翁亞煩，李志勛，邱丙珊，楊圳超，劉 平，信吉閣，富國文，趙桂英*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650201)

小型豬不僅具有肉嫩味美、皮薄肉香、抗逆性強、耐粗飼、體小早熟等諸多優(yōu)點，部分器官生理結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)與人類還極其相似，臟器重量亦與人類相接近，是較為理想的研究人類相關(guān)疾病的模型動物[1]。云南小型豬資源豐富，擁有滇南小耳豬、迪慶藏豬、明光小耳豬等小型豬種資源。滇南小耳豬分布于云南南部的熱帶和亞熱帶地區(qū)，耐高溫潮濕，是我國著名的地方豬種之一[2]。迪慶藏豬分布于迪慶州中北部高寒山區(qū)和半山區(qū)，屬于高原地帶；明光小耳豬分布于騰沖縣明光鄉(xiāng)、曲石鄉(xiāng)、界頭鄉(xiāng)等地，在中緬邊境交通閉塞山區(qū)也有分布[3]。研究云南六個小型豬之間的親緣關(guān)系，為其遺傳資源的有效保護(hù)和開發(fā)利用提供參考。自1962年Nass等[4]發(fā)現(xiàn)了線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)的存在后，許多學(xué)者對核外遺傳系統(tǒng)開展了大量的研究工作。線粒體DNA作為動物體內(nèi)一種長期穩(wěn)定存在的核外遺傳物質(zhì)，具有重組率低、替換速度快、嚴(yán)格母系遺傳、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點被廣泛用于動物起源進(jìn)化和遺傳多樣性等研究[5-6]。D-loop基因是mt DNA的控制區(qū)，在整個mt DNA序列中變異最大，進(jìn)化速度快。Touma[7]從mt DNA控制區(qū)研究沖繩本地阿古豬，表明阿古豬的祖先起源于亞洲大陸。到目前為止，關(guān)于云南省內(nèi)小型豬親緣關(guān)系的研究報道甚少。本試驗利用線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)D-loop高變區(qū)為標(biāo)記，研究云南四個地區(qū)的滇南小耳豬(版納小耳豬、盈江小耳豬、金平小耳豬、芒市小耳豬)、迪慶藏豬、明光小耳豬之間的親緣關(guān)系，以期從分子水平揭示云南六個小型豬的遺傳多樣性及其分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集滇南小耳豬、明光小耳豬和迪慶藏豬耳組織共60份，其中滇南小耳豬包括版納小耳豬(BS)、盈江小耳豬(YJ)、金平小耳豬(JP)、芒市小耳豬(MS)，各10份，置于1.5 mL離心管中，加入75%酒精，-20 ℃貯藏，備用。

1.2 試驗方法

2.2.1 豬全基因組DNA的提取 采用常規(guī)酚/氯仿抽提方法提取耳組織DNA。采用常規(guī)酚/氯仿抽提方法提取豬耳組織DNA。取約10 g的6個小型豬耳組織置于1.5 mL規(guī)格的離心管中剪碎，待酒精揮發(fā)后每管分別加入蛋白酶K(10 mg/mL)溶液和DNA組織提取液，過夜消化。消化完全后，加入Tris飽和酚，離心取上清液。將酚：氯仿：異戊醇混合液(25∶24∶1)加入吸取的上清液中，進(jìn)行抽提。加入氯仿：異戊醇混合液(24：1)進(jìn)行第二次抽提，重復(fù)該步驟一次。加入無水乙醇，沉淀DNA后倒掉無水乙醇，加入70%的乙醇洗滌DNA。最后加入TE緩沖液以溶解DNA，放入37 ℃水浴鍋中助溶過夜，然后在68 ℃條件下水浴約25 min滅活，瞬時離心，保存在-20 ℃環(huán)境下長期貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的片段擴增與測序 根據(jù)發(fā)表在GenBank公共數(shù)據(jù)庫提供的中國地方豬的線粒體DNA的全系列基因組，采用Premer5.0軟件設(shè)計引物，上游引物為5'-AGACTAACTCCGCCATCAG-3'，下游引物為5'-CGCGGATACTTGCATGTGT-3'，引物由擎科生物工程技術(shù)有限公司合成。

PCR擴增體系(25 μL)為：DNA模板1.5 μL，1.1x T3 Super PCR Mix21.5 μL，上下游引物各1 μL。PCR條件：94 ℃，預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，55.5 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共計30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測后，合格的樣品送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用軟件Chromas檢查測序結(jié)果，運用軟件DNAMAN進(jìn)行序列拼接、比對，使用MEGA6的NJ法繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

通過PCR擴增的mtDNA D-loop序列，以DNA Marker(DL2000)作為參照，確定PCR產(chǎn)物的片段大小。引物PCR擴增片段與預(yù)期目的片段大小一致，條帶單一，同時條帶無二聚體存在，明亮清晰，整齊，無拖帶，結(jié)果如圖1所示。

2.2 mtDNA D-loop區(qū)堿基含量及其比例

六個豬種(A+T)/(G+C)的比分別是：1.33、1.32、1.35、1.31、1.35、1.56。所檢測豬群豬線粒體DNA D-loop區(qū)內(nèi)(G+C)含量平均為42.3%，低于(A+T)含量，這與脊椎動物線粒體DNA D-loop區(qū)堿基組成的特點相符合，結(jié)果見表1。

2.3 mtDNA D-loop區(qū)部分位點堿基比較

六個小型豬的mtDNA D-loop區(qū)堿基序列經(jīng)MEGA比對、剪接，分析序列共1 030 bp，共有9個堿基位點存在差異，結(jié)果見表2。

表1 堿基含量及其比例Table 1 Base content and its proportion

表2 6個小型豬 mt DNA D-loop區(qū)部分位點堿基比較Table 2 Base comparison of partial sites in mt DNA D-loop region of six mini-pigs

2.4 遺傳距離分析

對六個小型豬豬群進(jìn)行兩兩之間比較，計算進(jìn)化距離，結(jié)果見表3。迪慶藏豬與版納小耳豬的遺傳距離最遠(yuǎn)；芒市小耳豬與盈江小耳豬、版納小耳豬與金平小耳豬遺傳距離最近；迪慶藏豬與明光小耳豬、金平小耳豬與明光小耳豬遺傳距離中等。

2.5 構(gòu)建進(jìn)化樹

引用梅山豬作為外系，利用MEGA鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹結(jié)果如圖2所示。梅山豬作為單獨的一支，與云南四個地區(qū)的滇南小耳豬(版納小耳豬、盈江小耳豬、金平小耳豬、芒市小耳豬)、迪慶藏豬、明光小耳豬無雜交。6個小型豬群中，版納小耳豬(BN)與迪慶藏豬(DQ)遺傳距離最遠(yuǎn)；版納小耳豬(BN)、盈江小耳豬(YJ)、金平小耳豬(JP)與芒市小耳豬(MS)屬于同一個大的分支，其中，盈江小耳豬(YJ)與芒市小耳豬(MS)屬于同一個小的分支，版納小耳豬(BN)與金平小耳豬(JP)又屬于同一個小支；明光小耳豬(MG)與迪慶藏豬(DQ)屬于另一個大的分支。

表3 6個小型豬遺傳距離比較Table 3 Comparison of genetic distances of six small pigs

3 討 論

3.1 mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性

mtDNA結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定，遵守母性遺傳方式，在世代傳遞過程中沒有重組，因而對mtDNA的研究可用于探討豬種的起源進(jìn)化及親緣關(guān)系分析[8]。本研究對云南六個小型豬群(版納小耳豬、盈江小耳豬、明光小耳豬、金平小耳豬、迪慶藏豬、芒市小耳豬)線粒體DNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行測序，DNA D-loop區(qū)內(nèi)(G+C)含量平均為42.3%，低于(A+T)含量，表現(xiàn)出明顯的AT偏移性，這與脊椎動物線粒體DNA D-loop區(qū)堿基組成的特點相符合。豬線粒體DNA D-loop區(qū)除了突變現(xiàn)象外，還存在少數(shù)堿基缺失或插入及不同數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)序列，因而長度可變。本研究測序結(jié)果顯示，6個豬群線粒體DNA D-loop區(qū)序列長度在1 036～1 292 bp之間，且個別個體存在插入或者缺失現(xiàn)象。

本研究的依據(jù)是序列從一個共同祖先出現(xiàn)分化。由于突變的存在，而且其中一小部分突變會在群體進(jìn)化中被固定下來，但這些位點是隨機突變的，一些位點有可能突變了2次，比如從A突變?yōu)镚，然后再從G又突變?yōu)門，而這時我們僅能觀測到1次變化。同樣，如果一個位點從A突變?yōu)镚又突變?yōu)锳，共計突變了兩次，但我們卻觀測不到這樣的突變。像這樣同一位點上出現(xiàn)多次替代，而樣本含量不夠時，很有可能會導(dǎo)致低估了在分支上出現(xiàn)的突變數(shù)量，這是本實驗有待改進(jìn)的地方。

4.2 6個小型豬的親緣關(guān)系

種間遺傳距離表明不同種群之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近[9]。本研究結(jié)果表明6個小型豬豬群中，明光小耳豬(MG)與迪慶藏豬(DQ)遺傳距離較近。此次采樣的明光小耳豬屬于華南型與高原型過渡類型，產(chǎn)于云南省騰沖縣，且大多數(shù)明光小耳豬生活在海拔在1 000～3 000的高寒山區(qū)，以明光鄉(xiāng)為中心產(chǎn)區(qū)[10]。迪慶藏豬是典型的高原豬種之一，也是世界上分布海拔最高地區(qū)的豬種之一，主要分布于我省迪慶藏族自治州、怒江州的貢山和麗江地區(qū)的寧蒗、麗江等縣，部分分布在海拔3 000 m以上高山地區(qū)，其余分布在海拔2 000～3 000 m半山區(qū)與海拔2 000 m以下的河谷區(qū)，能適應(yīng)高原低氧環(huán)境和惡劣的自然條件[11]。由于明光小耳豬分布的騰沖地區(qū)與迪慶藏豬分布的迪慶地區(qū)海拔與氣候在一定程度具有相似性，導(dǎo)致明光小耳豬(MG)與迪慶藏豬(DQ)遺傳距離較近。

另一結(jié)果顯示迪慶藏豬(DQ)與版納小耳豬(BN)遺傳距離最遠(yuǎn)。從氣候方面來看，兩個地方的環(huán)境差異較大，迪慶地區(qū)屬溫帶-寒溫帶氣候，而西雙版納地區(qū)屬熱帶氣候地處低緯度高原，太陽輻射量大，是全國的光照高質(zhì)區(qū)之一，熱量豐富，終年溫暖。并且在地理位置上，迪慶地區(qū)與西雙版納地區(qū)相距最遠(yuǎn)，可能兩者因距離較遠(yuǎn)而發(fā)生基因交流的機會甚少，再加上較大的環(huán)境差異，導(dǎo)致迪慶藏豬與版納小耳豬遺傳距離最遠(yuǎn)。

通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，四個地方(西雙版納、芒市、盈江縣、金平縣)的滇南小耳豬聚為一類，它們在進(jìn)化中屬于同一支，這從一定程度上顯示出云南不同地方所飼養(yǎng)的滇南小耳豬血緣仍較純，豬種間基因交流較少。歐陽依娜等研究10個云南地方豬種微衛(wèi)星遺傳多樣性，結(jié)果表明位于云南省西北部相鄰兩個地區(qū)的高黎貢山豬與迪慶藏豬聚為一小支，再與地理距離較近的西北部的麗江豬、西南部的保山豬及西部的明光小耳豬聚為一大支[12]。本實驗中明光小耳豬(MG)和迪慶藏豬(DQ)屬于同一個大的分支這一結(jié)果與歐陽依娜等的研究結(jié)果相似。

6個小型豬群中，西雙版納小耳豬與迪慶藏豬遺傳距離最遠(yuǎn)，符合兩個種群豬種類型不同，生活環(huán)境差異大且生活的地理距離最遠(yuǎn)的特點；版納小耳豬與金平小耳豬兩個種群的地理位置較近，系統(tǒng)樹顯示遺傳距離最近，屬于同一分支；芒市小耳豬、版納小耳豬、盈江小耳豬與金平小耳豬聚為一類，同屬于滇南小耳豬。明光小耳豬與迪慶藏豬屬于同一支，符合它們豬種類型與地理位置相近的特征。綜上，六個小型豬群群體遺傳距離的大小與其相對地理距離的遠(yuǎn)近和豬種類型基本吻合。