劉 暢， 易兵成， 王先流， 沈炎冰， 秦春萍， 張彥中

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

在全球范圍內(nèi)，每年有成千上萬的患者因嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染或腫瘤等造成大面積骨缺損，這在很大程度上影響了患者的健康和生存質(zhì)量。目前，用于骨移植的材料主要包括自體骨、同種異體骨以及異種骨[1]，由于這些骨移植物均存在局限性和不足，骨組織工程技術(shù)已成為最有潛力的一種解決方案[2]。骨組織工程技術(shù)的基本方法是將生物材料支架作為生長因子和細(xì)胞的載體來誘導(dǎo)成骨, 或從周圍骨組織募集細(xì)胞使其原位生長和分化，最終形成新骨[3]。骨組織是承力組織，力學(xué)刺激對(duì)細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化起著重要作用[4]，因此，通過生物材料支架合理施加和調(diào)節(jié)力學(xué)刺激促進(jìn)骨修復(fù)是骨組織工程支架設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。

形狀記憶聚合物（SMPs）的出現(xiàn)為發(fā)展可原位施加力學(xué)刺激的力學(xué)主動(dòng)式骨組織工程支架提供了新思路[5]。SMPs 是一類能夠在外界刺激下回復(fù)到初始狀態(tài)的智能高分子材料，在回復(fù)過程中材料如果與周圍骨組織接觸，就會(huì)對(duì)骨產(chǎn)生力學(xué)刺激，對(duì)力學(xué)微環(huán)境有很好的仿生效果[6]。此外，SMPs 還具有可實(shí)現(xiàn)保形微創(chuàng)植入[7]、控制藥物釋放速率[8]等優(yōu)點(diǎn)，在發(fā)展多功能組織工程支架方面具有較大的應(yīng)用潛力。但是，SMPs 作為一種形狀記憶材料，與其他形狀記憶材料如形狀記憶合金（SMAs）相比，存在著形狀回復(fù)力較弱的問題（回復(fù)應(yīng)力通常小于5 MPa[9]），且一些常見的生物降解聚酯類SMPs 的生物活性不佳、體內(nèi)降解產(chǎn)物呈酸性容易引起無菌炎癥也是廣受關(guān)注的共性問題[10]。

過去通常采取添加超細(xì)纖維[11]、碳納米管或碳納米纖維[12]、納米黏土[13]、納米碳化硅[14]、炭黑[15]以及其他無機(jī)或有機(jī)填料等方式增強(qiáng)SMPs 的動(dòng)態(tài)、靜態(tài)力學(xué)性能。氧化石墨烯（GO）作為一種二維（2D）納米片材料，不僅具有楊氏模量高和易于表面功能化等特點(diǎn)，而且具有可用于細(xì)胞附著的活性位點(diǎn)、增強(qiáng)細(xì)胞的黏附和增殖[16]等優(yōu)勢，已被用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。賴氨酸（Lys）是一種具有生物活性的堿性氨基酸，其分子結(jié)構(gòu)上含有兩個(gè)氨基（—NH2）和一個(gè)羧基（—COOH），如果將Lys 這種堿性氨基酸和GO 納米增強(qiáng)材料共同引入SMPs，不僅可以增強(qiáng)SMPs 的力學(xué)性能，而且可以中和酸性降解產(chǎn)物、緩解炎癥反應(yīng)和提高SMPs 的生物活性，能為解決一些代表性聚酯類SMPs 的共性問題提供新思路。

乳酸-己內(nèi)酯共聚物（PLCL）是常用的具有形狀記憶特性的組織工程支架構(gòu)建材料[17]。本課題組[18]之前的研究表明，PLCL 基納米纖維膜的形狀記憶轉(zhuǎn)變溫度（即玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg）在38 ℃左右，形狀固定率和形狀回復(fù)率均在96%以上，形狀記憶性能良好?；谝陨媳尘?，本文將經(jīng)Lys 功能化后的GO（Lys-GO）通過電紡絲引入到PLCL 纖維中，形成Lys-GO/PLCL 纖維，并通過一系列的材料表征和生物學(xué)評(píng)價(jià)，研究Lys-GO 對(duì)具形狀記憶效應(yīng)的PLCL 纖維膜的力學(xué)增強(qiáng)和成骨誘導(dǎo)作用。為此，本文首先研究了GO 對(duì)PLCL 纖維膜的力學(xué)增強(qiáng)作用，優(yōu)化GO 的添加量并考察其形狀回復(fù)力；然后探討了Lys-GO 的引入對(duì)所形成的Lys-GO/PLCL 纖維膜的力學(xué)增強(qiáng)和酸性降解產(chǎn)物的中和作用；最后通過體外細(xì)胞增殖、黏附和礦化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了Lys-GO/PLCL 的誘導(dǎo)成骨能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

PLCL:醫(yī)用級(jí)，乳酸與己內(nèi)酯共聚投料物質(zhì)的量之比為90/10，特性黏度為3.6 dL/g，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司；GO:醫(yī)用級(jí)，片徑0.5～5 μm，厚度0.8～1.2 nm，南京先豐納米材料科技有限公司；Lys:醫(yī)用級(jí)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）:氣相色譜級(jí)，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；六氟異丙醇（HFIP）:分析純，上海達(dá)瑞精細(xì)品化學(xué)有限公司；蛋白酶K（比活3.0～15.0 U/mg）:醫(yī)用級(jí)，Sigma 公司；磷酸鹽緩沖劑（PBS）:醫(yī)用級(jí)，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鼠源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）:本實(shí)驗(yàn)室自提；胎牛血清（FBS）:細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，美國Gibco 公司；杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基營養(yǎng)混合物F-12（DMEM/F12）培養(yǎng)液:細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、堿性磷酸酯酶顯色試劑盒:細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶:細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，上海邁基生物有限公司；羅丹明-鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）:細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，美國Invitrogen 公司；4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）:細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，瑞士Roche 公司；堿性磷酸酶測試盒:細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，南京建成生物工程研究所；茜素紅染色液:細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，北京索萊寶科技有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）:細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 測試與表征

掃描電子顯微鏡（SEM）:上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司Phenom XL 型；傅里葉紅外光譜（FT-IR）儀:美國Nicolet 公司NEXUS-670 型；差示掃描量熱（DSC）分析儀:德國耐馳儀器制造有限公司DSC-822 型；X 射線光電子能譜（XPS）儀:日本島津Kratos 公司1/AXIS UltraDLD 型；電子力學(xué)測試機(jī):上海恒馭儀器有限公司HY-940FS 型；數(shù)顯拉力計(jì):中國艾普計(jì)量儀器有限公司SF-5 型；pH 計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司PHSJ-4A 型；酶標(biāo)儀:美國Thermo Fisher Scientific 公司MK3 型；倒置熒光顯微鏡:日本Nikon 公司Nikon TI-S 型。

1.3 GO/PLCL 納米纖維膜的制備及性能表征

在常溫下分別按m（GO）∶m（PLCL）為0，0.5%，1%，2%配制紡絲液。為使GO 均勻分散，首先將GO 置于HFIP 中冰浴超聲90 min，然后加入PLCL 攪拌過夜配成PLCL 質(zhì)量濃度為0.10 g/mL 的紡絲液進(jìn)行電紡絲。PLCL 纖維的紡絲參數(shù)如下:電壓15 kV，注射速率1 mL/h，接收距離15 cm，濕度50%～70%，室溫。GO/PLCL纖維的紡絲參數(shù)為:電壓8～13 kV，接收距離12 cm，其他紡絲條件與PLCL 纖維保持一致。將制備的電紡纖維膜置于真空干燥箱中72 h 以上，以除去殘留溶劑。

通過SEM 觀察各纖維膜的形貌，并用Image J 統(tǒng)計(jì)纖維直徑。采用DSC 進(jìn)行熱分析。采用電子力學(xué)測試機(jī)進(jìn)行拉伸力學(xué)測試。

采用數(shù)顯拉力計(jì)進(jìn)行回復(fù)力測試:先將纖維膜在40 ℃水浴中拉伸30%，0 ℃下固定做塑形處理。然后將纖維膜的一端固定在水浴鍋底部夾子上，另一端固定在數(shù)顯拉力計(jì)上。將樣品固定好后，調(diào)節(jié)數(shù)顯拉力計(jì)的高度至剛好有示數(shù)。隨后在水浴鍋中加入40 ℃的蒸餾水，記錄拉力計(jì)上的數(shù)值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 Lys-GO/PLCL 納米纖維膜的制備及性能表征

1.4.1 Lys 對(duì)GO 的化學(xué)嫁接 參照文獻(xiàn)[19]的方法對(duì)GO 進(jìn)行Lys 化學(xué)嫁接，然后將經(jīng)Lys 接枝的GO 用大量蒸餾水和乙醇離心（3 000 r/min）洗滌3 次，以除去未反應(yīng)的Lys，室溫下自然干燥得到Lys-GO。通過FT-IR 對(duì)Lys-GO 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。采用XPS 檢測Lys-GO 的分峰情況及氮含量。

1.4.2 Lys-GO/PLCL 納米纖維膜的制備與酸度中和作用 Lys-GO/PLCL 納米纖維膜的制備方法同GO/PLCL 膜，m（Lys-GO）∶m（PLCL）=0.5%。對(duì)制備的電紡纖維膜在真空干燥箱中進(jìn)行干燥處理。對(duì)GO/PLCL（0.5/100，質(zhì)量比，下文同）和Lys-GO/PLCL（0.5/100）納米纖維膜進(jìn)行形貌、拉伸力學(xué)、形狀回復(fù)力等表征。

GO/PLCL 和Lys-GO/PLCL 納米纖維膜降解液的pH 測定方法為:將尺寸為50 mm×50 mm 纖維膜樣品放入離心管中；然后用PBS 配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的蛋白酶K 降解液，每管加入5 mL；最后檢測降解0、12、24、36、48、60 h 后降解液的pH。

1.5 Lys-GO/PLCL 納米纖維膜的成骨誘導(dǎo)作用

1.5.1 支架材料的制備及處理 用經(jīng)干燥處理的玻片接收PLCL、GO/PLCL、Lys-GO/PLCL 這3 種電紡納米纖維，并在真空干燥箱中干燥7 d 以上。之后，將覆有納米纖維膜的玻片置于24 孔板中，紫外照射過夜；放入鋼環(huán)，于酒精中浸泡2 h；吸掉酒精，PBS 洗滌3 次；培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)過夜。

1.5.2 細(xì)胞種板 從液氮中取出凍存的rBMSCs（2～4 代），置于37 ℃環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)2 d 后放在培養(yǎng)箱中消化。消化完成后，取樣10 μL 加入計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，每孔按照2×104個(gè)細(xì)胞的種植密度和500 μL 的培養(yǎng)基進(jìn)行種板（24 孔板），每2 d 換液1 次。

1.5.3 體外細(xì)胞相容性 細(xì)胞增殖:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)1、4、7 d 后進(jìn)行檢測（每2 d 換液1 次）。吸掉培養(yǎng)基，加入PBS 清洗3 次，在避光條件下每孔加入400 μL 含10 μL 的CCK-8 培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育4 h 后，每孔取樣100 μL加入到96 孔板中，用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度（OD）。

熒光染色:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)4 d 后進(jìn)行檢測（每2 d 換液1 次）。先吸去培養(yǎng)基，加入PBS 清洗3 次，加入0.04 g/mL 的多聚甲醛固定細(xì)胞，30 min后吸去多聚甲醛，再用PBS 清洗3 次。每孔加入400 μL 的Triton X-100（體積分?jǐn)?shù)0.1%），10 min 后吸除，PBS清洗3 次。避光加入Phalloidin（5 μg/mL），每孔400 μL，染色30 min。然后用PBS 清洗3 次，加入DAPI（1 μg/mL），每孔400 μL，染色15 min 后吸除，PBS 清洗3 次。最后在避光條件下用熒光顯微鏡觀察。

SEM 觀察:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)7 d后進(jìn)行檢測（每2 d 換液1 次）。吸去培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 次。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。吸掉多聚甲醛，用PBS 清洗3 次。將配制好的梯度酒精（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%、70%、80%、90%、95%及100%）加入到24 孔板中進(jìn)行細(xì)胞脫水，最后放在干燥箱中干燥，在SEM 下觀察。

1.5.4 體外成骨性能 堿性磷酸酶（ALP）染色:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)14 d 后進(jìn)行檢測（每2 d 換液1 次）。吸掉培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 次，每孔加入200 μL 0.04 g/mL 的多聚甲醛固定30 min。吸去多聚甲醛，用無菌水洗滌3 次。按照試劑盒說明加入染色工作液（堿性磷酸酯酶顯色緩沖液-氯化硝基四氮唑蘭-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽混合液（體積比為1∶150∶300），在室溫下避光反應(yīng)30 min 后觀察顯色情況，無菌水洗滌3 次，在顯微鏡下觀察。

ALP 定量:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)14 d后進(jìn)行檢測（每2 d 換液1 次）。吸去培養(yǎng)基，用Triton X-100（體積分?jǐn)?shù)1%）進(jìn)行細(xì)胞裂解。30 min 后將裂解液移至離心管中離心5 min（1 000 r/min）。取上清液30 μL 加入96 孔板中，無菌水和標(biāo)準(zhǔn)液作為對(duì)照組。按照堿性磷酸酶試劑盒說明加入緩沖液和基質(zhì)液（每孔50 μL）后，37 ℃下水浴靜置15 min。最后加入150 μL顯色劑，用酶標(biāo)儀檢測520 nm 處的吸光度。

茜素紅（ARS）染色:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)14 d 后進(jìn)行檢測（每2 d 換液1 次）。吸去培養(yǎng)基，加入PBS 清洗3 次，加入體積分?jǐn)?shù)60%的異丙醇（每孔200 μL）固定1 min。吸去異丙醇后用無菌水清洗3 次。每孔加入200 μL 的ARS 染色液，室溫下孵育10 min。吸去染色液，用水洗滌至洗液無色，在顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Origin 8.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用One way ANOVA 進(jìn)行方差分析，評(píng)價(jià)樣品之間是否存在顯著性差異（*P＜0.05 為顯著性差異，**P＜0.01 為極顯著性差異）。

2 結(jié)果與討論

2.1 GO 對(duì)PLCL 形狀記憶纖維膜的力學(xué)增強(qiáng)作用

電紡纖維膜的微納米結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并在植入體內(nèi)后有效促進(jìn)骨再生[20]。本文通過電紡絲技術(shù)分別制備了PLCL、GO/PLCL（0.5/100）、GO/PLCL（1/100）及GO/PLCL（2/100）4 種超細(xì)纖維膜。它們的纖維形貌良好，尺寸均一，纖維細(xì)度為670～750 nm（圖1（a）），但隨著GO 的用量增加，纖維表面出現(xiàn)明顯的GO 團(tuán)聚現(xiàn)象, GO 的不均勻分布對(duì)纖維膜的力學(xué)性能不利。

PLCL 作為一種可降解形狀記憶聚合物，其形狀記憶轉(zhuǎn)變溫度為Tg[21]。GO 用量對(duì)PLCL 纖維膜Tg的影響如圖1（b）所示，純PLCL 納米纖維膜的Tg是40.0 ℃，隨著PLCL 中引入GO 的增加，GO/PLCL 復(fù)合納米纖維膜的Tg分別降為39.6、38.6 ℃和38.1 ℃，GO 的引入使該形狀記憶纖維膜的Tg更接近人體溫度，利于其在體溫下實(shí)現(xiàn)回復(fù)，減少因?yàn)槔猛庠礋岽碳?shí)現(xiàn)形狀回復(fù)時(shí)溫度過高帶來的細(xì)胞損傷[22]。圖1（c，d）的力學(xué)性能曲線表明，與PLCL 膜相比GO/PLCL（0.5/100）的拉伸強(qiáng)度和楊氏模量均有顯著增加。這是因?yàn)樵谳^低的GO 用量下，GO 可以改善其與聚合物基體的界面接觸和相互作用[23]。然而，當(dāng)GO 的用量繼續(xù)增加時(shí)，PLCL 的楊氏模量無明顯變化，但拉伸強(qiáng)度明顯降低。這可能是因?yàn)镚O 的團(tuán)聚產(chǎn)生了應(yīng)力集中點(diǎn)，導(dǎo)致拉伸強(qiáng)度下降。

圖1 納米纖維膜的SEM 照片（a）、DSC 曲線（b）、拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線（c）、拉伸力學(xué)性能（d）及形狀回復(fù)力（e）Fig.1 SEM images （a）, DSC curves （b）, tensile stress-strain curves （c）, tensile properties （d） and shape recovery stress （e） of the nanofiber films

GO 的引入對(duì)PLCL 形狀記憶纖維膜的形狀回復(fù)力影響見圖1（e）所示。同樣，GO/PLCL（0.5/100）纖維膜的形狀回復(fù)力最佳，比PLCL 膜的形狀回復(fù)力提高了28.3%。形狀回復(fù)力由大變小再略微變大，說明回復(fù)力增強(qiáng)效果與GO 的分散性和用量均有關(guān)，其中使GO 獲得良好分散顯得尤為重要。

2.2 Lys-GO 對(duì)PLCL 形狀記憶纖維膜的力學(xué)性能影響和降解產(chǎn)物的酸度中和作用

2.2.1 Lys 對(duì)GO 的化學(xué)嫁接 GO 片層的表面覆蓋有大量含氧官能團(tuán)，如位于石墨烯片基平面上的環(huán)氧基、羥基和連接在片基平面邊緣的羧基[24]。這些反應(yīng)位點(diǎn)適合與氨基或羥基反應(yīng)形成酰胺鍵或酯鍵如圖2（a）所示。FT-IR 分析GO 與Lys 的共價(jià)嫁接情況（圖2（b））表明，在GO 的紅外譜圖中有4 個(gè)特征峰，即在1 035 cm-1處的C―O―C 拉伸振動(dòng)峰，1 610 cm-1處的sp2碳骨架結(jié)構(gòu)中C―C 拉伸振動(dòng)峰，1 724 cm-1處羧基中C―O 的拉伸振動(dòng)峰以及3 425 cm-1處O―H 的拉伸振動(dòng)峰[25]。Lys 在2 923 cm-1和1 575 cm-1處存在―CH2和―COO 基團(tuán)的特征峰。Lys 與GO 嫁接之后，由于酰胺鍵的形成，在1 036 cm-1處形成C―N特征峰，在1 590 cm-1處出現(xiàn)C=O 的寬峰，而3 220 cm-1處的特征峰歸因于N―H 的拉伸振動(dòng)。這些結(jié)果說明Lys 已經(jīng)成功嫁接到GO 上[26]。

對(duì)GO 和Lys-GO 納米片層進(jìn)行XPS 分析的結(jié)果見圖2（c）。可以看到，GO 在285 eV 和534 eV 處出現(xiàn)C1s 和O1s 峰，而Lys-GO 在400 eV 處出現(xiàn)了N1s 峰，表明GO 表面存在氨基，說明GO 與Lys 的確發(fā)生了嫁接[27]。對(duì)GO 和Lys-GO 的碳、氧和氮元素的含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，Lys-GO 的碳氧比是GO 的1.9 倍，這可能是因?yàn)樵诩藿舆^程中―COOH 與―NH2反應(yīng)，形成了酰胺鍵。此外，檢測到Lys-GO 中的氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.12%。

圖2 Lys 與GO 的化學(xué)嫁接示意圖（a），Lys-GO 的紅外光譜圖（b）和XPS 譜圖（c）Fig.2 Schematic of the chemical grafting of Lys to GO （a）, FT-IR （b） and XPS spectra（c） of Lys-GO

2.2.2 Lys-GO/PLCL 復(fù)合納米纖維膜的力學(xué)性能與酸度中和作用 GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 納米纖維膜在室溫（25 ℃）下的拉伸力學(xué)性能見圖3（a，b）。從結(jié)果可以看出，與GO/PLCL 膜相比，Lys-GO/PLCL 膜的拉伸強(qiáng)度和楊氏模量等變化不大（性能保留大于85%），但明顯高于未增強(qiáng)的PLCL 膜（圖1（d））。力學(xué)性能的略微降低可能是因?yàn)長ys 的引入會(huì)破壞納米纖維膜的規(guī)整結(jié)構(gòu)，使纖維膜的結(jié)晶度降低，導(dǎo)致拉伸性能降低。

GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 納米纖維膜在40 ℃水浴中的形狀回復(fù)力測試結(jié)果見圖3（c），兩者的最大回復(fù)力分別為（207.50 ± 28.00） kPa 和（195.00 ± 13.99） kPa，后者的形狀回復(fù)力較前者下降了約6%。

在37 ℃下對(duì)GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 納米纖維膜同時(shí)進(jìn)行60 h 的酶解降解并檢測降解液的pH 變化，結(jié)果見圖3（d）。可以看出，Lys-GO/PLCL 納米纖維膜降解液的pH 高于GO/PLCL 膜的，并維持在5.2 左右，而GO/PLCL 膜降解液的pH 最終維持在4.2 左右。說明Lys-GO/PLCL 膜在降解過程中對(duì)酸性降解產(chǎn)物有一定的中和效果，但仍然偏酸性。

2.3 Lys-GO 對(duì)PLCL 形狀記憶纖維膜成骨分化性能的影響

2.3.1 Lys-GO/PLCL 復(fù)合納米纖維膜的細(xì)胞相容性 rBMSCs 在PLCL、GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 支架上的增殖情況見圖4（a）。從圖中可以看出，rBMSCs 在支架上培養(yǎng)1 d 與4 d 時(shí)，3 組rBMSCs 增殖無顯著性差異；到第7 d 時(shí)rBMSCs 在Lys-GO/PLCL 與PLCL 支架上的增殖有顯著性差異，說明Lys-GO 的引入可促進(jìn)rBMSCs 的增殖。

圖3 納米纖維膜的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線（a），拉伸強(qiáng)度和楊氏模量（b），形狀回復(fù)力（c）以及酸度中和效果檢測（d）Fig.3 Tensile stress-strain curves （a）, tensile strength and Young’s modulus （b）, shape recovery stress （c） and acidity neutralizing effect （d）of the nanofiber films

圖4 rBMSCs 在PLCL、GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 支架上的增殖情況（a）、熒光染色圖（t =4 d）（b）、SEM 照片（t =7 d）（c）、ALP 染色和定量統(tǒng)計(jì)圖（t =14 d）（d）及ARS 染色圖（t =14 d）（e）Fig.4 Proliferation （a）, Fluorescence staining （t =4 d） （b）, SEM images （t =7 d） （c）, ALP staining images and quantitative measurements（t =14 d） （d） and ARS staining （t =14 d） （e） of rBMSCs cultured on the nanofibrous scaffolds

rBMSCs 在染色4 d 的細(xì)胞支架上的鋪展和生長形態(tài)見圖4（b），PLCL 上的rBMSCs 呈團(tuán)聚態(tài)，GO/PLCL上培養(yǎng)的rBMSCs 形態(tài)有所改善，Lys-GO/PLCL 上培養(yǎng)的rBMSCs 黏附性和伸展性最好，出現(xiàn)了形狀良好的肌動(dòng)蛋白和絲狀偽足。細(xì)胞培養(yǎng)7 d 的支架SEM 形貌觀察見圖4（c），rBMSCs 在Lys-GO/PLCL 支架上的鋪展面積明顯大于在PLCL 和GO/PLCL 上的，且rBMSCs 相互交織，這與支架材料中負(fù)載的生物活性成分Lys有關(guān)。這些結(jié)果均說明Lys-GO/PLCL 具有良好的細(xì)胞相容性。

2.3.2 Lys-GO/PLCL 復(fù)合納米纖維膜的成骨分化性能 ALP 是成骨分化的標(biāo)志性蛋白，反映干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的程度[28]。將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 支架上培養(yǎng)14 d，ALP 分泌情況的染色和定量分析結(jié)果見圖4（d）?？梢钥闯?，GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 支架上的ALP 分泌量明顯高于PLCL，其中以Lys-GO/PLCL 上的ALP 分泌量最多，說明Lys-GO 的引入更能促進(jìn)細(xì)胞ALP 的分泌和成骨分化。

鈣沉積是骨生長中的重要環(huán)節(jié)，也是骨細(xì)胞成骨分化的重要標(biāo)志[29]。本文利用ARS 染色定性檢測rBMSCs 在PLCL、GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 這3 種支架上的鈣沉積情況，評(píng)估細(xì)胞在這些支架上的成骨礦化能力。rBMSCs 在3 種支架上培養(yǎng)14 d 的鈣沉積結(jié)果見圖4（e），其結(jié)果與ALP 檢測結(jié)果一致，說明Lys-GO 的加入有利于鈣沉積和成骨誘導(dǎo)。

3 結(jié) 論

（1）采用電紡方法制備了纖維膜狀的GO/PLCL 骨組織工程支架，GO/PLCL（0.5/100）纖維膜形貌良好，直徑在700 nm 左右，Tg為39.6 ℃，更接近于人體溫度，與PLCL 支架相比，其楊氏模量提高了28.4%，形狀回復(fù)力提高了28.3%。

（2）Lys-GO/PLCL 復(fù)合納米纖維膜在基本維持GO/PLCL 纖維膜的力學(xué)性能以及形狀記憶性能的基礎(chǔ)上，可有效解決PLCL 存在的降解酸性問題。

（3）Lys-GO/PLCL 支架更有利于rBMSCs 的增殖、鋪展與成骨分化。