肖紅梅, 陳榮, 姜應(yīng)梅

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1腫瘤科， 2預(yù)防保健科(貴州遵義 563000)

頭頸部惡性腫瘤是指發(fā)生在口腔、咽、喉和甲狀腺等部位的惡性腫瘤，具有較強(qiáng)的腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力，其惡性程度較高[1-2]。目前關(guān)于頭頸部惡性腫瘤的治療，臨床上主要采用手術(shù)為主的治療方式，輔以放療、化療等治療手段[3-4]。視黃酸X受體α(RXRA)屬于非類固醇受體家族，在細(xì)胞增殖、分化、代謝、炎癥等生理功能方面發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用[5-8]。在多種腫瘤細(xì)胞中，RXRA以N端切割形式tRXRA發(fā)揮促癌作用，主要的機(jī)制包括激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)等信號(hào)通路[9-10]。最新的研究還發(fā)現(xiàn)RXRA能夠與promyelocytic leukemia/retinoic acid receptor alpha (PML/RARA)相互作用形成復(fù)合物，促進(jìn)急性早幼粒細(xì)胞白血病的發(fā)展[11-14]。這些證據(jù)都說(shuō)明RXRA的異常表達(dá)在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。而關(guān)于RXRA在頭頸部惡性腫瘤中研究還未見相關(guān)的報(bào)道，2017年10月至2019年3月，本研究探索RXRA在頭頸部惡性腫瘤中的表達(dá)水平，并分析其與腫瘤大小、組織分化程度等臨床病理特征之間的關(guān)系，并分析其在頭頸部惡性腫瘤中與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶之間的調(diào)控關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 70例頭頸部惡性腫瘤病例收集于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，患者在術(shù)前均未進(jìn)行過(guò)化療、放療及其他治療。其中男38例，女32例，≥60周歲15例，<60周歲55例。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者19例。組織標(biāo)本取材于手術(shù)中，儲(chǔ)存于超低溫冰箱中保存。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。70例頭頸部惡性腫瘤組織根據(jù)RT-qPCR分析RXRA的mRNA表達(dá)水平，根據(jù)中位數(shù)法，將70例頭頸部惡性腫瘤患者分為RXRA高表達(dá)組和RXRA低表達(dá)組，其中高表達(dá)組35例，低表達(dá)組35例。

1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均采購(gòu)于TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 臨床組織標(biāo)本從超低溫冰箱中取出置于冰上解凍，加入總RNA提取試劑，組織勻漿機(jī)勻漿后，置于冰上20 min，充分裂解細(xì)胞。在4℃下12 000g/min離心15 min，取上清到新的離心管中，加入預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，靜置10 min后，12 000g/min離心15 min，棄去上清液，白色沉淀即為提取的總RNA。加入1 mL的75%乙醇洗滌2次去除溶劑污染，4℃下7 500g/min離心5 min，棄去上清液，室溫干燥5 min，加入DEPC水溶解總RNA。

1.3.2 熒光定量PCR(RT-qPCR) 將提取的總RNA 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得第1條鏈的cDNA，以此為模板DNA進(jìn)行熒光定量PCR。熒光定量采用SYBR Green染料，分析方法采用2-ΔCT。

1.3.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中提取頭頸部惡性腫瘤的RXRA基因表達(dá)矩陣，采用Transcript Per Million (TPM)的方法進(jìn)行基因表達(dá)水平的分析，數(shù)據(jù)采用log2的方式進(jìn)行展示。RXRA啟動(dòng)子甲基化水平的分析是基于TCGA頭頸部惡性腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)，利用450k Methylation Array進(jìn)行分析頭頸部惡性腫瘤組織和癌旁組織的RXRA啟動(dòng)子甲基化水平變化。利用cBioPortal for Cancer Genomics數(shù)據(jù)庫(kù)分析TCGA頭頸部惡性腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)中RXRA共表達(dá)基因，分析RXRA與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達(dá)相關(guān)性，相關(guān)性采用Spearman進(jìn)行分析。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在頭頸部惡性腫瘤組織中的表達(dá)利用GEPIA在線工具，分析其在頭頸部惡性腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 RXRA在頭頸部惡性腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá) 對(duì)519例頭頸部惡性腫瘤組織和44例癌旁組織中RXRA的基因表達(dá)水平，RXRA在頭頸部惡性腫瘤組織中的表達(dá)中位數(shù)為5.61，而癌旁組織中RXRA的表達(dá)中位數(shù)為5.13，RXRA在頭頸部腫瘤組織中呈高表達(dá)(P<0.001)，見圖1。進(jìn)一步分析RXRA在不同腫瘤分型頭頸部惡性腫瘤組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在非規(guī)則型、基底型和經(jīng)典型頭頸部惡性腫瘤標(biāo)本，RXRA的表達(dá)無(wú)顯著變化。而在間充質(zhì)頭頸部惡性腫瘤組織中RXRA的表達(dá)有所降低，但與其他腫瘤分型的頭頸部惡性腫瘤相比，無(wú)顯著的變化。

注：*P<0.001圖1 RXRA在頭頸部惡性腫瘤組織中的表達(dá)

2.2 頭頸部惡性腫瘤組織中RXRA的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 本研究還進(jìn)一步在收集的臨床標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)RXRA在癌旁組織中的表達(dá)中位數(shù)為2.32，而腫瘤組織中的表達(dá)中位數(shù)高達(dá)4.58，因此相對(duì)于癌旁組織，頭頸部惡性腫瘤組織中RXRA的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)，見圖2-A。根據(jù)腫瘤最大徑是否>3 cm，將70例頭頸部惡性腫瘤組織分為兩組，發(fā)現(xiàn)在腫瘤最大徑>3 cm的組織中其RXRA的表達(dá)中位為5.3，而腫瘤最大徑<3 cm的腫瘤組織中RXRA的表達(dá)中位數(shù)3.79，RXRA在腫瘤最大徑≥3 cm的腫瘤組織中表達(dá)顯著高于腫瘤最大徑<3 cm的組織，見圖2-B。根據(jù)患者是否存在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分析發(fā)現(xiàn)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的頭頸部惡性腫瘤組織中RXRA的表達(dá)中位數(shù)為6.7，也顯著高于未轉(zhuǎn)移腫瘤組織中的3.8(P<0.001)，見圖2-C。根據(jù)RXRA表達(dá)中位數(shù)法將70例頭頸部惡性腫瘤組織分為RXRA高表達(dá)組和RXRA低表達(dá)組，分析發(fā)現(xiàn)RXRA表達(dá)與患者的性別(2=0.32,P=0.572)和年齡(2=0.561,P=0.453)均無(wú)顯著聯(lián)系。而RXRA表達(dá)水平與腫瘤大小(2=6.341,P=0.012)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(2=24.5,P=0.000)以及組織分化程度(2=8.138,P=0.004)均存在顯著的相關(guān)性，見表1。

注：A：分析70例頭頸部惡性腫瘤組織和癌旁組織；B：按照腫瘤最大徑進(jìn)行分組分析基因表達(dá)水平；C：按照患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，分析基因的表達(dá)水平。*P<0.001圖2 RXRA與頭頸部惡性腫瘤進(jìn)展的關(guān)系

表1 HNSC中RXRA表達(dá)高低與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 RXRA啟動(dòng)子甲基化水平分析 分析頭頸部惡性腫瘤組織中RXRA啟動(dòng)子的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)528例頭頸部惡性腫瘤組織中RXRA的啟動(dòng)子甲基化水平的中位數(shù)為0.068(0.060,0.077)，而癌旁組織中RXRA啟動(dòng)子的甲基化水平中位數(shù)為0.072(0.067,0.087)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

注：*P<0.001圖3 頭頸部惡性腫瘤組織中RXRA的啟動(dòng)子甲基化水平

2.4 RXRA與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)性 分析TCGA頭頸部惡性腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)中，RXRA與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達(dá)相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RXRA與DNMT1基因的共表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.13(P<0.01)，而RXRA與DNMT3A基因的共表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.29(P<0.01)，RXRA與DNMT3B基因的共表達(dá)相關(guān)系數(shù)為0.37(P<0.01)，見圖4。

注：A：RXRA與DNMT1相關(guān)性；B：RXRA與DNMT3A相關(guān)性；C：RXRA與DNMT3B相關(guān)性圖4 頭頸部惡性腫瘤組織中RXRA與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)性

2.5 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因在頭頸部惡性腫瘤中的表達(dá)水平 基于TCGA頭頸部惡性腫瘤數(shù)據(jù)，采用GEPIA工具分析DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)在DNMT1在頭頸部惡性腫瘤中的表達(dá)中位數(shù)為5.2，而癌旁中DNMT1的表達(dá)中位數(shù)為3.9，癌旁中DNMT1的表達(dá)顯著低于腫瘤組織(P<0.05)，DNMT3A在頭頸部惡性腫瘤中表達(dá)中位數(shù)為3.0，而在癌旁中表達(dá)中位數(shù)為2.4，DNMT3A在頭頸部腫瘤組織中呈高表達(dá)(P<0.05)，而DNMT3B在頭頸部惡性腫瘤中表達(dá)中位數(shù)為1.9，癌旁中DNMT3B表達(dá)中位數(shù)為0.4，DNMT3B在頭頸部腫瘤組織中的表達(dá)也顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見圖5。

注：A：DNMT1基因在頭頸部惡性腫瘤及癌旁組織的mRNA表達(dá)水平；B：DNMT3A基因在頭頸部惡性腫瘤及癌旁組織的mRNA表達(dá)水平；C：DNMT3B基因在頭頸部惡性腫瘤及癌旁組織的mRNA表達(dá)水平,*P<0.05圖5 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因在頭頸部惡性腫瘤組織中的表達(dá)水平

3 討論

頭頸部惡性腫瘤的治療方式主要依靠手術(shù)，輔以化療和放療。而頭頸部惡性腫瘤因其發(fā)病部位隱蔽性強(qiáng)，往往確診時(shí)已經(jīng)進(jìn)入進(jìn)展期，因此手術(shù)治療效果不盡如意[15-16]。而放療的高輻射毒性以及化療的耐藥性也同樣制約著頭頸部惡性腫瘤的治療[17-19]。因此深入研究頭頸部惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于研發(fā)抗頭頸部惡性腫瘤藥物具有非常大的實(shí)際意義。

先前的研究表明RXRA在多種腫瘤中呈異常表達(dá)，而在頭頸部惡性腫瘤中未見相關(guān)的報(bào)道。而本研究發(fā)現(xiàn)RXRA在頭頸部惡性腫瘤組織中高表達(dá)，并且其表達(dá)與頭頸部惡性腫瘤的腫瘤分型無(wú)顯著的相關(guān)性，而RXRA的表達(dá)水平與腫瘤的大小、腫瘤組織的分化程度以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著的正相關(guān)的關(guān)系，這些結(jié)果表明RXRA在頭頸部惡性腫瘤中的高表達(dá)可能扮演著促癌因子的角色，深入研究RXRA在頭頸部惡性腫瘤中的表達(dá)具有非常大的臨床意義，其有可能成為頭頸部惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。RXRA在頭頸部惡性腫瘤中高表達(dá)，那么其異常表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制是什么呢？最近的研究發(fā)現(xiàn)，DNA的甲基化修飾是基因表達(dá)調(diào)控失調(diào)的重要原因[20]，那么RXRA在頭頸部惡性腫瘤中的甲基化水平是怎樣的呢？分析發(fā)現(xiàn)對(duì)于癌旁組織，在頭頸部惡性腫瘤的腫瘤組織中RXRA的啟動(dòng)子甲基化水平顯著下調(diào)，而DNA的甲基化作為一種重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式，在基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)方面發(fā)揮重要的作用[21-22]，這說(shuō)明RXRA在頭頸部惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)與其甲基化修飾調(diào)控存在密切的聯(lián)系。

為了進(jìn)一步分析RXRA在頭頸部惡性腫瘤組織中高表達(dá)與其啟動(dòng)子甲基化潛在的調(diào)控機(jī)制，我們分析發(fā)現(xiàn)在頭頸部惡性腫瘤組織中RXRA與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B存在正相關(guān)的關(guān)系，表明RXRA與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶存在緊密的調(diào)控機(jī)制，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在腫瘤組織中RXRA的低啟動(dòng)子甲基化水平過(guò)程發(fā)揮著潛在的功能。

最新的研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)修飾在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平可以作為腫瘤診斷的輔助手段用于腫瘤的診斷和治療的預(yù)后評(píng)價(jià)[23-25]。而本研究中發(fā)現(xiàn)RXRA在頭頸部惡性腫瘤中異常表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化修飾存在密切的聯(lián)系，因此在后續(xù)的研究中值得進(jìn)一步深入的探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RXRA在頭頸部惡性腫瘤中高表達(dá)，并且其異常表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織惡性程度存在緊密的聯(lián)系，并且RXRA的異常表達(dá)于其甲基化修飾存在潛在的調(diào)控關(guān)系，其有可能是頭頸部惡性腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。