趙晨光,陳路鵬,黃祚建,王 軍,蔡 珣,任竹青*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.十堰市畜牧技術(shù)推廣站，湖北 十堰 442000；3.湖北省畜牧獸醫(yī)局，湖北 武漢 430064)

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，抗生素作為治療性藥品和非治療性添加劑在飼料中廣泛使用。我國(guó)每年獸用抗生素占到抗生素年產(chǎn)量的一半以上，其中四環(huán)素類(lèi)抗生素以其優(yōu)良的促生長(zhǎng)效果、低廉的價(jià)格占到獸用抗生素的57%左右[1]。大量殘留在豬糞中的四環(huán)素類(lèi)抗生素會(huì)進(jìn)入自然界造成污染并且通過(guò)生物鏈循環(huán)富集到人體中[2]。堆肥是在有氧條件下通過(guò)微生物作用將糞便資源化、無(wú)害化處理的過(guò)程，且因其經(jīng)濟(jì)、有效等優(yōu)點(diǎn)成為國(guó)內(nèi)外畜禽糞便資源化利用和無(wú)害化處理的主要方式[3]。研究表明，經(jīng)50 d堆肥后，四環(huán)素、土霉素、金霉素的去除率分別為70%、92%、74%[4]。但是堆肥過(guò)程中自然微生物菌群具有不固定性，而加入篩選的高效降解菌來(lái)提高畜禽糞便堆肥中抗生素降解效果被認(rèn)為是一種高效、低成本的無(wú)害化處理方法[5]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于抗生素降解菌的研究已廣泛展開(kāi)。沈東升等[6]將其實(shí)驗(yàn)室篩選的土霉素降解菌(Staphylococcus sp.TJ-1)接種于堆肥中，發(fā)現(xiàn)TJ-1的接種可使得土霉素降解率提高20%。沈穎等[7]證明了放線菌、真菌、細(xì)菌都可以有效降解抗生素，且不同菌的最適溫度不同。成潔等[8]研究證明四環(huán)素類(lèi)降解菌TJ-2#對(duì)土霉素、四環(huán)素和金霉素3種四環(huán)素類(lèi)抗生素的降解率分別為58.3%、63.9%和65.5%，且TJ-2#能以四環(huán)素類(lèi)抗生素作為唯一碳源。勾長(zhǎng)龍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高溫堆肥對(duì)豬糞中低濃度抗生素的去除效果高于對(duì)照組。低劑量組的去除率均高于90%，而高劑量組的去除率則在60%～70%。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于抗生素降解菌的研究主要在菌株篩選與鑒定以及優(yōu)化去除效果等方面，關(guān)于外源添加降解菌對(duì)豬糞堆肥中不同濃度的抗生素去除效果的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在從豬糞中篩選四環(huán)素類(lèi)抗生素降解菌，并研究堆肥過(guò)程中外源添加降解菌對(duì)豬糞中不同濃度抗生素的去除效果，以期為豬糞中抗生素殘留問(wèn)題提供解決思路。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

本次試驗(yàn)豬糞樣品取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)及天門(mén)、荊門(mén)等地豬場(chǎng)。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母浸出物5 g，NaCI 5 g，胰蛋白胨10 g，加雙蒸水至1 000 mL，加鹽酸或NaOH調(diào)pH至7.0 ± 0.05，高溫滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。LB固體培養(yǎng)基：酵母浸出物5 g，NaCI 5 g，胰蛋白胨10 g，瓊脂粉12～18 g，加雙蒸水至1 000 mL，加鹽酸或NaOH調(diào)pH至7.0±0.05，高溫滅菌，待溫度降到60 ℃，加入抗生素，混勻后倒入滅菌干燥的培養(yǎng)皿中，超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌凝固后封口膜封口，標(biāo)注日期，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 四環(huán)素類(lèi)抗生素高效降解菌的分離鑒定

取新鮮豬糞樣品5 g于50 mL離心管中，向其中加入無(wú)菌的生理鹽水至50 mL，搖床37 ℃、200 rpm震蕩2 h，吸取上清液5 mL接種于含有四環(huán)素、金霉素、土霉素20 mg/kg的LB培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)24 h，每次接種，抗生素濃度提高20 mg/kg，接種多次后提高抗生素濃度至200 mg/kg。

將培養(yǎng)至200 mg/kg的培養(yǎng)基重新接種于200 mg/kg抗生素的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 h后，將培養(yǎng)基稀釋至10-6～10-7，吸取50～100 μL均勻涂布于200 mg/kg抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。43 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征，挑選出形態(tài)不同的細(xì)菌，分別接種于200 mg/kg抗生素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 h后，提取菌種DNA擴(kuò)增后測(cè)序，鑒定菌屬。

1.4 培養(yǎng)基中抗生素降解試驗(yàn)

稱(chēng)量胰蛋白胨20 g、酵母提取物10 g、氯化鈉10 g加水至2 000 mL，NaOH調(diào)節(jié)pH至8±0.05，120 ℃高壓滅菌20 min。待溫度冷卻后向其中加入四環(huán)素、金霉素、土霉素各0.1 g，制成100 mg/kg的抗生素培養(yǎng)基。將降解菌復(fù)蘇，吸取100 μL降解菌接種于5 mL培養(yǎng)基中，于37℃搖床200 rpm條件下培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定期。吸取穩(wěn)定期的培養(yǎng)基100 μL，接種于50 mL含抗生素100 mg/kg的LB培養(yǎng)基中，置于搖床43 ℃ ，200 rpm條件下培養(yǎng)，此為試驗(yàn)組。對(duì)照組于相同條件下接種等量的無(wú)菌培養(yǎng)基溶液。分別取0.5、1、1.5、2、3、4、5 d，7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)基樣品-40 ℃避光保存。檢測(cè)樣品中抗生素殘留量，評(píng)估降解菌的降解效果。

1.5 堆肥抗生素降解試驗(yàn)

堆肥試驗(yàn)裝置主要由6個(gè)高280 mm、長(zhǎng)540 mm、寬400 mm，容積60 L，厚度3 mm的泡沫箱組成，以保持堆體溫度，裝置底部留有小孔，供空氣從底部進(jìn)入。底部鋪3 cm左右的鋸末作為緩沖層，保證通氣量均勻。上層留有直徑2 cm的小孔作為出風(fēng)口。每個(gè)堆肥裝置中加入體積為60 L，質(zhì)量為20 kg的混合物。

本次試驗(yàn)在抗生素濃度分別為20 mg/kg(低濃度)和40 mg/kg(高濃度)下，處理組按1∶1000重量比接入降解菌劑，對(duì)照組添加等量的無(wú)菌培養(yǎng)基。將豬糞與鋸末以質(zhì)量比10∶1混合，調(diào)節(jié)C/N為20，加水調(diào)劑水分至65%左右，調(diào)整各組的抗生素濃度為20 mg/kg或40 mg/kg。降解菌劑由馴化篩選的菌株庫(kù)特氏菌、鶉雞腸球菌、糞腸球菌、變形桿菌以體積比1∶1∶1∶1制成(四種細(xì)菌菌液濃度為105～108cfu/mL)。對(duì)照組和處理組各重復(fù)3次。分別測(cè)定7 d和14 d抗生素濃度[10]。

堆肥前期每2 d取樣一次、堆肥后期每5 d取樣一次，每天測(cè)量堆體中心的溫度。堆體上、中、下三個(gè)部分多點(diǎn)取樣，樣品用保鮮袋封好，4 ℃保存。部分樣品風(fēng)干后粉碎，密封、避光保存用于檢測(cè)。

1.6 革蘭氏染色

對(duì)細(xì)菌進(jìn)行涂片、干燥、固定、染色等操作后制成標(biāo)本切片，等切片自然風(fēng)干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后滴一滴浸油在蓋玻片上，用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)及顏色。

1.7 分析測(cè)定方法

堆體中土霉素、四環(huán)素、金霉素與強(qiáng)力霉素的含量測(cè)定采用高效液相色譜法，具體操作技術(shù)流程方法參考GB/TB/T32951-2016，C、N含量通過(guò)元素分析儀測(cè)定，溫度使用酒精溫度計(jì)測(cè)定。

1.8 樣品的保存

將滅菌后的生理鹽水與甘油以體積比3∶2混合，震蕩使其充分混合均勻，此為甘油-生理鹽水保存液。將細(xì)菌接種于新鮮的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 h至穩(wěn)定期。將穩(wěn)定期的培養(yǎng)基與甘油-生理鹽水保存液以體積比1∶1混合于1.5 mL離心管中，渦旋振蕩20 s使其充分混合均勻，-80 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的分離鑒定

2.1.1 降解菌的分離、純化 經(jīng)抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)、分離、純化后共得到8株細(xì)菌，其中4株細(xì)菌對(duì)于豬糞中四環(huán)素類(lèi)抗生素具有較好的降解效果且無(wú)致病性，具備在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用的潛力(DOTC14-JM、DTC7-JM、DOTC2-TM、DOTCH-TM)。

在正常光線條件下觀察4種菌的生長(zhǎng)形態(tài)，可以明顯看出DOTC14-JM，DOTC2-TM， DTC7-JM為白色菌落，其菌落較小，呈規(guī)則的半球形，而DOTCH-TM菌落呈黃色(圖1)。經(jīng)革蘭氏染色，判斷為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)菌的生物形態(tài)為短桿菌和球菌。

2.1.2 降解菌的16S rDNA序列分析 將4種降解菌的16SrDNA提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。DOTC14-JM與細(xì)菌Enterococcus gallinarum的16SrDNA序列同源性為99%；DTC7-JM與細(xì)菌Enterococcus faecium的16SrDNA同源性為99%；DOTC2-TM與細(xì)菌Enterococcus faecalis的16SrDNA同源性為99%；DOTCH-TM與細(xì)菌Kurthia gibsonii的16SrDNA同源性為99%(圖2)。綜合判定菌株DOTC14-JM為鶉雞腸球菌、菌株DTC7-JM為屎腸球菌、菌株DOTC2-TM為糞腸球菌、菌株DOTCH-TM為庫(kù)特氏菌。

2.2 培養(yǎng)基中抗生素降解效果的檢測(cè)

2.2.1 3種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 在監(jiān)測(cè)體系中土霉素、四環(huán)素和金霉素的保留時(shí)間分別為3.343 min、3.730 min以及7.026 min。3種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，表明在標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍內(nèi)，進(jìn)樣濃度與吸收峰面積有良好的線性關(guān)系，符合定量檢測(cè)的條件。

2.2.2 抗生素的降解 培養(yǎng)基中3種抗生素的殘留量如圖4所示。從圖4可以看出，培養(yǎng)基中的金霉素與四環(huán)素、土霉素相比更容易降解，在2 d后其降解量達(dá)到90%以上，這與金霉素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān)。在第4天金霉素的濃度較前3 d有所上升，這是由于四環(huán)素抗生素在代謝過(guò)程產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物會(huì)重新轉(zhuǎn)化為母體化合物，導(dǎo)致金霉素濃度上升。6 d試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)得金霉素、土霉素、四環(huán)素含量均大幅度下降，與對(duì)照組相比添加菌株庫(kù)特氏菌、鶉雞腸球菌、糞腸球菌、變形桿菌四種菌的培養(yǎng)基中土霉素和四環(huán)素的殘留量均有明顯降低(P<0.05)，金霉素含量無(wú)明顯降低趨勢(shì)(P>0.05)。

2.3 不同條件對(duì)四種細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

由表1可知，在較高的抗生素濃度(50 mg/kg)下，糞腸球菌、鶉雞腸球菌、庫(kù)特氏菌三種降解菌的生長(zhǎng)均受到抑制，在高溫(50 ℃)下這三種降解菌的生長(zhǎng)也受到明顯的抑制。其中糞腸球菌最適的生長(zhǎng)溫度為37 ℃，最適生長(zhǎng)pH為8左右。鶉雞腸球菌在較高的溫度下(43 ℃)有著更好的生長(zhǎng)效果，其最適生長(zhǎng)pH為7。庫(kù)特氏菌在pH=7、pH=8均可以良好地生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃。在pH=6的培養(yǎng)基中，糞腸球菌、鶉雞腸球菌、庫(kù)特氏菌三種降解菌生長(zhǎng)速度低于pH=7、pH=8、pH=9的生長(zhǎng)速度。屎腸球菌在高濃度抗生素(50 mg/kg)和高溫(50 ℃)條件下生長(zhǎng)狀況明顯好于其他三種菌，表現(xiàn)出對(duì)于高濃度抗生素和高溫的耐受性，其在pH=7、8、9時(shí)均能良好生長(zhǎng)，酸性條件(pH=6)對(duì)其生長(zhǎng)有一定抑制作用。

2.4 堆體溫度的變化

堆肥初期溫度迅速上升，在第一天堆體溫度達(dá)到50 ℃左右(圖5)，在低抗生素濃度(20 mg/kg)下外源添加降解菌株與對(duì)照組無(wú)明顯差異，在第3～4天溫度達(dá)到最高溫度60 ℃左右，整個(gè)堆肥進(jìn)程中，對(duì)照與處理組溫度變化較為一致，并無(wú)顯著性差異。

2.5 堆體抗生素的變化

在20 mg/kg下，7 d對(duì)照組與處理組土霉素的殘留率分別為43.2%和37.3%，四環(huán)素的殘留率分別為26.3%、27.7%。14 d對(duì)照組與處理組土霉素的殘留率分別為16.8%、17.3%，四環(huán)素殘留率為17.2%、17.9%。在40 mg/kg下，7 d處理組金霉素降解率就達(dá)到96.75%，對(duì)照組與處理組的土霉素殘留率分別為25.7%、20.5%，四環(huán)素殘留率分別為16.9%和16.5%。14 d對(duì)照組與處理組土霉素殘留率分別為11.5%和9.6%(圖6)。

3 討 論

抗生素的降解方式有多種，包括吸附降解、水解、光解和生物降解等，其中生物降解是抗生素在環(huán)境中降解的重要途徑[10]。已報(bào)道的四環(huán)素類(lèi)抗生素降解菌包括蠟樣芽孢桿菌、缺陷短波單胞菌、人蒼白桿菌、無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌等[11-14]。本研究中篩選獲得的鶉雞腸球菌、糞腸球菌、庫(kù)特氏菌、屎腸球菌在四環(huán)素類(lèi)抗生素降解菌的研究報(bào)道中較少見(jiàn)，擴(kuò)大了四環(huán)素類(lèi)抗生素降解菌的菌源，使得在堆肥過(guò)程中利用外源微生物降解四環(huán)素類(lèi)抗生素時(shí)有更多菌種選擇。

降解菌的生長(zhǎng)狀況受溫度、初始pH、初始抗生素濃度等因素的影響，且不同菌種的最適生長(zhǎng)條件可能不同。本研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌、鶉雞腸球菌、庫(kù)特氏菌生長(zhǎng)的最適溫度均為37 ℃，而屎腸球菌的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃和43 ℃，四種菌在50 ℃條件下的生長(zhǎng)狀況均受到抑制。屎腸球菌在43 ℃的生長(zhǎng)狀況良好，表明其對(duì)較高溫度(43 ℃)的耐受性好。吳學(xué)玲等[14]研究了四環(huán)素類(lèi)降解菌拉烏爾菌XY-1受溫度變化的影響情況，發(fā)現(xiàn)其最適生長(zhǎng)溫度是25 ℃，并隨溫度升高其對(duì)四環(huán)素的降解率呈現(xiàn)先升高再平穩(wěn)后緩慢降低的趨勢(shì)，降解菌XY-1在第8 d對(duì)四環(huán)素的降解率達(dá)到70.68%。糞腸球菌、庫(kù)特氏菌、屎腸球菌生長(zhǎng)的最適pH為8，而鶉雞腸球菌生長(zhǎng)的最適pH為7，四種菌在酸性條件下(pH=6)均受到抑制作用，其中在糞腸球菌生長(zhǎng)的前6 d，酸性條件對(duì)其抑制明顯，但抑制作用隨著時(shí)間的推移逐漸減弱，這可能是由于糞腸球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)釋放某些堿性物質(zhì)。高濃度(50 mg/kg)的抗生素對(duì)糞腸球菌、鶉雞腸球菌、庫(kù)特氏菌均具有很強(qiáng)的抑制作用，屎腸球菌在高抗生素濃度(50 mg/kg)條件下長(zhǎng)勢(shì)較好，說(shuō)明其對(duì)高抗生素濃度(50 mg/kg)具有較好的耐受性。

堆肥技術(shù)可以有效降解畜禽糞便中的抗生素，但是在實(shí)際應(yīng)用中其降解時(shí)間較長(zhǎng)。有研究報(bào)道，在堆肥中加入降解菌劑后四環(huán)素類(lèi)抗生素的降解效果明顯加快[10]。張樹(shù)清等[15]研究了高溫堆肥條件下復(fù)合微生物菌劑對(duì)堆肥材料中抗生素的降解效果，結(jié)果表明外源添加降解菌劑有助于抗生素的去除。本研究將篩選的四株降解菌等比例制成復(fù)合菌劑添加到不同抗生素濃度的豬糞中進(jìn)行堆肥處理后發(fā)現(xiàn)，其對(duì)于較高濃度(40 mg/kg)的抗生素具有更好的處理效果。在20 mg/kg(低濃度)下，處理組與對(duì)照組的四環(huán)素類(lèi)抗生素去除率差異不顯著。在40 mg/kg(高濃度)下，金霉素在7 d降解率就達(dá)到96.75%。 在土霉素濃度為40 mg/kg下，在7 d對(duì)照組與處理組的土霉素降解率分別為74.26%、79.46%，土霉素降解率差異極顯著，但在14 d對(duì)照組與處理組差異不顯著，土霉素降解率分別為87.1%和85.8%，表明在堆肥過(guò)程中外源添加本研究所篩選的菌種可以加快土霉素的降解速率，但對(duì)最終的土霉素去除效果影響不顯著。在四環(huán)素濃度為40 mg/kg下，堆肥7 d后對(duì)照組與處理組的四環(huán)素去除率分別為83.09%和83.49,差異不顯著，堆肥14 d后去除率分別為88.5%和90.4%，差異極顯著，表明外源添加本研究篩選的菌株可以增強(qiáng)堆肥豬糞中四環(huán)素的降解效果，為構(gòu)建降解多類(lèi)抗生素環(huán)保菌劑奠定基礎(chǔ)，具有較強(qiáng)的潛在應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，篩選出的4株四環(huán)素類(lèi)抗生素降解菌，外源添加至豬糞堆肥中可以加速堆肥腐熟，降低豬糞中四環(huán)素類(lèi)抗生素的殘留量。