孔利華，高書鋒，雷 平，王升平，周映華，龔 平，曾發(fā)姣，繆 東，周小玲，曾 奧，舒 燕，鄔理洋，劉惠知

(湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009)

隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)?；?、集約化發(fā)展，抗生素在飼料中長(zhǎng)期添加使用，造成畜禽腸道菌群失衡、內(nèi)源性及二重感染和藥物殘留等弊端[1-2]，迫切需要一種新的替代品，中草藥和微生態(tài)制劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[3-4]，也是未來(lái)綠色飼料發(fā)展的重要方向之一。

黃芩主要成分為黃芩苷，其次為黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素，具有多種藥理活性，包括抗炎[5-7]、抗氧化[8]、抗微生物[7-9]、抗病毒[10-11]、清除自由基[7,12]等。黃芩苷需經(jīng)動(dòng)物腸道菌群作用水解成黃芩素后，才能被吸收和發(fā)揮藥效[13]，黃芩素各方面藥理作用均強(qiáng)于黃芩苷[14]。黃芩中黃芩素含量約1%，黃芩苷含量大于10%，β-葡萄糖醛酸苷酶可水解黃芩苷為黃芩素[15]，對(duì)提高藥理活性具有重要意義。

目前，黃芩素大多從藥材直接提取，近年來(lái)已有一些文獻(xiàn)報(bào)道利用側(cè)耳菌[14]、黑曲霉[16-17]、米曲霉[18]、青霉菌[19-20]、納豆芽孢桿菌[21]、短乳桿菌[22]、藍(lán)藻[23]對(duì)黃芩進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，但所用微生物轉(zhuǎn)化菌株多為真菌類，難免會(huì)產(chǎn)生安全性問(wèn)題，藍(lán)藻爆發(fā)存在生態(tài)污染隱患，而作為益生菌的納豆芽孢桿菌，卻非腸道固有土著菌種，在動(dòng)物腸道中能否定殖、發(fā)揮益生作用還不明確。本試驗(yàn)從健康雞小腸內(nèi)容物中篩選出一株產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的JY24菌株，并對(duì)該菌株分類特征、胃腸道環(huán)境耐受性和β-葡萄糖醛酸苷酶酶學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步發(fā)酵轉(zhuǎn)化黃芩苷生產(chǎn)活性產(chǎn)物黃芩素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，瓊脂20 g(固態(tài))；篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，黃芩苷0.5 g，蒸餾水1 000 mL， pH 7.0～7.2，瓊脂20 g； 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、磷酸二氫鉀1.0 g、七水硫酸鎂0.5g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要試劑 黃芩素(ANPEL Laboratory Technologies,98.7%)、黃芩苷(上海瑞永生物科技有限公司，≥98.0%)、對(duì)硝基苯酚(Dr.Ehrenstorfer GmbH，Germany，99.4%)、對(duì)硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷(Sigma Aldrich，美國(guó)，>99%)、硅膠GF254薄層板(青島海洋化工有限公司)、Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒Sk8225、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒(購(gòu)自生工)，pMD@-18T Vecter連接試劑盒(購(gòu)自Takara公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離、篩選

1.2.1.1 菌株分離純化 健康雞只宰殺后，立刻從小腸內(nèi)容物中取樣1.0 g，置于裝有99 mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩均勻，無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋，選擇10-3、10-4、10-5和10-64個(gè)稀釋度，取0.1 mL稀釋液涂布于篩選平板，35 ℃培養(yǎng)24 h，對(duì)生長(zhǎng)菌株進(jìn)行劃線純化，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 菌株篩選 將分離菌株活化后，取3環(huán)至LB培養(yǎng)液，35 ℃、200 rpm培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液于10 000 rpm、4 ℃冷凍離心10 mins，上清液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，得粗酶液。將粗酶液點(diǎn)樣于篩選培養(yǎng)基平板，置40 ℃培養(yǎng)箱24 h，噴2%FeCl3乙醇溶液顯色，30 min后觀察平板顯色圈有無(wú)、顏色和大小[24]，以顯色圏直徑大小衡量菌株產(chǎn)酶能力大小。

1.2.1.3 菌株復(fù)篩(薄層層析檢測(cè)) 發(fā)酵濾液制備：初篩菌株活化后，取3環(huán)至LB培養(yǎng)液，35 ℃、200 rpm培養(yǎng)20 h，再取3 mL種子液至含1%黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)酵培養(yǎng)液中，35 ℃、200 rpm培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液經(jīng)10 000 rpm、4 ℃冷凍離心10 min，上清液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，待用。黃芩苷、黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制及薄層層析檢測(cè)按中藥成分分析[25]方法進(jìn)行。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征 觀察菌落形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢染色鏡檢。

1.2.2.2 生理生化特征 參閱常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)[26]、伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[7]進(jìn)行。

1.2.2.3 16S rDNA序列分析 提取JY24菌株基因組總DNA，采用16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，PrimerA正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，PrimerB反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，通用引物由上海生工合成。PCR 產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳，SK8131膠回收試劑盒純化回收，上海生工進(jìn)行序列測(cè)序。l6S rDNA基因序列在Genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)和同源性比較，將與之同源性最高的15株模式菌株的16S rDNA序列，采用MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 JY24菌株胃腸道環(huán)境耐受性試驗(yàn)

1.2.3.1 人工胃液、腸液耐受性試驗(yàn) 按1%接種量將JY24菌株發(fā)酵液分別接入人工胃液(pH2.5)和腸液[28]中，37 ℃、200 rpm 搖床培養(yǎng)，于0、0.5、1.5和3 h時(shí)分別取樣1 mL，無(wú)菌水梯度稀釋，10-5梯度中取1 mL稀釋液，傾注法平板計(jì)數(shù)(平行3次)，35 ℃培養(yǎng)48 h，觀察記錄活菌數(shù)量。

1.2.3.2 膽鹽耐受性試驗(yàn) 按1%接種量將JY24菌株發(fā)酵液接入豬膽鹽濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.30、0.50和1.0%LB培養(yǎng)液，37 ℃、200 rpm 培養(yǎng)12 h，分別取樣1 mL，無(wú)菌水梯度稀釋，10-5梯度取1 mL稀釋液，傾注法平板計(jì)數(shù)(平行3次)，35 ℃培養(yǎng)48 h，觀察記錄活菌數(shù)量，考察菌株耐受膽鹽能力[29]。

1.2.4 酶學(xué)特性研究

1.2.4.1 溫度對(duì)酶活性影響 各取粗酶液2 mL，將酶反應(yīng)溫度分別設(shè)為20、25、30、35、40、45、50、55、60和65 ℃，測(cè)定各處理酶活性[30-31]，確定最適溫度。各取粗酶液2 mL，分別置于40、50和60 ℃水浴恒溫處理不同時(shí)間，于0、10、20、30、40、50和60 min時(shí)取樣測(cè)定酶活性，考察該酶對(duì)溫度耐受性。

1.2.4.2 pH對(duì)酶活性影響 各取粗酶液10 mL，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液將粗酶液pH分別調(diào)為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，測(cè)定各處理酶活性，確定最適pH。各取粗酶液10 mL，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液將粗酶液pH分別調(diào)為5.5、6.5、7.0和7.5處理一定時(shí)間，分別于0、10、20、30、40、50和60 min時(shí)取樣測(cè)定酶活性，考察該酶對(duì)pH耐受性。

1.2.4.3 金屬離子對(duì)酶活性影響 各取粗酶液10 mL，分別加入KNO3、NaCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeCl3、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O 和無(wú)菌水(對(duì)照)，使金屬離子濃度達(dá)2.5 mmol/L，35 ℃保溫1 h，取樣，在酶最適溫度和pH下測(cè)定各處理酶活性，分析金屬離子對(duì)酶活性影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選

2.1.1 菌株分離、初篩 共計(jì)采集健康雞小腸內(nèi)容物37批次，經(jīng)分離純化，獲得223株雞源腸道菌株，經(jīng)進(jìn)一步初篩，獲得4株產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶菌株，菌株編號(hào)：JY15、JY24、JY100和JY120，其中JY24菌株顯色圈直徑最大，平均直徑16.8 mm，表明該菌株具有較高產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶能力，初篩結(jié)果見圖1。初篩平板中黃芩苷，經(jīng)產(chǎn)酶菌株水解為黃芩素，噴以2%FeCl3乙醇溶液顯色，點(diǎn)樣處周圍出現(xiàn)顯色圈，平板背景為未被水解黃芩苷，顯綠色，點(diǎn)樣處為水解生成黃芩素，顯棕黑色。

2.1.2 菌株復(fù)篩(薄層層析檢測(cè)) 發(fā)酵濾液、黃芩苷及黃芩素對(duì)照品溶液，經(jīng)點(diǎn)樣、展開、晾干和顯色，結(jié)果見圖2，發(fā)酵濾液(點(diǎn)樣1)在與黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(點(diǎn)樣2)色譜相應(yīng)高度位置上，顯一相同暗綠色斑點(diǎn)，在與黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品(點(diǎn)樣3)色譜相應(yīng)高度位置上，顯一相同黑色斑點(diǎn)，發(fā)酵濾液有黃芩素生成，表明JY24菌株在發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生了β-葡萄糖醛酸苷酶，進(jìn)而水解底物黃芩苷，生成產(chǎn)物黃芩素。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 LB培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，48 h形成直徑5 mm左右圓形菌落，淡黃色，表面皺褶，邊緣整齊，濕潤(rùn)，不透明。革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體桿狀，單個(gè)或成鏈排列，形成芽孢。

2.2.2 生理生化特征 菌株生理生化特征見表1。

表1 JY24菌株生理生化特征Table 1 The physiological and biochemical characteristics of strain JY24

2.2.3 16SrDNA序列分析 以JY24菌株基因組DNA為模板，細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲特異性較高唯一產(chǎn)物，大小1 500 bp左右，經(jīng)克隆、測(cè)序和序列分析，所獲DNA片段長(zhǎng)度1 491 bp，與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)SSL2(序列登錄號(hào)：MH192382.1)等枯草芽孢桿菌菌株存在99%～100%同源性，結(jié)合該菌株形態(tài)、生理生化特征，確定JY24菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，該菌株在GenBank序列登錄號(hào)為MK796126。

2.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將JY24菌株16S rDNA序列遞交GenBank，blast同源性搜索，運(yùn)用DNAStar軟件，將所測(cè)序列及GenBank中收錄的與之同源性最高的15株菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明：JY24菌株與15株枯草芽孢桿菌的16S rDNA序列同源性為99%～100%。

2.3 JY24菌株耐受性試驗(yàn)

2.3.1 人工胃液、人工腸液耐受性試驗(yàn) JY24菌株在人工胃液、腸液中耐受性結(jié)果見圖4。在人工胃液中存活率下降較快，0.5、1.5和3.0 h存活率分別為89.33%、58.67%和36.00%，人工腸液中下降較慢，0.5、1.5和3.0 h存活率分別為96.33%、88.07%和81.65%，表明該菌株對(duì)人工胃液、腸液均有一定耐受性。

2.3.2 耐膽酸鹽試驗(yàn) 耐膽酸鹽試驗(yàn)結(jié)果表明：膽鹽濃度在0.01%～1.0%濃度范圍時(shí)，隨膽鹽濃度逐漸升高，JY24菌株耐受能力呈下降趨勢(shì)，其中，最高耐受膽鹽濃度為0.3%～0.5%。膽鹽濃度小于0.3%時(shí)，JY24菌株生長(zhǎng)良好，未受到抑制；膽鹽濃度為0.3%～0.5%時(shí)，菌株生長(zhǎng)較好，受到一定程度抑制；膽鹽濃度在0.5%～1.0%時(shí)，菌株生長(zhǎng)極差，基本受到完全抑制。

2.4 酶學(xué)特性初步研究

2.4.1 溫度對(duì)酶活性的影響 由圖5可知，溫度為20～65 ℃時(shí)，JY24菌株所產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶酶活先快速升高而后逐漸下降，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，酶活最大為35.04 U/mL，確定該酶最適溫度35 ℃。由圖6可知，JY24菌株所產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶在40 ℃下酶活相對(duì)穩(wěn)定，隨保溫時(shí)間延長(zhǎng)下降不明顯，50 ℃下隨保溫時(shí)間延長(zhǎng)下降較快，60 ℃下隨保溫時(shí)間延長(zhǎng)快速下降。40、50和60 ℃處理10 min相對(duì)酶活分別為96.43%、87.76%和67.37%，處理1 h相對(duì)酶活分別為72.96%、31.63%和0。

2.4.2 pH對(duì)酶活性的影響 pH對(duì)酶活性的影響見圖7。由圖7可知，在pH為3.5～8.0之間，JY24菌株所產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶酶活先逐漸升高后快速下降，pH>7.0時(shí)，酶活下降較快，表明該酶對(duì)堿耐受性較弱，pH為6.5時(shí)，酶活最大為26.64 U/mL，確定該酶最適pH為6.5。pH對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響見圖8。由圖8可知，在pH為6.0或7.0環(huán)境下，酶活較穩(wěn)定，處理1 h相對(duì)酶活分別為73.54%和73.63%。pH為5.5和7.5時(shí)，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，酶活下降相對(duì)較快，處理1 h相對(duì)酶活分別為54.54%和57.25%。

2.4.3 金屬離子對(duì)酶活性的影響 金屬離子對(duì)酶活性的影響見圖9。由圖9可知，濃度為2.5 mmol/L的Ca2+、Fe3+和Zn2+可使酶活升高11.48%～21.05%，對(duì)該酶有激活作用；Fe2+和Cu2+可使酶活性下降15.84%～18.28%，對(duì)酶活有抑制作用；K+、Na+、Mg2+和Mn2+對(duì)酶活無(wú)明顯影響。

3 討 論

益生菌是一種定殖于動(dòng)物腸道起調(diào)整腸道微生態(tài)平衡的活菌制劑，在進(jìn)入腸道環(huán)境前要經(jīng)歷約2 h低pH(2.0～3.0)胃酸環(huán)境、十二指腸高濃度(0.03%～0.30%)膽鹽環(huán)境和小腸液多種消化酶的降解作用，益生菌須有良好的耐酸能力、經(jīng)受小腸液膽鹽環(huán)境和酶降解作用，才能到達(dá)腸道發(fā)揮益生作用[32-33]。大部分細(xì)菌在低pH或者疏水作用下膜蛋白被解離，細(xì)菌細(xì)胞膜遭到破壞而死亡。研究結(jié)果表明，JY24菌株在人工胃液和人工腸液中處理3.0h存活率分別為36.00%和81.65%，最高耐受膽鹽濃度為0.3%～0.5%，該菌株對(duì)人工胃液、腸液和膽鹽均有一定耐受性，并進(jìn)一步驗(yàn)證了雞源腸道菌株對(duì)胃腸道環(huán)境具有天然的耐受性。

β-葡萄糖醛酸苷酶是一種糖苷類水解酶，催化各種類型β-葡萄糖醛酸苷水解產(chǎn)生多種衍生物，并釋放出β-葡萄糖醛酸和相應(yīng)配基[15]。楊光等[34]研究了大腸桿菌β-葡萄糖醛酸苷酶活力的影響因素，結(jié)果表明：最適pH為7.0，Ca2+在0.5～10 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)該酶具有激活作用，與本研究結(jié)果基本一致，該酶活55 ℃比37 ℃高近4.1倍，與本研究該酶最適溫度差異明顯。馮波等[35]研究表明，牛肝β-葡萄糖醛酸苷酶最適pH5.5，低于本研究最適pH6.5，該酶對(duì)溫度敏感，30～40 ℃酶活力較高，超過(guò)50 ℃后 ,酶活力迅速下降，與本研究一致。劉伶文等[13]報(bào)道β-葡萄糖醛酸苷酶最適溫度55 ℃，最適pH為6.0，金屬離子 Ca2+、Mg2+和Cu2+促進(jìn)酶促反應(yīng)，而Fe2+則具有抑制作用，Zn2+在低濃度下起促進(jìn)作用，高濃度時(shí)起抑制作用，與本研究存在一定的出入。分析以上研究表明：不同來(lái)源的β-葡萄糖醛酸苷酶具有不同的最適pH和溫度，最適pH范圍為5.0～7.0，最適溫度范圍為30～55 ℃，其差異可能與產(chǎn)酶菌株棲息環(huán)境和環(huán)境中底物種類、濃度有關(guān)，金屬離子對(duì)β-葡萄糖醛酸苷酶酶活的影響存在差異，可能與不同酶解體系差異及金屬離子的添加濃度有關(guān)。

枯草芽孢桿菌無(wú)致病性，對(duì)人畜無(wú)害，環(huán)境兼容性好，被認(rèn)為是安全的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)菌株，在綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、食品酶制劑等的發(fā)酵和生產(chǎn)環(huán)節(jié)[31]。試驗(yàn)從雞小腸內(nèi)容物中篩選出一株產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的JY24菌株，能夠耐受胃腸道環(huán)境，具有天然的定殖優(yōu)勢(shì)和較好的產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶能力，是一株潛在的理想益生菌菌株，但還需對(duì)發(fā)酵條件、酶解工藝進(jìn)行研究和優(yōu)化，為發(fā)酵轉(zhuǎn)化黃芩苷生產(chǎn)黃芩素、研發(fā)益生菌和黃芩素協(xié)同聯(lián)用綠色混合型飼料添加劑產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)篩選出一株產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的雞源枯草芽孢桿菌JY24菌株，該菌株具備一定的耐受胃腸道環(huán)境特性，該酶最適溫度為35 ℃，最適pH為6.5，Ca2+、Fe3+和Zn2+對(duì)該酶有激活作用。