馮潤荷， 張璽， 魏潔， 張引國

1天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理學(xué)教研室(天津 300222)； 2溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院(浙江溫州 325035)； 3天津市公安局安康醫(yī)院精神科(天津 300240)； 4武警后勤學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室(天津 300309)

丙烯酰胺(acrylamide，ACR)是一種在工業(yè)領(lǐng)域內(nèi)有廣泛應(yīng)用的化工原料，是一種公認(rèn)的神經(jīng)毒物和人類可能致癌物[1-2]。ACR除職業(yè)接觸外，近年來發(fā)現(xiàn)在某些食品(如高溫烹調(diào)的富含淀粉的食物)[3]和香煙中也含一定量的ACR單體，某些經(jīng)過市政處理的飲用水中也含有微量的ACR單體，因此引起廣泛的社會關(guān)注。ACR有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性，主要為感覺-運(yùn)動型周圍神經(jīng)病[4]和中樞神經(jīng)病變[5-6]。感覺障礙表現(xiàn)為深反射減弱或消失、共濟(jì)失調(diào)、手足套襪型感覺障礙，肢端振動覺/位置覺減退等。運(yùn)動障礙表現(xiàn)為肌肉無力、共濟(jì)失調(diào)、腱反射的減退、肌肉張力常有不同程度的減退，甚至發(fā)生進(jìn)行性肌萎縮和癱瘓。ACR導(dǎo)致的感覺-運(yùn)動型周圍神經(jīng)病，其病理主要涉及周圍神經(jīng)軸索變性，繼發(fā)性的髓鞘脫失，最后進(jìn)入華勒變性，發(fā)生機(jī)制可能與細(xì)胞骨架蛋白的損害有關(guān)[7-8]。ACR導(dǎo)致的中樞神經(jīng)病變突出表現(xiàn)在不同程度的意識障礙、精神癥狀和小腦共濟(jì)失調(diào)，可能與突觸前遞質(zhì)的釋放減少及能量代謝障礙等有關(guān)[9]。ACR對機(jī)體的危害是很嚴(yán)重的，且無特效藥，早期診斷并促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)是治療本病的關(guān)鍵。H反射是一種電刺激誘發(fā)的脊髓反射，可反映脊髓單突觸牽張反射的興奮性、反射通路的完整性和可塑性及感覺-運(yùn)動功能狀態(tài)，被認(rèn)為是臨床上檢測神經(jīng)肌肉功能狀態(tài)、運(yùn)動損傷與恢復(fù)及評價藥物康復(fù)治療效果等的一個早期敏感指標(biāo)[10-11]。H反射的條件易于控制，而且在體內(nèi)多種肌肉上均能誘發(fā)出，這些特點(diǎn)也促使其在神經(jīng)科學(xué)上的廣泛應(yīng)用。2018年3月至2019年9月，本研究觀察了大鼠ACR不同染毒時間后其后肢H反射指標(biāo)的變化，以期從脊髓反射的角度分析ACR中毒的機(jī)制，以進(jìn)一步為ACR中毒的早期診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及處理 健康成年雄性SD大鼠64只，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。所有動物喂養(yǎng)過程中室溫適宜[(20±2)℃]，濕度適宜，自由飲水取食。適應(yīng)1周后將動物隨機(jī)分為對照組和染毒組，每組各32只動物。再隨機(jī)將每組各分為0、3、6和9 d亞組，共8個亞組，每個亞組8只動物。

1.2 給藥方法及步態(tài)評分 染毒組以50 mg/kg的劑量腹腔注射ACR溶液[12]，1次/d，對照組同種方式注射生理鹽水。染毒的第0、3、6和9天測取大鼠體重和評定步態(tài)分值。步態(tài)評分方法如下。將大鼠于空曠干凈的地面上，使其自主活動，觀察3 min。評分標(biāo)準(zhǔn)如下，1分：正常步態(tài)；2分：輕微異常步態(tài)(輕微共濟(jì)失調(diào)，步態(tài)比較吃力，出現(xiàn)足外張)；3分：中度異常步態(tài)(有明顯的共濟(jì)失調(diào)，出現(xiàn)足外展或移動時肘外展)；4分：重度異常步態(tài)(出現(xiàn)足外展，整個身體無力支撐)[13]。

1.3 主要試劑與儀器 ACR純度>99%(美國Genview公司)；RM6240生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由成都儀器廠生產(chǎn)。

1.4 H反射的測定 按30 mg/kg劑量，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉作動物麻醉。實(shí)驗(yàn)大鼠俯臥位固定，以大鼠腘窩處作2～3 cm縱行切口，鈍性分離股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)及其分支，然后向下分離出脛神經(jīng)，以雙極鉤狀銀絲電極(直徑0.6 mm)，作為刺激電極直接置于脛神經(jīng)上，將記錄電極插入大鼠后肢骨間肌(拇趾與食趾之間)[14]，參考電極插入其遠(yuǎn)端1 cm處皮膚作為輔極，同時將接地電極固定于鼠尾。時間常數(shù)0.01 s，高頻濾波10 kHz。應(yīng)用RM6240生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄 H反射程序參數(shù)如下，以波寬0.2 ms的方波刺激，刺激強(qiáng)度從0開始逐漸增大。各組分別于腹腔注射的第0、3、6和9天測量體重及步態(tài)評分，并同步檢測H反射的變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用LSD最小顯著差法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對照3 d亞組、染毒9 d亞組大鼠毛色光滑，情緒穩(wěn)定，活動自如。而染毒組先后出現(xiàn)煩躁、激惹、被毛雜亂、活動減少、倦怠、震顫和搖擺。

2.2 大鼠的體重和步態(tài) 對照組體重從第0～9天穩(wěn)定地增長，而染毒組體重從染毒第0～6天增長緩慢，且在染毒第9天體重不增反降。染毒組從染毒的第6天體重就開始下降，持續(xù)到染毒的第9天。步態(tài)結(jié)果顯示染毒大鼠在染毒的第3天開始出現(xiàn)行走稍微不協(xié)調(diào)，雙后足間距輕微加寬，染毒到6 d開始出現(xiàn)身體震顫，出現(xiàn)足外展，能夠向前移動，染毒第9天后肢出現(xiàn)癱瘓，勉強(qiáng)向前移動時雙后肢拖地，甚至不能支撐整個身體，而對照組大鼠步態(tài)一直穩(wěn)定。見表1。

表1 大鼠不同時間的體重變化及步態(tài)評分

2.3 H反射的誘導(dǎo)及H反射的特征 所有大鼠在一定的強(qiáng)度下均能誘發(fā)出H反射。對于對照組而言，在最低刺激強(qiáng)度下首先出現(xiàn)H波，隨著刺激強(qiáng)度的增大，M波才出現(xiàn)，即H波誘發(fā)的閾值低于M波誘發(fā)的閾值。另外，刺激強(qiáng)度由小到大時，M波幅度由小到大，而H波幅度由小到大再到小。對于染毒組而言，在染毒的第3天，H波和M 波誘發(fā)出現(xiàn)的順序與對照組相同。在染毒的第6天組，有3只動物先誘發(fā)出M波后誘發(fā)出H波，即部分H波誘發(fā)的閾值高于M波誘發(fā)的閾值。在染毒9 d組，所有動物在最低刺激強(qiáng)度下先誘發(fā)出M波，隨著刺激強(qiáng)度的增大，再誘發(fā)出H波，即H波誘發(fā)的閾值均高于M波誘發(fā)的閾值，呈現(xiàn)H波和M波誘發(fā)出現(xiàn)的順序的完全顛倒(圖1)。

注：A：對照組；B：染毒組；右側(cè)的數(shù)據(jù)為實(shí)際誘發(fā)的電流強(qiáng)度圖1 兩組第9天從大鼠后肢骨間肌誘導(dǎo)的典型H反射圖

在染毒的第3天，H波閾值明顯增高(P<0.05)，但H波潛伏期、Hmax、M 波閾值與潛伏期及Mmax與對照組第3天比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在染毒第6天，H波閾值明顯繼續(xù)增高(P<0.01)，同時Hmax明顯減小(P<0.05)；H波潛伏期、M波閾值和潛伏期及Mmax無明顯變化(P>0.05)。在染毒的第9天，H波和M波各項(xiàng)指標(biāo)均發(fā)生了改變，表現(xiàn)為H波(P<0.01)和M波(P<0.05)閾值均增大，Hmax(P<0.01)和Mmax(P<0.05)明顯減小及H波(P<0.05)和M波(P<0.01)潛伏期延長。對照組各天H反射的各指標(biāo)均無明顯變化。見表2。

表2 兩組H反射的誘導(dǎo)及H反射的特征

3 討論

H反射由Hoffmann得名，感受器是肌梭，是電刺激脛神經(jīng)誘發(fā)的脊髓單突觸牽張反射。H反射研究的是感覺傳入、運(yùn)動傳出、效應(yīng)器(骨骼肌)和脊髓神經(jīng)元池的整個活動。Ia型粗大的有髓纖維為傳入神經(jīng)纖維，α運(yùn)動纖維為傳出神經(jīng)纖維。正常情況下，當(dāng)刺激強(qiáng)度較低時，低閾值的Ia型粗大的有髓纖維先興奮，產(chǎn)生H波，當(dāng)刺激強(qiáng)度增大到足以引起閾值較高的α運(yùn)動神經(jīng)元興奮時則會產(chǎn)生M波，此時繼續(xù)增大刺激強(qiáng)度，H波將逐漸減小而M波達(dá)到最大[15]。H反射中，H波和M波各參數(shù)的意義不同。H波的潛伏期反映反射弧興奮傳遞的時間，其潛伏期可以反映整個反射通路的傳導(dǎo)時間即反射時[16]。H波幅度與整個反射通路的完整性有關(guān)。H 波的刺激閾值與Ia型粗大的有髓纖維興奮性或敏感性有關(guān)。M 波的潛伏期反映興奮經(jīng)過運(yùn)動單位(由α運(yùn)動神經(jīng)元、其所支配的骨骼肌和神經(jīng)肌肉接頭共同構(gòu)成)的傳遞時間，即神經(jīng)肌肉復(fù)合動作電位的潛伏期，與神經(jīng)肌肉復(fù)合動作電位的傳導(dǎo)速度有關(guān)。M波幅度與整個運(yùn)動單位的完整性有關(guān)，反映了神經(jīng)肌肉復(fù)合動作電位的幅度。M波的刺激閾值與運(yùn)動單位的興奮性或敏感性有關(guān)。

ACR中毒是一種重要的職業(yè)性疾病，通過動物模型模擬染毒過程可以為臨床提供有價值的資料。在本研究采用的模型中，大鼠ACR染毒9 d就可造成急性中毒模型[12]。H反射相關(guān)指標(biāo)的變化最早發(fā)生在染毒的第3天。在染毒的第3天，H反射的H波閾值就增大了，而H波的潛伏期、Hmax與M波的閾值、潛伏期及Mmax均無明顯變化。這提示在染毒的第3天，H反射的反射弧中低閾值的Ia型粗大的有髓傳入纖維興奮性已經(jīng)降低。在ACR染毒的第6天，除H波閾值增大外，Hmax也降低，推測H反射的反射弧已部分開始損傷。在ACR染毒的第9天，M波和H波各項(xiàng)指標(biāo)均發(fā)生了明顯變化，且H波誘發(fā)的閾值高于M 波誘發(fā)的閾值，推測H反射的反射弧或反射通路的損傷進(jìn)一步加劇，已涉及到由α運(yùn)動神經(jīng)元由α運(yùn)動神經(jīng)元、其所支配的骨骼肌和神經(jīng)肌肉接頭三者共同構(gòu)成的運(yùn)動單位。

H反射是脊髓反射機(jī)能的重要指標(biāo)，但同時受高位中樞的調(diào)控，特別是高位中樞對該反射有一定的突觸前抑制作用[17]。一般認(rèn)為，當(dāng)高位中樞損害后，脊髓失去上運(yùn)動神經(jīng)元的抑制作用后興奮性增加，往往導(dǎo)致脊髓單突觸反射增強(qiáng)或亢進(jìn)[10,18]。近年來的大量研究表明，ACR中毒可導(dǎo)致多個高位中樞(如大腦皮層、脊髓、小腦、紋狀體等)損傷[19-21]。而本研究中發(fā)現(xiàn)H反射從染毒的第6天開始就明顯減弱，因此可以進(jìn)一步印證丙烯酰胺染毒損傷了H反射的推測。

ACR染毒大鼠H反射的反射弧或反射通路的改變，與染毒后體重的變化及體態(tài)評分相適應(yīng)。伴隨著染毒時間的增加，ACR在體內(nèi)的累積劑量增大，大鼠體重下降的明顯，體態(tài)評分也越高，H反射的指標(biāo)改變愈廣泛愈顯著。提示H反射的反射通路的改變與ACR染毒的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)聯(lián)性。ACR染毒大鼠H反射的改變可能與外周神經(jīng)損傷變化的趨勢一致，即先損傷感覺傳入神經(jīng)，后損傷運(yùn)動傳出神經(jīng)。特別有意義的是在染毒的第3天伴隨著大鼠步態(tài)評分增大的同時，通過H反射就可以檢測到H波的閾值增大了，這提示H反射可以作為評價ACR中毒的一個早期指標(biāo)。

H反射是一種非常有用的工具，在神經(jīng)肌肉功能評價等方面有獨(dú)特的作用[22]。結(jié)合ACR對周圍感覺和運(yùn)動神經(jīng)損傷的機(jī)制及損傷的順序(感覺神經(jīng)損傷先于運(yùn)動神經(jīng))，推測染毒大鼠H 反射減弱的病理生理機(jī)制可能如下：ACR先降低低閾值的Ia型粗大的有髓傳入纖維的興奮性，再損傷低閾值的Ia型傳入纖維，進(jìn)一步損傷α運(yùn)動神經(jīng)元和其所支配的骨骼肌共同構(gòu)成的運(yùn)動單位。H反射有望作為評價ACR中毒的一個早期敏感指標(biāo)。未來的研究需進(jìn)一步證實(shí)。