張壯彪，潘林香，王金文，賀小云，儲(chǔ)明星*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100193;2. 萊蕪市嬴泰有機(jī)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司, 山東 萊蕪271114;3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 山東 濟(jì)南 250100)

綿羊(Ovisaries)的產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)極其復(fù)雜的繁殖性狀，受到多種因素影響，其中遺傳因素占大部分。研究表明多種基因參與綿羊的繁殖調(diào)控。1982年，F(xiàn)ecB基因在Booroola羊中首先被發(fā)現(xiàn)[1]，之后其被定位到綿羊6號(hào)染色體[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因(突變)的產(chǎn)生是由于BMPRIB基因的746位堿基突變(A746G)[3-4]，該突變導(dǎo)致谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)蛋白功能改變。對(duì)FecB基因進(jìn)行排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)：攜帶一個(gè)拷貝的FecB突變可以增加排卵數(shù)1.5個(gè)，產(chǎn)羔數(shù)1個(gè)；兩個(gè)拷貝數(shù)FecB突變可以顯著增加排卵數(shù)3個(gè)，產(chǎn)羔數(shù)1.5個(gè)[5]。除此之外，GDF9[6]、BMP15等[7]候選基因也可以影響綿羊的繁殖力。其中BMP15可以調(diào)控GDF9基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控卵泡發(fā)育[8]，也有研究發(fā)現(xiàn)BMPRIB可以編碼BMP15基因的受體，進(jìn)一步調(diào)控綿羊的繁殖過(guò)程[9]。雖然對(duì)綿羊的繁殖力研究已經(jīng)持續(xù)數(shù)年，但綿羊產(chǎn)羔數(shù)或繁殖力的差異是如何產(chǎn)生的仍然有待探究。因此探究發(fā)現(xiàn)其他可以影響綿羊繁殖力的候選基因?qū)⒂兄陉U明綿羊高繁殖力的分子機(jī)理。

Gli-similar-1(GLIS1)是由Kim等[10]在2002年克隆出的Krüppel類似蛋白基因，該基因編碼一種富含84.3-kDa脯氨酸的蛋白質(zhì)，其主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，且鋅指結(jié)構(gòu)在其核定位中發(fā)揮重要作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，該基因在體細(xì)胞重編程以及胚胎發(fā)育和基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-12]。在小鼠受精卵和卵母細(xì)胞中該基因也呈高表達(dá)[13]，且前期通過(guò)重測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)GLIS1基因的突變位點(diǎn)與綿羊的繁殖性狀相關(guān)[14]，暗示該基因?qū)Ψ敝尺^(guò)程具有重要調(diào)控作用，但關(guān)于該基因?qū)d羊繁殖的影響鮮有報(bào)道。魯中肉羊作為近年來(lái)培育的優(yōu)良肉羊新類群，具有高繁殖力、耐粗飼、抗病力強(qiáng)、適合圈養(yǎng)等特點(diǎn)[15]。探究GLIS1基因多態(tài)性對(duì)魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的影響，將有助于該類群的選育，進(jìn)一步提高經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

384只魯中肉羊血液樣品(綿羊頸靜脈采血)來(lái)自萊蕪市嬴泰有機(jī)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，采集后的樣品用5%檸檬酸鈉抗凝處理，-20 ℃保存。

1.2 綿羊血液DNA提取

使用血液基因組提取試劑盒(天根生物科技有限公司，北京)對(duì)384只魯中肉羊進(jìn)行血液DNA的提取，對(duì)提取后的血液樣品進(jìn)行濃度(Nano Drop 2000)和質(zhì)量(1.5%瓊脂糖凝膠電泳)的評(píng)估，合格的DNA樣品用于后續(xù)分析。

1.3 基因分型

MassARRAY Assay Design v. 3.1軟件用于設(shè)計(jì)檢測(cè)g.27775611T>C位點(diǎn)的單堿基延伸引物(登錄號(hào)：NC_019458.1)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序。使用MassARRAY[16]對(duì)384只魯中肉羊進(jìn)行基因分型，分型的具體過(guò)程見(jiàn)Zhang等[17]所示方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用于計(jì)算多態(tài)信息含量、雜合度、有效等位基因數(shù)和卡方值(哈代溫伯格參數(shù))等群體遺傳學(xué)參數(shù)的方法詳見(jiàn)Zhang等[17]。

yi=μ+Gi+ei模型用于GLIS1基因g.27775611 T>C位點(diǎn)與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析。式中：yi代表產(chǎn)羔數(shù)；μ代表群體均值； Gi代表i種基因型的影響(i=1，2，3)；ei代表隨機(jī)誤差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析由SAS (V. 8.1)完成，產(chǎn)羔數(shù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.5 GLIS1蛋白的生物信息學(xué)分析

綿羊的蛋白序列來(lái)自NCBI。ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)用于預(yù)測(cè)GLIS1蛋白的理化性質(zhì)；TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)用來(lái)預(yù)測(cè)GLIS1的跨膜結(jié)構(gòu)域；SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于GLIS1蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)；Predictprotein(https://www.predictprotein.org/)用于預(yù)測(cè)GLIS1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；NCBI 保守域預(yù)測(cè) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?tdsourcetag=s_pctim_aiomsg) 用于預(yù)測(cè)GLIS1蛋白的結(jié)構(gòu)功能域；SCRATCH protein predictor(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/index.html)用于預(yù)測(cè)GLIS1蛋白的二硫鍵；NetOGlyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)用于預(yù)測(cè)GLIS1蛋白的糖基化；NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )用于預(yù)測(cè)GLIS1蛋白的磷酸化位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLIS1基因多態(tài)性及其與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

384只魯中肉羊的分型結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明384只魯中肉羊群體中存在3種基因型，分別是：CC型8只、TC型108只、TT型268只。對(duì)其進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)(表1)：該位點(diǎn)的多態(tài)信息含量為0.24，屬于低度多態(tài)(P<0.25)，該群體的卡方值為0.65，說(shuō)明該群體處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)。為探究該突變位點(diǎn)對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)的影響，對(duì)384只魯中肉羊進(jìn)行了產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)：在有產(chǎn)羔數(shù)記錄的3胎中，突變純合個(gè)體(CC)的產(chǎn)羔數(shù)顯著低于突變雜合個(gè)體(TC)和野生型(TT)(P<0.05)，突變雜合個(gè)體(TC)的產(chǎn)羔數(shù)低于野生型(TT)(P>0.05)，說(shuō)明突變可以顯著降低魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)。

2.2 GLIS1蛋白的生物信息學(xué)分析

GLIS1蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明：該蛋白由728個(gè)氨基酸組成，其分子量為77195.46 D，等電點(diǎn)為8.82，屬于堿性蛋白質(zhì)。從蛋白組成來(lái)看，其主要由20種氨基酸組成，其中脯氨酸(pro)含量最高為14.3%，而色氨酸(Trp)含量最低為0.4%。該蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期大約為5.5 h，不穩(wěn)定指數(shù)為65.93，脂溶性指數(shù)為64.67，親水平均值為-0.520，故該蛋白是一種不穩(wěn)定脂溶性的疏水蛋白。

表1 g.27775611T>C位點(diǎn)在魯中肉羊中的群體遺傳學(xué)分析Table 1 The population genetic analysis of g.27775611T>C in Luzhong mutton sheep

表2 g.27775611T>C位點(diǎn)不同基因型魯中肉羊不同胎次的產(chǎn)羔數(shù)Table 2 The litter size of different parity in Luzhong mutton sheep with different genotypes of g.27775611T>C

該蛋白屬于膜內(nèi)蛋白(圖2A)，并且無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。從預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，其暴露態(tài)(exposed)占47.76%，中間態(tài)(intermediate)為7.06%，埋藏態(tài)(buried)為45.18%，另外該蛋白還存在多個(gè)DNA、RNA和蛋白結(jié)合位點(diǎn)(圖2B)。其功能域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖2C)：該蛋白在354-344處存在COG5048超家族結(jié)構(gòu)域即鋅指功能域，該結(jié)構(gòu)域可能對(duì)GLIS1蛋白的功能起重要作用。另外該蛋白存在26個(gè)半胱氨酸(cys)，其形成了11個(gè)二硫鍵。

為探究GLIS1基因突變前后蛋白功能的變化，對(duì)其突變前后糖基化和磷酸化位點(diǎn)的變化進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與突變前相比，突變后在其547位氨基酸增加了一個(gè)糖基化位點(diǎn)；與突變前相比(圖3A)，突變后的GLIS1蛋白其547位氨基酸磷酸化位點(diǎn)丟失(圖3B)，可能導(dǎo)致一些激酶無(wú)法在該位點(diǎn)結(jié)合(圖3C)，進(jìn)而可能導(dǎo)致其功能的變化。

3 討 論

GLIS1基因是一種Krüppel類似蛋白基因，由于其在小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，猜測(cè)其對(duì)其他哺乳動(dòng)物如綿羊的繁殖活動(dòng)具有重要調(diào)控作用。關(guān)于該基因研究主要集中在其與干細(xì)胞活性，細(xì)胞重編程[18-19]以及某些疾病[20-21]。有研究表明GLIS1基因的多態(tài)性(rs797906)與中國(guó)人群帕金森疾病的發(fā)病率有關(guān)[22]。但關(guān)于該基因多態(tài)性對(duì)綿羊繁殖的影響鮮有報(bào)道。本研究中GLIS1基因g.27775611C>T位點(diǎn)與魯中肉羊產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，該突變可以顯著降低魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)(P<0.05)，說(shuō)明其可以顯著影響綿羊的繁殖性能。

蛋白是基因功能的執(zhí)行者，研究分析其蛋白的功能可以更好地解釋該基因?qū)Ψ敝承阅艿挠绊憽LIS1蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白是一種不穩(wěn)定脂溶性的疏水蛋白，其在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期大約為5.5 h，不穩(wěn)定指數(shù)為65.93，脂溶性指數(shù)為64.67，親水平均值為-0.520，其半衰期長(zhǎng)，而其卻屬于不穩(wěn)定蛋白，與半衰期長(zhǎng)蛋白穩(wěn)定的常理相駁[23]，故推測(cè)其具有雙重活性[24]。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明該蛋白是一種沒(méi)有信號(hào)肽且不跨膜的蛋白，暗示該蛋白發(fā)揮功能可能在細(xì)胞核內(nèi)，該結(jié)果與前人報(bào)道一致[10]。鋅指功能域是該蛋白的唯一功能結(jié)構(gòu)域，研究表明，該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍椎亩ㄎ黄饹Q定性作用[10]；也有研究表明，Kruppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以作為其它基因如血管緊張素Ⅱ的靶基因，發(fā)揮其重編程的作用[25]，結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)其可能是其它可以影響綿羊繁殖力基因的靶基因，具體基因和相關(guān)機(jī)制有待驗(yàn)證。

氨基酸的糖基化和磷酸化對(duì)蛋白本身的功能具有重要影響。研究表明在小鼠雌激素受體基因16位絲氨酸的糖基化和磷酸化可以顯著影響該基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響雌激素受體的功能[26]。在本研究中GLIS1基因突變前后其糖基化和磷酸化位點(diǎn)發(fā)生變化，該變化可能會(huì)導(dǎo)致該蛋白功能的改變，從而影響綿羊的繁殖活動(dòng)。也有研究表明在有蹄動(dòng)物孕期，某些因素如糖基化和磷酸化具有調(diào)節(jié)果糖降解的作用，進(jìn)而促進(jìn)懷孕動(dòng)物外胚層細(xì)胞的增殖[27]，從而提高懷孕成功率甚至產(chǎn)羔數(shù)。結(jié)合本研究中GLIS1基因突變對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)的影響，推測(cè)突變后磷酸化和糖基化位點(diǎn)的變化可能在一定程度上降低魯中肉羊的繁殖力或者產(chǎn)羔數(shù)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本研究表明，GLIS1基因g.27775611T>C位點(diǎn)突變可以顯著降低魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)。生物信息學(xué)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該蛋白突變后其磷酸化和糖基化位點(diǎn)發(fā)生變化，該變化可能降低魯中肉羊的產(chǎn)羔數(shù)；GLIS1基因g.27775611T>C位點(diǎn)突變屬于有害突變，在以后綿羊育種工作中應(yīng)減少或避免該突變的發(fā)生。