雷亞利, 潘沛錦, 鄭焱, 陳慶利, 隋洪△

1東莞康華醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東東莞 523000)； 2凱普生物科技股份有限公司(廣東東莞 510700)

耳聾是一個重大的全球公共衛(wèi)生問題，也是最常見的出生缺陷之一[1]。在世界范圍內(nèi), 每1 000名新生兒中就有1名先天性重度或極重度聽力喪失患兒，其中50%患兒的致病因素與遺傳相關(guān)[1-3]。聽力障礙已成為我國第二大出生缺陷疾病[4]。根據(jù)2008年的調(diào)查結(jié)果，每年約有3萬聽障兒童出生，若加上遲發(fā)性及藥物性耳聾患者，每年新增的聽障兒童超過6萬[5]。其中，由遺傳因素導(dǎo)致的耳聾占比最高，約為60%，環(huán)境與遺傳因素綜合導(dǎo)致的病例約占20%[6-8]。遺傳性耳聾又分為綜合征性與非綜合征性。非綜合征性耳聾即表現(xiàn)為單純的聽力缺失，最常見的是感音神經(jīng)性耳聾，約占70%[4]。盡管目前感音神經(jīng)性耳聾尚無有效的治療方法，但人工耳蝸植入術(shù)可在很大程度上改善此類型患者的聽力狀況。因此，明確病因、及早干預(yù)是降低非綜合征性耳聾，特別是預(yù)防語前聾和由聾致啞的有效途徑。目前，耳聾的篩查主要是基于物理學(xué)技術(shù)的聽力篩查的方法。近年來隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，利用耳聾易感基因檢測聯(lián)合聽力篩查進(jìn)行耳聾的篩查與輔助診斷在臨床實(shí)踐中逐漸發(fā)展成為一項(xiàng)普遍使用的有效方法。但是目前，聯(lián)合篩查在東莞地區(qū)的應(yīng)用情況尚缺乏相關(guān)報道?；诖?，本研究通過對東莞地區(qū)4 558例新生兒聽力篩查與聾病易感基因聯(lián)合篩查結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，探討常見聾病易感基因突變位點(diǎn)在東莞地區(qū)新生兒分布情況并探索聯(lián)合篩查對本地區(qū)耳聾防治的意義。

1 資料與方法

1.1 患者選擇 2017年1—12月在東莞康華醫(yī)院出生并來門診就診，無聾病家族病史，并經(jīng)新生兒家屬知情同意，自愿接受新生兒聾病易感基因檢測的新生兒，共計4 558例。

1.2 聽力篩查 新生兒出生72 h與42 d后，在自然睡眠或安靜的狀態(tài)下，對雙耳分別進(jìn)行瞬態(tài)聲誘發(fā)耳聲發(fā)射(transiently evoked otoacoustic emission, TEOAE)檢測耳蝸外毛細(xì)胞功能；聽覺腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)檢查腦干聽通路的神經(jīng)傳導(dǎo)功能。聽力初篩未通過者于出生42 d實(shí)施復(fù)查，仍未通過者于出生3個月后接受聽力學(xué)診斷。

1.3 聾病易感基因篩查 在新生兒出生72 h內(nèi)，采集新生兒足跟血或臍帶血，滴制干血片。采用廣東凱普生物科技有限股份公司的導(dǎo)流雜交技術(shù)(flow-through hybridization)以及耳聾易感基因檢測試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法)對常見聾病基因進(jìn)行檢測，包括4個聾病基因的21個熱點(diǎn)突變位點(diǎn)：GJB2基因35delG、167delT、235delC、176-191del16、299-300delAT和512insAACG；SLC26A4基因281C>T、589G>A、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G、IVS7-2A>G和IVS15+5G>A；12SrRNA基因1494C>T和1555A>G；及GJB3基因538C>T和547G>A。

1.4 隨訪 對象為(1)聽力篩查TEOAE或ABR未通過者；(2)基因篩查結(jié)果陽性者，包括單個或多個致病突變攜帶者。符合上述條件至少一條者即為隨訪對象。隨訪方法為定期召回檢查，對不能按期檢查者進(jìn)行電話隨訪。隨訪內(nèi)容主要為新生兒姓名及性別、隨訪對象身份、監(jiān)護(hù)人等基本信息，兒童聽力情況、監(jiān)護(hù)人對耳聾基因篩查結(jié)果的了解程度、是否就診、是否有耳聾家族史等，并進(jìn)行簡單宣教。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用頻數(shù)和百分比對計數(shù)資料進(jìn)行描述，兩種篩查結(jié)果之間率的比較采用2檢驗(yàn)。應(yīng)用IBM SPSS Statistics v19 統(tǒng)計軟件，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聾病易感基因篩查結(jié)果 4 558例新生兒中檢出聾病基因突變161例，總的突變攜帶率為3.53%。其中男87例，占54.04%，女74例，占45.96%，男女之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。單基因單雜合突變159例，其中GJB2基因突變80例(1.77%)，SLC26A4基因突變59例(1.29%)，12SrRNA基因突變7例(0.15%)，GJB3基因突變13例(0.29%)。單基因復(fù)合雜合突變1例，雙基因復(fù)合雜合突變1例。檢測覆蓋范圍為21個突變位點(diǎn)，其中檢出突變位點(diǎn)15個，檢出率最高的是GJB2的235delC突變位點(diǎn)，檢出67例(67/161, 41.6%)，其次是SLC26A4基因的IVS7-2A>G位點(diǎn)，檢出42例(45/161,26.1%)。部分檢測膜條見圖1，分布情況見圖2。

注：A：正常標(biāo)本結(jié)果；B：IVS7-2A>G雜合突變型；C：299-300delAT雜合突變型；D：235delC與IVS7-2A>G雙雜合突變型；E：235delC雜合突變型；F：176-191del16雜合突變型；G：2168A>G雜合突變型；H：538C>T雜合突變型圖1 部分導(dǎo)流雜交檢測膜條圖譜

注：A：單獨(dú)使用聽力進(jìn)行新生兒耳聾篩查的結(jié)果分布情況；B：單獨(dú)使用耳聾基因檢測進(jìn)行新生兒耳聾篩查的結(jié)果分布情況圖2 單獨(dú)使用聽力或耳聾基因檢測進(jìn)行新生兒耳聾篩查的結(jié)果分布情況

2.2 聽力篩查結(jié)果 在4 558例新生兒中，有4 139例新生兒通過聽力篩查，419例未通過。左耳未通過占比最高，為39.4%，其次為右耳，占33.2%，雙耳不通過率為27.4%。

2.3 聽力篩查與聾病易感基因聯(lián)合篩查結(jié)果 4 558例新生兒中，161例檢測出易感基因陽性，其中，13例同時聽力篩查不通過(圖3-A)，其中超過50%人數(shù)為GJB2突變，其次為SLC26A4突變(表1)。

表1 聾病易感基因陽性患兒通過聽力篩查的情況分布 例(%)

在物理聽力技術(shù)進(jìn)行聽力篩查檢測中，4 139例新生兒通過聽力篩查，419例未通過，未通過率為9.19%。在419例未通過患者中，406例聾病易感基因篩查正常，13例聾病易感基因篩查異常(圖3-B)。采用聽力篩查和聾病易感基因陽性篩查的情況分布情況顯示聽力篩查和聾病易感基因篩查結(jié)果存在不一致性。

注：A：161例耳聾易感基因篩查陽性中，聽力篩查不通過13例；B：419例聽力篩查不通過中，耳聾易感基因陽性13例圖3 聽力篩查與耳聾易感基因聯(lián)合篩查情況分布

2.4 隨訪情況 進(jìn)一步對161例耳聾易感基因篩查陽性新生兒進(jìn)行隨訪，失訪6人，共計156例接受隨訪，隨訪率96.89%。隨訪結(jié)果顯示1例GJB2基因235delC+299-300delAT雙重雜合新生兒3次聽力篩查未通過；1例235delC+IVS7-2A>G雙重雜合新生兒隨訪結(jié)果顯示聽力正常。

3 討論

聾病指的是聽覺障礙，表現(xiàn)為不能聽到外界的聲響。根據(jù)WHO分級標(biāo)準(zhǔn)，聾病可分為4型，分別是輕度、中度、重度和全聾[1]。傳統(tǒng)的新生兒聽力篩查手段可篩查出大部分先天性中度以上的聾病患兒，但對中度以下聽力的下降，漸進(jìn)性或遲發(fā)性或藥物性發(fā)病的聾病患兒會出現(xiàn)漏診[2]，而聾病基因的篩查可以彌補(bǔ)聽力篩查的缺陷，有利于對攜帶者做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)，盡可能避免聾而致啞。同時對攜帶聾病基因但聽力正常者，對其將來的婚配、生育進(jìn)行遺傳優(yōu)生指導(dǎo)，盡可能避免生育遺傳性聾病嬰兒[5-7]。

本調(diào)查結(jié)果顯示在東莞地區(qū)4 558例新生兒中檢出常見聾病基因突變161例，總的突變攜帶率為3.53%。這一攜帶率與其他地區(qū)報道的新生兒常見基因的突變率接近。其中，潘麗等[8]對珠海地區(qū)9 775例新生兒進(jìn)行4個基因GJB2、SLC26A4、12SrRNA、GJB3的20個位點(diǎn)篩查，攜帶率為4.2%。唐燕青等[9]對廣西地區(qū)21 386例新生兒常見的4個聾病基因攜帶率2.67%。劉光明等[4]對中國最常見的4個聾病基因的9個致聾突變點(diǎn)進(jìn)行檢測，3 112例新生兒的攜帶率為3.56%。Zhang等[10]對甘肅地區(qū)10 043例新生兒進(jìn)行聾病基因檢測，攜帶率為2.29%。在中國，GJB2、SLC26A4、12SrRNA與GJB3 4個基因突變引起的聾病約占遺傳性聾的80%[9]。因此，在新生兒中開展這4個常見的聾病基因的21個已知較為高頻的突變位點(diǎn)的檢測具有重要的流行病學(xué)意義。其中，GJB2基因是最為常見的聾病易感基因[9]。該基因突變主要表現(xiàn)為先天性聾病，屬于隱性遺傳。在我們的研究中，東莞地區(qū)新生兒中GJB2雜合突變頻率最高，占陽性標(biāo)本的50.3%。聽力及易感基因聯(lián)合篩查顯示13例聽力及基因檢測皆不通過新生兒中，有7例為GJB2突變陽性新生兒。這一結(jié)果提示GJB2基因是東莞地區(qū)最為常見的聾病易感基因。在GJB2基因中存在多個耳聾易感位點(diǎn)，其中，235delC位點(diǎn)突變在亞洲人群[11-12]中約占80%。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)235delC雜合突變占GJB2陽性標(biāo)本的83.75%。同時，我們注意到1例235delC+299-300delAT復(fù)合雜合突變未能通過聽力篩查，提示同一基因上的多雜合會可能產(chǎn)生疊加效應(yīng)[13]，在未來的研究中，我們將進(jìn)一步探索GJB2復(fù)合雜合突變與遺傳性耳聾的相關(guān)關(guān)系。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一些易感基因攜帶者通過了物理聽力篩查。盡管這一新生兒群體短期的隨訪顯示聽力正常，但仍需謹(jǐn)慎觀察新生兒遠(yuǎn)期非遺傳性耳聾如遲發(fā)性和藥物性耳聾的發(fā)病風(fēng)險。SLC26A4基因也稱為 “一巴掌致聾基因”[11-12, 14]，SLC26A4基因突變是典型的遲發(fā)型耳聾，患者主要的臨床表現(xiàn)為大前庭導(dǎo)水管綜合征聾病[15]，因此，該基因雜合突變的攜帶者應(yīng)每隔半年進(jìn)行一次聽力檢測。本調(diào)查中SLC26A4單基因突變59例，其中最主要的突變是IVS7-2A>G雜合突變。聯(lián)合聽力篩查的結(jié)果顯示，有4例初篩聽力未通過，盡管后期的回訪中均恢復(fù)正常，但是該群體仍是遲發(fā)型耳聾易感人群，這一新生兒群體在成長過程中一定要避免頭部劇烈運(yùn)動或接觸巨大的聲響，有條件者應(yīng)定期檢查進(jìn)行顱內(nèi)CT檢查以確定大前庭導(dǎo)水管狀態(tài)[15]。12SrRNA突變?yōu)槟赶颠z傳，該基因攜帶者對氨基糖苷類藥物(如慶大霉素、鏈霉素等)敏感，尚無有效治療方法，只能及早發(fā)現(xiàn)并終生禁止藥物暴露[16-18]。本調(diào)查中僅有7例，占總陽性標(biāo)本的4.3%，其中1例在聽力篩查中未通過，但該新生兒在回訪調(diào)查中恢復(fù)正常。對檢出這一突變的新生兒攜帶者，其家系當(dāng)中的所有母系成員均應(yīng)終生禁止使用氨基糖苷類藥物。GJB3基因是由我國本土克隆和鑒定的第一個遺傳致病基因，該基因的主要特點(diǎn)引起遲發(fā)型聾病，患者青年時期之前聽力正常，到青壯期時，聽力會逐漸下降，直到發(fā)生重度聾病，該基因突變的致聾機(jī)制被認(rèn)為與高頻聽力下降有關(guān)[16, 19]。盡管在本次調(diào)查13例出現(xiàn)GJB3基因突變的患兒在隨訪研究中聽力篩查均通過，但仍需高度警惕[20-22]。臨床上應(yīng)該提醒該基因突變攜帶者應(yīng)定期進(jìn)行聽力測試，一旦出現(xiàn)聽力下降，應(yīng)及時就醫(yī)。同時，上述易感群體應(yīng)并保持隨訪至成年，以便達(dá)到盡早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)的目的。

耳聾基因與聽力聯(lián)合篩查在其他的研究中已經(jīng)被證明有利于提高聽力障礙新生兒的檢出率并及早提出預(yù)防方案。姚聰?shù)萚23]對武漢市117 930新生兒進(jìn)行耳聾基因與聽力聯(lián)合篩查發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合篩查可以有效地提高聽力障礙及高危兒的檢出率。郭雅琪等[24]對寧夏地區(qū)NICU新生兒進(jìn)行聯(lián)合篩查發(fā)現(xiàn)，通過物理學(xué)聽力技術(shù)和易感基因檢測技術(shù)的聯(lián)合篩查，可以彌補(bǔ)不同技術(shù)的局限性，提高新生兒聽力障礙的檢出能力。本研究中通過對149例聾病易感基因篩查未通過而聽力篩查通過的新生兒進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)了1例GJB2基因235delC+299-300delAT雙重雜合新生兒，3次隨訪聽力篩查均未通過，由此提示聽力篩查和易感基因檢測篩查結(jié)果具有不對稱性，而聯(lián)合使用二者進(jìn)行聽力篩查，可以突破不同技術(shù)的局限性，提高新生兒聽力障礙的檢出能力進(jìn)而有可能使?jié)撛诨颊邔?shí)現(xiàn)早預(yù)防遲發(fā)性聽力損傷的發(fā)生。

綜上所述，GJB2基因是東莞地區(qū)最為常見的聾病易感基因。聽力不通過新生兒中GJB2和SLC26A4突變占主要地位。聽力篩查可用于新生兒早期聽力損傷的篩查，基因檢測對于遲發(fā)性聾病和藥物性聾病的高危兒具有指導(dǎo)價值，有助于篩選、診斷和幫助遺傳性非綜合征性的耳聾人群，從而降低聾病的發(fā)生和危害。