胞亞群與IBS-D的研究甚少。本研究探討CD4+T淋巴細胞亞群在IBS-D患者中的分布及其對IBS-D的臨床診斷效能，以期為臨床上遴選出可靠的診斷標記物提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年11月至2019年4月在本院診斷為IBS-D的30例患者作為IBS-D組。納入標準：(1)IBS-D診斷符合羅馬Ⅳ診斷標準[3]，病程至少2年；(2)年齡18～65周歲，男女不限；(3)既往無癌癥、炎癥性腸病、結(jié)締組織病、代謝性疾病及其他器質(zhì)性疾病史；(4)無胃腸道手術(shù)史者；(5)無哮喘等過敏性疾病，近1個月內(nèi)未服用抗過敏藥、非甾體類消炎藥及未飲酒者；(6)納入研究后隨訪3個月，期間仍符合羅馬Ⅳ診斷標準。排除標準：(1)結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變；(2)妊娠或哺乳期女性。另選取同期20例體檢健康者作為對照組。納入標準：(1)年齡18～65周歲，男女不限；(2)排除腹部急慢性疼痛、腸道急慢性感染及IBS；(3)無哮喘等過敏性疾病，近1個月內(nèi)未使用抗過敏藥、非甾體類消炎藥及未飲酒；(4)常規(guī)體檢結(jié)果無異常；(5)結(jié)腸鏡檢查未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變。排除妊娠或哺乳期女性。兩組研究對象的一般情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。研究對象均自愿參與本研究，并簽署知情同意書。本研究已經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準。

表1 兩組研究對象的一般情況比較

1.2 主要試劑和儀器 200目細胞過濾篩網(wǎng)(Solarbio公司，批號：XBGLS200),流式細胞儀(美國BD Biosciences公司，型號：BD FACSCantoⅡ)，離心機(美國Eppendorf公司，型號：TDZS-WS)，培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司，型號：forma37)，生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器，型號：HFsafe-1200A2)。1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS；Solarbio公司,批號：P1020-500),膠原酶D(美國Roche Diagnostics公司，批號：11088866001)，二硫蘇糖醇(美國Sigma公司，批號：20200902)，淋巴細胞分離液(Ficoll-PaqueTMPLUS GE公司，批號：17-1440-03)，新鮮胎牛血清(美國Gibco公司，批號：10099-13)，臺盼藍(美國Gibco公司，批號：15250-061)，青霉素+鏈霉素(美國Gibco公司，批號：15140-122)，淋巴細胞刺激劑(美國eBioscience公司，批號：00-4975-93)，固定破膜劑(美國BioLegend公司，批號：554714)。熒光抗體包括異硫氰酸熒光素抗人CD4抗體、別藻藍蛋白抗人IL-22抗體、藻紅蛋白抗人IL-17抗體、別藻藍蛋白抗人IL-4抗體、藻紅蛋白-花青素抗人干擾素γ抗體均購自美國eBioscience公司(批號：MA1-19603、12-7229-41、12-7169-42、17-7049-42、25-7319-41)。廣譜鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化檢測試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：SP-0022)，免疫組化抗體兔抗人IL-22多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-2623R)。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個核細胞提?。菏褂谜婵崭嗡剽c抗凝管采集患者空腹時前臂靜脈血約3mL，取2 mL肝素抗凝血與PBS等體積混合后，采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法收集外周血單個核細胞。

1.3.2 腸黏膜固有層單個核細胞提?。簠⒄誋art 等[10]的方法提取腸黏膜固有層單個核細胞。常規(guī)電子結(jié)腸鏡檢查時(操作前一晚7點及當天早晨7點患者口服稀釋后的磷酸鈉鹽口服液清腸)內(nèi)鏡直視下用同一型號活檢鉗隨機、多點采取結(jié)腸黏膜組織(升結(jié)腸2塊、橫結(jié)腸2塊)：1塊置于濃度為10%的中性福爾馬林液中，3塊置于放有冰冷的1×PBS的培養(yǎng)皿中，用10 mL注射器將腸腔糞便沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移至含青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。將活檢組織放入10 mL含1 mmol/L二硫蘇糖醇和1 mmol/L乙二胺四乙酸的(不含有鈣和鎂離子)平衡鹽溶液中，去除黏液和上皮細胞。處理后的組織轉(zhuǎn)入10 mL含1 mg/mL膠原酶D的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃水浴消化1.5～2 h，采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法收集腸黏膜固有層單個核細胞。0.2%臺盼藍拒染實驗檢測，細胞活性≥95%。

1.3.3 細胞因子檢測：在含有腸黏膜或外周血單個核細胞的培養(yǎng)基中加入細胞刺激劑(每1 mL培養(yǎng)基中加2 μL)，37℃ 孵育4 h，用異硫氰酸熒光素抗人CD4抗體進行細胞表面標記，經(jīng)固定破膜后進行細胞內(nèi)細胞因子熒光染色標記。使用流式細胞儀，采用四色流式細胞術(shù)檢測細胞比例。細胞表面表達CD4分子時，若細胞內(nèi)表達IL-22則為Th22細胞，若細胞內(nèi)表達IL-17則為Th17細胞，若細胞內(nèi)表達IL-4則為Th2細胞，若細胞內(nèi)表達干擾素γ則為Th1細胞；采用雙盲法進行結(jié)果分析。

1.3.4 蘇木精-伊紅染色：取腸黏膜活檢組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，進行蘇木精-伊紅染色，由病理科醫(yī)生采取盲法進行組織病理學(xué)診斷，診斷標準參照文獻[11]。

1.3.5 免疫組化染色：將制作好的石蠟切片置于65℃烘箱中，烘烤切片2 h，常規(guī)二甲苯、酒精脫蠟至水化，用pH為7.4的PBS沖洗3次，3 min/次。于3%過氧化氫中孵育10 min，PBS液洗3次，3 min/次，滴加山羊血清封閉液，置室溫封閉30 min，除去多余液體，滴加濃度為 1 ∶200 的兔抗人IL-22多克隆抗體50 μL,37℃恒溫孵育1 h，PBS 液洗 3 次，3 min/次，滴加酶標單抗鼠/兔IgG聚合物 50 μL，3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、固定、封片、鏡檢。用PBS代替一抗做陰性對照。免疫組化結(jié)果定性判斷標準：光鏡下觀察到IL-22的陽性染色主要位于胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒沉積。免疫組化結(jié)果定量判斷標準：高倍鏡下(×400)隨機選取互不重疊的3個視野，用專業(yè)圖像分析軟件 Image-ProPlus 6.0測定每個視野陽性染色的光密度平均值[光密度平均值=累積光密度值/(除去空白部分)視野面積]，取其平均值作為IL-22的表達水平。

1.4 觀察指標 記錄兩組研究對象腸黏膜中Th22細胞的比例，外周血中Th22細胞、Th17細胞、Th2細胞、Th1細胞的比例，腸黏膜病理切片蘇木精-伊紅染色結(jié)果，腸黏膜中IL-22表達水平。入組后行腸鏡檢查前采用IBS癥狀嚴重程度量表(IBS Symptom Severity Scale，IBS-SSS)[12]評分、胃腸道癥狀分級量表(Gastrointestinal Symptom Rating Scale，GSRS)[13]評分評價兩組研究對象的病情嚴重程度，其中IBS-SSS 包括IBS癥狀對日常生活的困擾、腹脹的嚴重程度、腹痛的嚴重程度、腹痛的頻率以及對大便情況的滿意度。得分范圍從0分(無癥狀)到500分(最大嚴重程度)。GSRS 包括上腹痛、胸部不適、反酸、饑餓痛、惡心、腸鳴音、腹脹、咽喉部不適、口氣、便秘、腹瀉、大便稀、大便干結(jié)、有便意需立即排便、里急后重。每項按0分(完全沒有)～6分(特別嚴重)進行評分。分析CD4+T淋巴細胞亞群比例及腸黏膜中IL-22水平與IBS-SSS評分、GSRS評分的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布的計量資料用(x±s)表示，比較用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料用[M(P25，P75)]表示，比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評價CD4+T淋巴細胞亞群比例及腸黏膜中IL-22水平對IBS-D的診斷效能。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組腸黏膜病理切片蘇木精-伊紅結(jié)果 IBS-D組患者的腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體結(jié)構(gòu)正常，但腸黏膜固有膜層中炎癥細胞增多，以單個核細胞為主，表現(xiàn)為非特異性炎癥。對照組未見明顯病理學(xué)異常。見圖1。

圖1 兩組腸黏膜病理學(xué)的改變(蘇木精-伊紅染色，×200)

2.2 兩組腸黏膜Th22細胞比例和IL-22水平的比較 IBS-D組患者腸黏膜的Th22細胞比例和IL-22水平均高于對照組(P<0.05)。見表2、圖2和圖3。

表2 兩組腸黏膜Th22細胞比例和IL-22水平的比較[M(P25，P75)]

圖2 兩組腸黏膜Th22細胞比例四色流式細胞術(shù)散點圖

圖3 兩組腸黏膜組織IL-22免疫組化圖(免疫組化染色，×400)注：IL-22的陽性染色主要位于胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒沉積。

2.3 兩組外周血CD4+T淋巴細胞亞群比較 IBS-D組患者外周血Th17細胞比例高于對照組(P<0.05)；而兩組間Th22細胞、Th1細胞和Th2細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖4。

表3 兩組外周血CD4+T淋巴細胞亞群比較(x±s，%)

圖4 兩組外周血CD4+T淋巴細胞亞群四色流式細胞術(shù)散點圖

2.4 CD4+T淋巴細胞亞群比例、IL-22水平與IBS-SSS評分、GSRS評分的關(guān)系 腸黏膜Th22細胞比例、IL-22水平和外周血Th22細胞、Th17細胞比例與IBS-SSS評分、GSRS評分呈正相關(guān)(P<0.05)，而外周血Th2細胞、Th1細胞比例與IBS-SSS評分、GSRS評分無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表4和表5。

表4 腸黏膜Th22細胞比例、IL-22水平與IBS-SSS評分、GSRS評分的關(guān)系

表5 外周血CD4+T淋巴細胞亞群與IBS-SSS評分、GSRS評分的關(guān)系

2.5 CD4+T淋巴細胞亞群比例、IL-22水平對IBS-D的診斷效能 腸黏膜Th22細胞比例、IL-22水平和外周血Th22、Th17、Th2、Th1細胞比例診斷IBS-D的臨界值分別為0.955%、0.182、0.795%、0.625%、1.195%、7.290%，ROC曲線下面積分別為0.893、0.839、0.733、0.738、0.581、0.651。見圖5、表6。

圖5 CD4+T淋巴細胞亞群、IL-22水平對IBS-D的診斷效能

表6 CD4+T淋巴細胞亞群、IL-22水平對IBS-D的診斷效能

3 討 論

IBS是一種常見的功能性腸病，全球患病率約為5%～15%，且逐年上升[3]，我國IBS患病率約為5.7%[14]。臨床上以IBS-D最為常見，但其診斷主要依賴以癥狀學(xué)為主的羅馬Ⅳ診斷標準，該診斷標準主觀性較強，容易造成誤診或者漏診，因此，尋找一種診斷效能較高的生物學(xué)標記物是目前IBS臨床診療面臨的挑戰(zhàn)之一。近年來，隨著研究的深入，免疫應(yīng)激在IBS發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來越明確，炎癥細胞及其效應(yīng)因子有望成為診斷IBS-D的有效生物學(xué)標記物。研究證明，IBS-D患者存在腸道低度慢性炎癥[15],90%患者的腸肌神經(jīng)叢內(nèi)有少量淋巴細胞浸潤[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，IBS患者腸黏膜內(nèi)T淋巴細胞數(shù)量增多，且黏膜固有層免疫活性細胞也增多，這一變化在IBS-D患者中更為明顯[17]。研究表明，IBS-D患者腸黏膜固有層中以CD4+T淋巴細胞浸潤增多為主[18]，CD4+Th細胞活化導(dǎo)致免疫激活，影響IBS-D的發(fā)生發(fā)展[8]。

本研究結(jié)果顯示，IBS-D組患者腸黏膜的Th22細胞比例及IL-22水平均高于對照組，且與IBS-SSS評分、GSRS評分呈正相關(guān)(P<0.05)，其診斷IBD-D的ROC曲線下面積分別為0.893、0.839，靈敏度分別為86.7%、83.3%，特異度分別為80.0%、75.0%，提示Th22細胞比例及IL-22水平與IBS-D患者的腹痛、腹瀉等癥狀密切相關(guān)，且對IBS-D具有較高的診斷效能。而IBS-D組外周血Th22細胞比例與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其原因可能是IBS-D患者的免疫激活僅僅存在于腸道，而非全身性[19]。Th22細胞是CD4+T細胞的另一新亞群，其主要通過分泌 IL-22 發(fā)揮作用。IL-22信號通路在黏膜免疫防御及組織再生中發(fā)揮多種作用[20]。目前，Th22細胞及IL-22已被證實與過敏性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21-23]。在機體內(nèi)IL-22主要通過與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，研究證實消化道表達IL-22受體1鏈為IL-22的主要作用靶點[24]。有研究報道，腸道存在炎癥時，小腸上皮細胞在IL-22的誘導(dǎo)下可生成黏蛋白等相關(guān)蛋白以抵御病原菌感染，從而減少腸道損害[25]；同時，IL-22會通過信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路重塑杯狀細胞和促進上皮細胞再生，從而阻止有害微生物侵及上皮層；結(jié)腸中IL-22的過表達可促進杯狀細胞再生和黏液分泌，減少共生細菌易位，從而達到保護結(jié)腸上皮細胞的效果[26-27]。Leppkes等[28]將IL-22缺陷的T細胞和野生型T細胞分別轉(zhuǎn)移至重組激活基因1缺陷的小鼠體內(nèi),前者可導(dǎo)致嚴重的結(jié)腸炎，這進一步證實了IL-22在腸道炎癥中具有保護作用。

本研究結(jié)果還顯示，IBS-D組患者外周血Th17細胞比例高于對照組(P<0.05)，其診斷IBD-S的ROC曲線下面積為0.738，靈敏度為62.5%，特異度為53.3%，提示外周血Th17對IBS-D的診斷效能較低，與既往研究結(jié)果相似[19]。Th17細胞主要通過分泌IL-17來發(fā)揮調(diào)節(jié)固有免疫的作用，IL-17還可聯(lián)合干擾素γ促進單核細胞趨化蛋白1等趨化因子的分泌，進一步破壞腸黏膜屏障[29]。干擾素γ又是Th1細胞的特異效應(yīng)因子。研究證實，高濃度干擾素γ通過破壞腸黏膜上皮細胞緊密連接的通透性，引起腸黏膜屏障受損，進而導(dǎo)致水鈉吸收功能障礙，出現(xiàn)腹瀉等臨床癥狀[30]。與此相反，Th2細胞通過分泌IL-4起到抑制炎癥發(fā)生和發(fā)展的作用[31]。實驗研究顯示，用表達IL-4的重組5型腺病毒載體來治療由三硝基苯磺酸誘發(fā)的結(jié)腸炎，可明顯地減少腸道黏膜的損傷[32]。由此看來，Th17細胞和Th1細胞主要發(fā)揮促進腸道炎癥的作用，而Th2細胞則發(fā)揮抑制腸道炎癥的作用。但是本研究結(jié)果顯示，兩組間外周血Th1細胞和Th2細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這表明IBS-D患者的全身免疫激活狀態(tài)不明顯，也許僅僅存在于腸道局部。今后需要進一步探究Th17細胞、Th1細胞和Th2細胞在腸黏膜的分布情況。

綜上所述，IBS-D患者腸黏膜Th22細胞及其效應(yīng)因子IL-22水平增高，兩者均與IBS-D患者的腸道癥狀密切相關(guān)，且對IBS-D具有較高的診斷效能，這或可為尋找診斷IBS-D的生物學(xué)標記物提供新的思路。