朱嘉瑩， 李 婷， 丁重陽(yáng)， 東為富

（江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

當(dāng)前，微生物引起的許多問(wèn)題威脅著人類健康和生存環(huán)境。細(xì)菌對(duì)材料表面的黏附使薄膜[1]、醫(yī)療設(shè)備[2]、食品和飲料包裝[3]等的應(yīng)用存在極大的被污染隱患。目前常見(jiàn)的制備抗菌材料的主要方法是，在材料表面負(fù)載抗菌劑，常用抗菌劑有:天然抗生素[4]、金屬和氧化物納米顆粒[5,6]、季銨化合物[7]和聚吡啶等[8]。

同有機(jī)抗菌劑相比，無(wú)機(jī)抗菌劑特別是金屬及其氧化物具有抗菌性強(qiáng)、耐高溫、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的金和銀被認(rèn)為是良好的抗菌材料[9]，然而，高成本限制了它們的應(yīng)用。因此，廉價(jià)的金屬無(wú)機(jī)抗菌劑的研發(fā)備受關(guān)注。銅作為一種廉價(jià)抗菌劑已廣泛用于醫(yī)療器械[10]、木材防腐[11]、紡織品[12]等領(lǐng)域。目前銅的抗菌機(jī)理尚存爭(zhēng)議，主流觀點(diǎn)認(rèn)為銅納米粒子（Cu NPs）吸附在細(xì)菌細(xì)胞壁表面破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，還原性的Cu NPs與細(xì)菌相互作用后在細(xì)胞壁的表面釋放活性氧（ROS），逐漸破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且銅釋放出的銅離子也可有效抑制周圍細(xì)菌生長(zhǎng)[13]。盡管Cu NPs 顯示出優(yōu)異的抗菌性能，但是過(guò)量的銅離子亦將對(duì)人類健康構(gòu)成威脅[14]。當(dāng)游離的銅離子進(jìn)入人體后，會(huì)危害器官，特別是肝臟和膽囊；另外，它對(duì)許多水生生物也都有很大的負(fù)面影響。因此，為了減輕銅離子的危害，選擇合適的載體非常重要。此外，Cu NPs 易于聚集的問(wèn)題使其實(shí)際應(yīng)用面臨著巨大挑戰(zhàn)。目前防止Cu NPs 聚集的有效方法是將其沉積在固體多孔材料上，例如SiO2、沸石和碳材料等[15,16]。其中許多多孔材料表面可用多巴胺預(yù)先修飾以達(dá)到對(duì)金屬離子吸附的目的[17,18]。

聚多巴胺（PDA）納米粒子由多巴胺自聚而成，由于PDA 中存在許多功能基團(tuán)，包括鄰醌、鄰苯二酚、氨基、亞氨基等[19]，它可與多種多價(jià)金屬離子結(jié)合，如Fe3+、Ag+、Cu2+等。金屬離子Cu2+經(jīng)過(guò)氧化還原后可與PDA 形成金屬粒子負(fù)載的PDA 復(fù)合微球，其優(yōu)點(diǎn)主要為:（1）PDA 微球易于合成且產(chǎn)率高；（2）PDA 豐富的兒茶酚和氨基可以通過(guò)緊密結(jié)合的方式絡(luò)合Cu NPs；（3）PDA 球表面上Cu NPs 的覆蓋率可控。

本文利用多巴胺結(jié)合金屬離子的能力將銅離子固定在PDA 表面，用水合肼原位還原銅離子，形成樹(shù)莓結(jié)構(gòu)的PDA-Cu NPs，并進(jìn)一步研究了該復(fù)合微球的抗菌性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

鹽酸多巴胺:化學(xué)純，上海阿拉丁試劑有限公司；三水合硝酸銅（Cu（NO3）2·3H2O，化學(xué)純）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，優(yōu)級(jí)純）、水合肼（H6N2O，w=85%，化學(xué)純）:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水。

1.2 測(cè)試與表征

1.2.1 納米粒子的基本結(jié)構(gòu)表征 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）:日本日立株式會(huì)社S-4800 型，將制備的納米粒子置于真空烘箱充分干燥，并固定于電鏡臺(tái)噴金處理進(jìn)行測(cè)試；X 射線衍射（XRD）儀:德國(guó)布魯克AXS有限公司 Bruker D8 型，掃描范圍10°～90°，掃描速率3（°）/min；Zeta 電位及納米粒度分析儀:美國(guó)布魯克海文公司 ZetaPALS 型，測(cè)試溫度為25 ℃；接觸角測(cè)量?jī)x:北京東方德菲儀器有限公司 OCA40 型，將樣品分散在無(wú)水乙醇中并將分散液平鋪于載玻片上，干燥后測(cè)量。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 制備細(xì)菌懸浮液的過(guò)程如下:取50 μL 大腸桿菌（E.coil，ATCC#25922）或表皮葡萄球菌（S.epidermidis，ATCC#12228）的菌原液注入15 mL 的無(wú)菌Luria-Bertani（LB）肉湯中，放入37 ℃的搖床中振蕩培養(yǎng)5 h 后，用無(wú)菌超純水稀釋至105CFU/mL 備用。

1.2.3 PDA-Cu NPs 的抗菌性能測(cè)試 采用搖瓶法測(cè)試納米粒子的抗菌性能[20]。將1 mL 納米粒子的水分散液（5 mg/mL）加入至含有9 mL 菌懸液（105CFU/mL）的燒瓶中。將燒瓶保持在37 ℃的振動(dòng)臺(tái)上20 min 后，取出100 μL 混合懸浮液并稀釋至合適濃度。將每種稀釋液（100 μL）接種到LB 固體培養(yǎng)基上，然后翻轉(zhuǎn)平板在37 ℃恒溫箱中孵育24 h 后統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)。

采用紙片擴(kuò)散法測(cè)試納米粒子的抗菌性能。將無(wú)菌濾紙裁成直徑為6 mm 的圓形，將100 μL 的原菌液涂布在瓊脂板上，隨后放入剪裁好的紙片，將相同濃度不同銅含量的PDA-Cu NPs 分散液滴在紙片上，在37 ℃下孵育24 h 后觀察抑菌圈尺寸。

采用肉湯基稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）。將PDA-Cu NPs 稀釋至250 mg/mL 滅菌備用。取若干試管標(biāo)記為1～7。1 號(hào)試管中加入5 mL 培養(yǎng)基和4 mL 去離子水，其余試管均加入2.5 mL 培養(yǎng)基和2.5 mL 去離子水，滅菌。取1 mL PDA-Cu NPs 稀釋液至1 號(hào)試管中，振蕩分散。然后從1 號(hào)試管中取5 mL溶液至2 號(hào)試管中，重復(fù)上述步驟直至7 號(hào)試管，最后從7 號(hào)試管中取5 mL 棄去。每支試管中接入0.5 mL、105CFU/mL 菌液。對(duì)照組為2.5 mL 培養(yǎng)基和2.5 mL 去離子水，一支加入0.5 mL 去離子水（空白對(duì)照），另一支加入0.5 mL 菌液（陽(yáng)性對(duì)照），37 ℃下培養(yǎng)12 h，試管中溶液開(kāi)始澄清的濃度即為MIC。

從出現(xiàn)澄清溶液的試管中取出100 μL 稀釋液接種到LB 固體培養(yǎng)基上，然后翻轉(zhuǎn)平板在37 ℃恒溫箱中孵育24 h 后統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù)。當(dāng)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)少于5 個(gè)時(shí)，最低的質(zhì)量濃度即為MBC。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 PDA 的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[21]制備PDA。將0.18 g 鹽酸多巴胺溶于90 mL 去離子水中，于50 ℃下充分?jǐn)嚢?，再加?.38 mL、1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，反應(yīng)5 h 后離心數(shù)次，置于60 ℃烘箱中干燥即得到產(chǎn)物PDA。

1.3.2 PDA-Cu NPs 的制備 取已烘干的PDA 顆粒50 mg，配成1 mg/mL 的水溶液，用細(xì)胞粉碎機(jī)使顆粒均勻分散在溶液中，隨后加入150 mg 的PVP，300 mg 的Cu（NO3）2·3H2O，在室溫下攪拌4 h 后轉(zhuǎn)移到60 ℃的油浴鍋中，加入2.1 g 的水合肼，反應(yīng)1 h 后，離心數(shù)次得到PDA-Cu NPs，置于60 ℃烘箱中干燥備用。文中按m（PDA）/m（Cu（NO3）2）=x/y，將產(chǎn)物標(biāo)記為PDA-Cu NPs（x/y），其制備示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 PDA-Cu NPs 的合成示意圖Fig.1 Synthesis of PDA-Cu NPs

2 結(jié)果與討論

2.1 納米粒子的微觀形貌及粒徑

PDA 和PDA-Cu NPs 的微觀形貌如圖2 所示。圖2（a）中，純PDA 表面較為光滑，粒徑為500 nm 左右。據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道，PDA 可以鰲合金屬離子并將其原位還原，但從圖2（b）可以看出，在不添加還原劑水合肼的情況下，PDA 與Cu（NO3）2溶液攪拌24 h 后，只有少量的Cu NPs 被還原，說(shuō)明其自身還原性不足以在表面大量還原Cu NPs。從圖2（c）中可以看出，選用水合肼作為還原劑制備的PDA-Cu NPs（1/4），大量Cu NPs 被還原，其平均直徑約為50 nm，并負(fù)載于PDA 表面。

圖2 （a） PDA，（b） 僅由PDA 還原的PDA-Cu NPs（1/4）和（c）由水合肼還原的PDA-Cu NPs（1/4） 的納米粒子SEM 照片F(xiàn)ig.2 SEM images of （a） PDA, （b） PDA-Cu NPs（1/4） reduced by PDA only and （c） PDA-Cu NPs（1/4） reduced by H6N2O

Cu（NO3）2含量對(duì)Cu NPs 在PDA 上分散均勻性的影響如圖3 所示，從圖3（a，b）中可以看出，當(dāng)m（PDA）∶m（Cu（NO3）2）=1∶2，1∶4 時(shí)，負(fù)載在PDA 表面的Cu NPs 較少，隨著Cu（NO3）2用量的增加，PDA 表面的Cu NPs 增加，且分布較為分散（圖3（c））；繼續(xù)增加Cu（NO3）2的用量，如圖3（d）所示，部分Cu NPs 在PDA 表面出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，會(huì)影響其Cu2+的釋放。

圖3 PDA-Cu NPs 的SEM 照片F(xiàn)ig.3 SEM images of PDA-Cu NPs

還原溫度對(duì)PDA 表面Cu NPs 粒徑的影響如圖4 所示。當(dāng)還原溫度較低時(shí)（20，40 ℃），PDA 表面Cu NPs的粒徑不均一（圖4（a，b））；當(dāng)還原溫度進(jìn)一步升高時(shí)（60 ℃），PDA 表面的Cu NPs 粒徑較均一，約為50 nm（圖4（c，d））。進(jìn)一步升高還原溫度（80 ℃），Cu NPs 粒徑?jīng)]有明顯變化，故選擇60 ℃作為制備PDA-Cu NPs的最佳還原溫度。

圖5 顯示了引入Cu NPs 前后PDA 平均粒徑的變化。PDA 的平均粒徑約為600 nm，PDA-Cu NPs 的平均粒徑為650 nm 左右，顯示了負(fù)載Cu NPs 后PDA 微球平均粒徑的增大。兩者粒徑分布都較寬，同SEM 結(jié)果對(duì)照，納米粒度儀所測(cè)數(shù)值偏大，這是由于部分粒徑的PDA 發(fā)生了團(tuán)聚，這也是粒徑分布較寬的原因，但從圖5（b，b’）和圖5（c，c’）來(lái)看， PDA 以及PDA-Cu NPs 分散液在靜置24 h 后未出現(xiàn)明顯的分層情況，顯示出納米顆粒良好的分散穩(wěn)定性。

2.2 納米粒子的Zeta 電位和XRD 分析

圖4 不同還原溫度下PDA-Cu NPs（1/4）的SEM 照片F(xiàn)ig.4 SEM images of PDA-Cu NPs（1/4） reduced at different temperatures

圖5 （a） PDA 與PDA-Cu NPs 的粒徑分布；（b） PDA 分散后和 （b’）靜置24 h 后的照片；（c） PDA-Cu NPs 分散后和（c’）靜置24 h 后的照片F(xiàn)ig.5 （a） Particle size distribution of PDA and PDA-Cu NPs; Photos of （b） PDA suspension and （b’） PDA suspension after standing 24 h;Photos of （c） PDA-Cu NPs suspension and （c’） PDA-Cu NPs suspension after standing 24 h

表1 為PDA 與PDA-Cu NPs 在水中的Zeta 電位數(shù)據(jù)。純PDA 納米粒子的負(fù)電位（-29.4 mV）是由PDA納米粒子表面帶負(fù)電的羥基引起的。當(dāng)帶負(fù)電位的羥基與金屬離子絡(luò)合還原后，帶正電的Cu NPs 與帶負(fù)電的羥基反應(yīng)，使PDA-Cu NPs 納米粒子的表面電位增加，其電位向正方向移動(dòng)。從表1 中可以看出，隨著Cu（NO3）2含量的增加，PDA-Cu NPs 粒子的表面電位逐漸提高，表明PDA 上Cu NPs 的含量亦隨之增加，與其SEM 分析結(jié)果相互印證。

圖6 為純PDA 與PDA-Cu NPs 的XRD 衍射圖譜。從圖6 中可以看出，PDA 的XRD 圖譜表現(xiàn)出典型的非晶衍射特征，說(shuō)明其為無(wú)定形結(jié)構(gòu)。PDACu NPs 在43°、50°和74°的特征峰分別歸屬于純銅的（111）、（200）和（220）晶面（JCPDS 卡號(hào)04-0836），而純PDA 不具有此類晶面，也說(shuō)明Cu NPs 確實(shí)負(fù)載于PDA 表面。

2.3 接觸角測(cè)試

圖7 展示了PDA 以及PDA-Cu NPs 構(gòu)成表面的潤(rùn)濕狀態(tài)。從圖中可以看出，純PDA 構(gòu)成的表面親水，接觸角為28.9°，這是由于其表面含有大量親水性基團(tuán)。雖然純PDA 與Cu NPs 自身都表現(xiàn)出親水性，但當(dāng)Cu NPs 負(fù)載于PDA 球后，形成的樹(shù)莓狀納米粒子粗糙度提升，PDA-Cu NPs（1/6）的接觸角可達(dá)92.9°，表現(xiàn)為疏水性，PDA-Cu NPs（1/8）的表面接觸角可提高至102.2°。

表1 PDA 和PDA-Cu NPs 的Zeta 電位Table 1 Zeta potential of PDA and PDA-Cu NPs

圖7 PDA 和PDA-Cu NPs 的水接觸角Fig.7 Water contact angles of PDA and PDA-Cu NPs

2.4 納米粒子的抗菌測(cè)試

圖8 顯示了PDA-Cu NPs 對(duì)大腸桿菌和表皮葡萄球菌的抗菌性能。從圖8（a）中可以看出，PDA-Cu NPs（1/2）的抗菌率只達(dá)到約45%，抗菌性能較差；PDA-Cu NPs（1/4）的抗菌率可達(dá)到85%以上，PDA-Cu NPs（1/8）可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的100%殺死，顯示出優(yōu)異的抗菌性能。

圖8 （a） 銅含量對(duì)PDA-Cu NPs 抗菌性能的影響;（b） PDA-Cu NPs 對(duì)大腸桿菌的抑菌圈照片F(xiàn)ig.8 （a） Effect of copper source content on antibacterial properties of PDA-Cu NPs; （b） Inhibition zone picture of PDA-Cu NPs to E.coli

從圖8（a）還可以看出，所制備的納米粒子對(duì)表皮葡萄球菌的抗菌性能要明顯優(yōu)于對(duì)大腸桿菌的，這可能是因?yàn)榕c革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（表皮葡萄球菌）相比，革蘭氏陰性細(xì)菌（大腸桿菌）除了肽聚糖外還具有外膜結(jié)構(gòu)，該外膜可以保護(hù)細(xì)菌免受攻擊。

圖8（b）顯示出不同粒子對(duì)大腸桿菌的抑菌圈大小，從圖中可以看出，PDA-Cu NPs（1/2）和PDA-Cu NPs（1/4）抑菌圈不明顯，PDA-Cu NPs（1/6）則出現(xiàn)明顯的抑菌圈，顯示出較高的抗菌性能，且其抑菌圈直徑大于PDACu NPs（1/8）的，結(jié)合SEM 分析，可能因?yàn)殂~含量較高時(shí)，引起Cu NPs 的團(tuán)聚，從而影響其抗菌性能。

PDA-Cu NPs（1/6）對(duì)表皮葡萄球菌和大腸桿菌的MIC 和MBC 測(cè)試結(jié)果列于表2。從表2 可以看出，PDA-Cu NPs（1/6）對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均具有很高的抗菌活性。PDA-Cu NPs（1/6）對(duì)大腸桿菌的MIC 和MBC 值分別為48.7 μg/mL和195.0 μg/mL，對(duì)表皮葡萄球菌的MIC 和MBC 值分別為39.0 μg/mL 和97.5 μg/mL。

3 結(jié) 論

（1）通過(guò)簡(jiǎn)單調(diào)節(jié)反應(yīng)物投料比以及還原溫度可以實(shí)現(xiàn)Cu NPs 在PDA 上的均勻分散，成功制備一種簡(jiǎn)單高效且價(jià)格低廉的抗菌劑。

（2）得益于Cu NPs 對(duì)表皮葡萄球菌和大腸桿菌優(yōu)異的抗菌性能以及PDA 的生物相容性，此樹(shù)莓狀PDA-Cu NPs 納米粒子在生物醫(yī)療等方面應(yīng)用前景可期。

表2 PDA-Cu NPs（1/6）對(duì)不同細(xì)菌的抗菌效果Table 2 Antibacterial efficency of the synthesized PDA-Cu NPs（1/6）against different bacteria