常鈴雪， 何宏燕， 金莉莉， 劉昌勝

（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海 200237）

隨著組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，模仿細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、制備仿生微結(jié)構(gòu)引起了科研人員的廣泛關(guān)注[1-4]。許多學(xué)者致力于研究植入材料的表面特性與細(xì)胞的相互作用，通過圖案化表面的可控制備，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的形貌、增殖、遷移、分化和基因表達(dá)的調(diào)控[5]。在骨修復(fù)中植入材料表面的微納結(jié)構(gòu)[6]特性（表面紋理、幾何形狀、空間位置和高度）的不同是影響成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)鍵因素之一，可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞向特定譜系進(jìn)行分化，指導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化和作為支撐結(jié)構(gòu)維持新骨的長入[2,7-9]。Chang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)骨間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成骨分化能力在微孔表面上有所提高，微孔表面增強(qiáng)了細(xì)胞的黏著斑和肌動蛋白的結(jié)合能力。Wang 等[11]證實(shí)在深溝槽基底上培養(yǎng)的BMSCs 的成骨分化能力明顯高于淺表面上的成骨分化能力。Dalby等[12]認(rèn)為納米結(jié)構(gòu)（直徑為120 nm）可以誘導(dǎo)人骨間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）在體外產(chǎn)生骨礦物質(zhì)和成骨分化。趙等[13]發(fā)現(xiàn)微孔和納米管相結(jié)合的分級微/拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對BMSCs 成骨分化能力有著顯著的影響。由此可見，微結(jié)構(gòu)采用的基底材料和結(jié)構(gòu)特性在調(diào)控 BMSCs 的生物學(xué)響應(yīng)中尤為重要。然而，這些微結(jié)構(gòu)的基底材料（例如聚二甲基硅氧烷[14]）通常生物活性不足。除了微結(jié)構(gòu)的特性之外，基底材料本身的理化特性對干細(xì)胞的影響也不容忽視。為了更好地調(diào)節(jié)干細(xì)胞的生物學(xué)行為和滿足骨組織修復(fù)的需要，有必要對制備生物活性好、結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)的微陣列結(jié)構(gòu)用于 BMSCs 的生物學(xué)行為進(jìn)行研究。

透明質(zhì)酸（HA）作為細(xì)胞外基質(zhì)的基本成分之一，具有良好的親水性和生物活性，在維持細(xì)胞外微環(huán)境、軟骨修復(fù)、傷口愈合等方面有著廣泛的應(yīng)用[15,16]，尤其是它可以作為藥物的載體以提高藥物的生物利用度。為了得到具有一定機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性的 HA，本文用己二酸二酰肼（ADH）和N′-（乙基亞胺基亞甲基）-N, N-二甲基-1,3-丙二胺（EDCI）與 HA 交聯(lián)成膜。通過調(diào)節(jié)ADH 和EDCI 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（8.3%～16.7%），研究不同配比對薄膜的表觀結(jié)構(gòu)、膨脹系數(shù)、降解行為以及材料相容性的影響。對反應(yīng)體系進(jìn)行配比優(yōu)化后，選取合適的配比和聚二甲基硅氧烷（PDMS）軟光刻技術(shù)進(jìn)行微陣列結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)制備和特性評價。

1 實(shí)驗部分

1.1 原料和試劑

HA:純度97%，麥克林公司；己二酸二酰肼:純度＞99.0%，北京伊諾凱科技公司；EDCI:純度97%，上海泰坦科技公司；PDMS:SKYLARD184，道康寧公司；胎牛血清（FBS）、鷹最小基本培養(yǎng)基（MEM）、無鈣鎂改良MEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）試劑:美國Gibco 公司；大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）:上海斯萊克公司。

1.2 HA 水凝膠的制備

將HA 粉末配成w=0.5% 的HA 水溶液，于4 ℃保存，溶脹1 d 后，將不同量的ADH 緩慢加入HA 溶液，之后加入EDCI 快速攪拌，反應(yīng)中用0.1 mol/L 的鹽酸維持pH≈4.75；反應(yīng)后調(diào)節(jié)體系pH=7.0，將反應(yīng)產(chǎn)物在0.1 mol/L 的NaCl 溶液中透析1 d，接著用超純水透析2 d。提純后液體直接倒入培養(yǎng)皿中，放入37 ℃恒溫箱內(nèi)干燥成膜；將HA 干膜浸泡于PBS 緩沖液中2 h，溶脹平衡后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗中控制HA、ADH 與EDCI 的質(zhì)量比（mHA∶mADH∶mEDCI）分別為10∶1∶1、8∶1∶1、6∶1∶1 和4∶1∶1，相應(yīng)的凝膠樣品分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4。

1.3 HA 薄膜微陣列結(jié)構(gòu)的制備工藝

HA 薄膜 微陣列結(jié)構(gòu)的制備工藝如圖1 所示。首先采用軟光刻技術(shù)制備表面具有微米點(diǎn)陣列的硅片母板，用75%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液超聲清洗干燥后，使用商用SKYLARD184 進(jìn)行軟刻膠工藝對其進(jìn)行復(fù)制，得到與母板互補(bǔ)的微陣列結(jié)構(gòu)；然后將帶有微陣列結(jié)構(gòu)的PDMS 表面進(jìn)行等離子親水處理，使得HA 溶液能夠充分潤濕PDMS 表面的微陣列結(jié)構(gòu)，最后通過溶劑揮發(fā)成膜法得到帶有微陣列結(jié)構(gòu)的HA 薄膜。

圖1 HA 薄膜微陣列結(jié)構(gòu)的制備工藝Fig.1 Preparation process of HA films with well-defined micropatterned surfaces

1.4 HA 薄膜的理化特性表征

傅里葉變換紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）:HA 薄膜在-20 ℃冷凍過夜后進(jìn)行凍干處理，得到海綿結(jié)構(gòu)的HA 材料，取適量HA 與KBr 充分混合研磨后采取壓片制樣，掃描波長4 000～500 cm-1；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司，S-4800 型）:HA 薄膜凍干處理后固定于樣品臺表面，噴金處理后，裁剪成4 mm×4 mm 方塊，用導(dǎo)電膠固定于SEM 樣品臺表面，設(shè)定時間為60 s 進(jìn)行噴金，置于樣品倉，設(shè)置加速電壓為20 kV；恒溫震蕩箱（常州澳華儀器有限公司，SHA-B 型）及電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，F(xiàn)A2104 型）:將HA 薄膜真空干燥稱重（m0），以1∶10 的質(zhì)量比將HA 薄膜浸泡于PBS 緩沖液中，置于37 ℃溫和震蕩（80 r/min）3、7、10、14 d 后，將HA 薄膜真空干燥24 h 后稱重（mi），通過計算得到剩余量（R），R 可用來評價凝膠薄膜的降解行為。

倒置生物顯微鏡（上海長方光學(xué)儀器公司，XSP-17C 型）:選用直徑10 μm、間距為15 μm 的模板制備了4種配方的HA 薄膜，采用倒置生物顯微鏡對HA 凝膠微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并用納米測量技術(shù)對表面微結(jié)構(gòu)尺寸進(jìn)行測量。

1.5 細(xì)胞生物學(xué)性能研究

rBMSCs 細(xì)胞提取培養(yǎng)工藝如下:選用4 周齡、無特定病原體（SPF）級80～100 g 的雄性SD 大鼠（上海杰思捷實(shí)驗動物有限公司），提取股骨和脛骨細(xì)胞。將rBMSCs 添加到FBS（φ=10%）、青霉素/鏈霉素雙抗（φ=1%）的α-MEM 培養(yǎng)基中，接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% （體積分?jǐn)?shù)）CO2、濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

對不同交聯(lián)度的HA 凝膠進(jìn)行生物相容性MTT 檢測，每組設(shè)置3 個平行樣。具體操作步驟如下:選用rBMSC 為細(xì)胞模型，以每孔2×103個的接種密度接種于96 孔板中37 ℃培養(yǎng)24 h 后，加入等量的凝膠樣品（S1～S4）于孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；在1、3、7 d 后，避光條件下每孔加入30 μL MTT 工作液（5 mg/mL），放入37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h；小心吸去孔板中上層溶液，每孔加入100 μL 二甲亞砜（DMSO），37 ℃恒溫震蕩溶解15 min；使用MK3 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）在波長492 nm 下測量其透光率（OD）值。MTT 法也用于評級不同微陣列結(jié)構(gòu)表面對rBMSCs 體外增殖的影響，將HA 薄膜平鋪于48 孔板中，每孔加入1×104個細(xì)胞，30 min 后每孔加入1 mL 培養(yǎng)基。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、7 d 后，進(jìn)行MTT 測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 HA 凝膠的FT-IR 分析

圖2 示出了配比不同的HA 凝膠和未交聯(lián)HA的紅外光譜。如圖所示，相比于未交聯(lián)的HA，交聯(lián)HA 在3 402cm-1處 的―OH 伸 縮 振 動 峰 和1 407、1 618 cm-1處羧酸鹽的強(qiáng)特征吸收峰消失，意味著羧酸官能團(tuán)的消失，即證明了交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生；交聯(lián)樣品在1 610 cm-1處均出現(xiàn)弱吸收峰，說明生成了―CO―NHR?？梢姡褂肁DH 對HA 進(jìn)行交聯(lián)后，HA 中的羥基和羧酸的羰基吸收峰消失，取而代之的是酰胺吸收峰，表明ADH 的氨基與HA 的羧基生成了酰胺，成功實(shí)現(xiàn)了HA 的交聯(lián)；隨著ADH 和EDCI 用量的增加，薄膜中酰胺吸收峰逐漸變強(qiáng)，說明 HA 的交聯(lián)程度增加。

2.2 HA 薄膜的表面形貌

圖3顯示了HA薄膜的表面形貌。當(dāng)mHA∶mADH∶mEDCI為10∶1∶1 時，雖然HA 薄膜表面呈現(xiàn)連續(xù)結(jié)構(gòu)，但表面粗糙不平；隨著ADH 和EDCI 含量的增加，薄膜表面的粗糙程度降低，當(dāng)mHA∶mADH∶mEDCI為4∶1∶1 時，HA 薄膜表面局部區(qū)域較為光滑，但是表面起伏較大。

圖2 HA 凝膠的紅外譜圖Fig.2 FT-IR spectra of HA gels

圖3 不同配比的HA 薄膜的表面形貌Fig.3 SEM images of HA films with different reagent ratios

為了觀察HA 凝膠的內(nèi)部交聯(lián)結(jié)構(gòu)，將透析純化后的溶液直接倒入玻璃培養(yǎng)皿，放入-20 ℃冰箱冷凍12 h，取出再凍干操作24 h 后進(jìn)行表面形貌觀察（圖4）。如圖所示，4 種HA 交聯(lián)凝膠內(nèi)部呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，其形成原因主要在于凍干過程中凝膠內(nèi)部的水分升華。當(dāng)mHA∶mADH∶mEDCI=10∶1∶1 時，樣品的孔徑約為850 μm，孔洞較為松散；隨著ADH 和EDCI 用量的增加，凝膠內(nèi)部的孔洞直徑逐漸變小，孔洞結(jié)構(gòu)越來越緊密；當(dāng)mHA∶mADH∶mEDCI=4∶1∶1 時，相較于其他凝膠，樣品內(nèi)部孔徑最小，橢圓形長徑約為350 μm，孔洞結(jié)構(gòu)最為緊密?？梢?，ADH 和EDCI 用量的增加提高了HA 的交聯(lián)程度，內(nèi)部孔徑變小，結(jié)構(gòu)趨向緊密，這與HA 交聯(lián)薄膜表面的展示結(jié)果相符。材料內(nèi)部的孔徑結(jié)構(gòu)也會影響HA 凝膠薄膜的膨脹特性，為了得到尺寸可控的HA 微陣列結(jié)構(gòu)，非常有必要對薄膜的膨脹特性進(jìn)行評價。

圖4 不同配比的HA 凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的SEM 圖Fig.4 SEM images of internal structures of HA gels with different reagent ratios

綜上所述，隨著ADH 和EDCI 用量的增加，交聯(lián)程度增加，凝膠內(nèi)部孔徑有著逐漸變小的趨勢，結(jié)構(gòu)更加緊密。由此可以推斷，當(dāng)凝膠溶脹平衡后，材料的膨脹程度不同，孔徑較小的HA 薄膜將會有較小的體積膨脹系數(shù)，制成的微陣列結(jié)構(gòu)在溶脹平衡后也沒有明顯的變形和損壞。

2.3 HA 薄膜的降解行為

圖5 示出了HA 薄膜的降解曲線，所有樣品均表現(xiàn)出比較穩(wěn)定的降解速率。隨著ADH 和EDCI 用量的增加，薄膜的交聯(lián)程度增加，材料的孔徑變小，降解速率隨之減慢。14 d 時，mHA∶mADH∶mEDCI為10∶1∶1 的薄膜幾乎全部降解，mHA∶mADH∶mEDCI為4∶1∶1 的薄膜僅降解了約30%。由此可見，通過改變HA 薄膜的交聯(lián)程度可以有效地調(diào)控薄膜的降解行為。

2.4 HA 凝膠的生物相容性評價

實(shí)驗樣品分為5 組，不同配比的HA 凝膠的生物活性示于圖6。隨著ADH 和EDCI 用量的增加，細(xì)胞活性有所降低。雖然各組樣品的細(xì)胞總數(shù)均低于空白對照組（Control），但仍具有較好的細(xì)胞活性，HA 凝膠本身未表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性，故均可用于之后的細(xì)胞實(shí)驗。

圖5 不同配比的HA 薄膜的降解行為Fig.5 Degradation of HA films with different reagent ratios

圖6 不同配比的HA 凝膠的細(xì)胞活性Fig.6 Cell viability of HA gels with different reagent ratios

2.5 表面具有微孔結(jié)構(gòu)的HA 薄膜的制備與評價

硅模板的表面設(shè)計:4 種不同尺寸的微孔結(jié)構(gòu)，孔徑（d）分別為10、30、40、100 μm，相應(yīng)微孔結(jié)構(gòu)的間距（w）分別為15、10、40、20 μm，深度均為20 μm。HA 薄膜表面形貌如圖7 所示。HA 薄膜表面具有與硅片母板表面相同的微孔結(jié)構(gòu)，但由于模板的復(fù)制操作誤差和材料特性，最后制作完成得到的HA 薄膜表面結(jié)構(gòu)可能會發(fā)生變化。由于在制樣過程中，薄膜表面微結(jié)構(gòu)并非肉眼可見，截面脆斷時無法保證斷裂面全部為凹槽直徑部位，所以斷面圖只用來觀測凹槽深度，并不用來測量直徑及凹槽間距。

以圖7（d）圖案為例，比較ADH-HA 干膜表面與硅設(shè)計模板、PDMS 模板的微孔結(jié)構(gòu)差異。硅設(shè)計模板的孔徑為100 μm、間距為20 μm、深度為20 μm，復(fù)制后PDMS 的間距略有減?。?5 μm），孔徑和深度基本維持不變（參見圖8）。HA 干膜的圓柱凹槽直徑和凹槽之間的間距與硅片母板沒有顯著差異，但凹槽深度僅為5 μm。這是因為HA 交聯(lián)溶液具有較大的黏度，用等離子體對PDMS 表面進(jìn)行處理，盡管HA 溶液完全浸入PDMS 表面微結(jié)構(gòu)當(dāng)中，制得的HA 薄膜失水凍干后用于SEM 觀察，凍干制樣過程對其結(jié)構(gòu)有重要的影響，尤其是厚度方向，因此，HA 干膜的凹槽深度僅為5 μm 左右。

HA 干膜溶脹后，不同交聯(lián)程度的HA 薄膜的表觀形貌和溶脹系數(shù)如圖9 所示，所用的PDMS 子板圖案為孔徑10 μm、間距15 μm。如圖9（a）所示，HA 干膜的孔徑約為10 μm，隨著ADH 與EDCI 含量的減少，溶脹后微孔的直徑逐漸增大，S4、S3、S2 的孔徑分別為32、40、50 μm，S1 甚至變形到在顯微鏡下幾乎觀測不到微孔結(jié)構(gòu)。圖9（b）中的相對直徑比更為直觀地證實(shí)了交聯(lián)劑含量對HA 薄膜溶脹特性的影響規(guī)律:交聯(lián)劑含量越少，交聯(lián)程度越小，微孔的變形越大，HA 凝膠的膨脹系數(shù)越大。為了構(gòu)建變形小的微米圖案，選用S4 用于不同微孔結(jié)構(gòu)的制備。

圖7 HA 薄膜表面的不同尺寸微孔結(jié)構(gòu)的SEM 圖:（a）孔徑30 μm、間距10 μm，（b）孔徑40 μm、間距40 μm，（c）孔徑10 μm、間距15 μm，（d）孔徑100 μm、間距20 μm，（e）c 圖案的截面圖，（f）d 圖案的斷面圖Fig.7 SEM images of microwells structure on HA films with different dimensions: （a） d=30 μm、w=10 μm, （b） d=40 μm、w=40 μm,（c） d=10 μm、w=15 μm, （d） d=100 μm、w=20 μm, （e） & （f） are section structures of （c） & （d）

圖8 PDMS 微結(jié)構(gòu)的SEM 圖片F(xiàn)ig.8 SEM images of PDMS microstructures

2.6 HA 薄膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對細(xì)胞增殖的影響

為了研究表面微結(jié)構(gòu)尺寸和圖案對成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，選取了尺寸不同、圖案密度不同的4組樣品（樣品 A: 孔徑96 μm、間距32 μm；樣品 B: 孔徑128 μm、間距128 μm；樣品 C: 孔徑32 μm、間距48 μm；樣品 D: 孔徑320 μm、間距64 μm）進(jìn)行研究，以未圖案化的HA 平膜（Flat）作為參比樣品，選用rBMSC 為細(xì)胞模型，通過MTT 法對細(xì)胞活性進(jìn)行了測定（圖10）。

MTT 實(shí)驗結(jié)果表明，各組微結(jié)構(gòu)材料表面的細(xì)胞總數(shù)均不低于對照組。與未圖案化的HA 薄膜表面相比，隨著凹槽直徑的減小，細(xì)胞增殖能力呈現(xiàn)上升趨勢。小尺寸HA 薄膜（樣品 C）表面細(xì)胞活性最大，說明小尺度的凹槽結(jié)構(gòu)對細(xì)胞增殖有著顯著的促進(jìn)作用。令人意外的是，具有較大微米尺寸的樣品 B 相比于樣品A，也有著較好地促進(jìn)細(xì)胞增殖能力，這可能與rBMSCs細(xì)胞鋪展后的直徑有關(guān)（一般為120 μm 左右），與樣品B 的微圖案直徑相近。

2.7 ADH-HA 微結(jié)構(gòu)表面的骨誘導(dǎo)性堿性磷酸酶（ALP）活性比較

本實(shí)驗測定rBMSC 在一系列不同微結(jié)構(gòu)ADH-HA 薄膜上的ALP 活性，以評價微結(jié)構(gòu)對成骨誘導(dǎo)能力的影響。

圖9 HA 薄膜在PBS 溶液中（a）溶脹結(jié)構(gòu)觀察和（b）溶脹系數(shù)Fig.9 Swelling properties of HA films with well-defined microstructure （a） observed by microscopy and （b） swelling coefficient

如圖11 所示，使用總蛋白量進(jìn)行均一化后，不同天數(shù)各組薄膜上的細(xì)胞ALP 活性趨勢大致相近。與未圖案化的 HA 薄膜相比，隨著圓形凹槽直徑的減小，細(xì)胞ALP 活性水平逐漸上升。rBMSCs 在小微米結(jié)構(gòu)（d=32 μm）ADH-HA 薄膜上有著更高的成骨ALP 活性；其他3 組微米結(jié)構(gòu)表面的rBMSCs 的成骨活性略有提高。

圖10 微陣列結(jié)構(gòu)對rBMSCs 細(xì)胞活性的影響:（A）孔徑96 μm、間距32 μm；（B）孔徑128 μm、間距128 μm；（C）孔 徑32 μm、間 距48 μm；（D）孔 徑320 μm、間 距64 μmFig.10 Effect of cell viability of rBMSCs on the microstructures with different dimensions: （A） d=96 μm、w=32 μm; （B）d=128 μm、w=128 μm; （C） d=32 μm、w=48 μm; （D）d=320 μm、w=64 μm

圖11 微陣列結(jié)構(gòu)對rBMSCs 的ALP 活性影響:（A）孔徑96 μm、間距32 μm；（B）孔徑128 μm、間距128 μm；（C）孔徑32 μm、間距48 μm；（D）孔徑320 μm、間距64 μmFig.11 Effect of ALP activities of rBMSCs cultured on different microstructure systems: （A） d=96 μm、w=32 μm; （B）d=128 μm、w=128 μm; （C） d=32 μm、w=48 μm; （D）d=320 μm、w=64 μm

3 結(jié) 論

（1）選用可降解高分子HA 作為基底材料，采用交聯(lián)劑ADH 和EDCI 成功地交聯(lián)成膜。

（2）利用PDMS 軟刻膠技術(shù)和溶劑揮發(fā)法制備了表面具有微陣列結(jié)構(gòu)的HA 凝膠薄膜，微陣列結(jié)構(gòu)完整、均勻，微米結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)、可控。

（3）與平滑的HA 薄膜相比，尺寸較大的微米圖案對細(xì)胞的增殖沒有顯著影響，而尺寸較小的微米結(jié)構(gòu)（d=32 μm）可以明顯促進(jìn)rBMSCs 的增殖。

（4）與其他尺寸圖案相比，rBMSCs 在小微米結(jié)構(gòu)（d=32 μm）ADH-HA 薄膜上具有更高的成骨ALP 活性。

（5）材料的仿生特征和優(yōu)異的理化性質(zhì)在刺激細(xì)胞行為和引導(dǎo)組織再生方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，然而，表面微結(jié)構(gòu)形貌引導(dǎo)的骨間充質(zhì)干細(xì)胞分化的潛在機(jī)制仍不夠明確，材料特性/微陣列結(jié)構(gòu)與細(xì)胞生物學(xué)的關(guān)系尚需進(jìn)一步探索。