于 鵬 葉海斌 單洪偉 馬 甡 王 騰

凡納濱對蝦養(yǎng)殖體系中群體感應(yīng)淬滅菌的篩選、安全性評估及發(fā)酵條件優(yōu)化*

于 鵬1,2葉海斌2單洪偉1①馬 甡1王 騰1

(1. 中國海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室 青島 266003;2. 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 山東省海洋生物研究院 青島 266104)

從凡納濱對蝦()養(yǎng)殖體系中篩選得到具有群體感應(yīng)淬滅(Quorum quenching, QQ)活性的潛在功能菌，并對菌株進行16S rDNA鑒定、安全性評估及發(fā)酵條件優(yōu)化。采用根癌農(nóng)桿菌() A136液體X-gal法進行活性菌株篩選，發(fā)現(xiàn)2株細菌(BDZ5和W1B)的發(fā)酵液對信號分子己?；呓z氨酸內(nèi)酯(C6-HSL)具有顯著的降解作用，但經(jīng)沸水浴處理后均喪失降解活性。經(jīng)16S rDNA基因序列分析，菌株BDZ5和W1B分別被鑒定為芽孢桿菌屬()和科貝特氏菌屬()。安全性評估結(jié)果顯示，菌株BDZ5和W1B均無溶血性，且對多數(shù)抗生素具有敏感性，注射2株活性菌未提高凡納濱對蝦死亡率，且對凡納濱對蝦血清免疫酶活性無顯著影響。單因素條件優(yōu)化結(jié)果顯示，在起始pH為7.0、鹽度為20、0.0005%的MnCl2條件下培養(yǎng)48 h后，菌株BDZ5達到最大生長量；在起始pH為6.0、鹽度為40、0.05%的CaCl2條件下培養(yǎng)48 h，菌株W1B達到最大生長量。2株菌的最適信號分子C6-HSL降解條件與其生長條件有所不同，在起始pH為7.5、鹽度為30、0.0005%的MnCl2條件下培養(yǎng)48 h，2株活性菌對信號分子C6-HSL的降解率達到最大值。研究表明，菌株BDZ5和W1B可作為益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，為基于QQ角度防治對蝦細菌性病害提供優(yōu)良菌種。

凡納濱對蝦；細菌性病害防治；群體感應(yīng)淬滅菌株；安全性；條件優(yōu)化

隨著凡納濱對蝦()養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，急性肝胰腺壞死綜合征(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND) (Soto- Rodriguez, 2015)、發(fā)光病(Luminous Bacterial Disease) (Lavilla-Pitogo, 1990)、紅體病(Red Body Disease) (Cao, 2014)等細菌性病害頻發(fā)，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，阻礙了其進一步健康發(fā)展。使用抗菌藥物是控制細菌性病害的主要方法，但會造成病原菌耐藥性的產(chǎn)生，并對生態(tài)環(huán)境及人類健康有危害(Elmahdi, 2016)。因此，亟待探索新的環(huán)境友好型的對蝦細菌性病害防治手段。

群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)是廣泛存在于細菌之間的一種特殊的通訊手段，細菌可以通過向環(huán)境中釋放特定的信號分子，如不同碳鏈長度的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoscrine lactones, AHLs)、自誘導(dǎo)肽(Autoinducing peptides, AIPs)和自誘導(dǎo)物-2 (Autoinducter-2, AI-2)等，并通過感知信號分子濃度的變化調(diào)控特定基因的表達(Whiteley, 2017)。對蝦養(yǎng)殖過程中常見的病原菌包括哈維氏弧菌()、坎貝氏弧菌()、副溶血弧菌 ()等(Austin, 2006; Haldar, 2011; Joshi, 2014)。Ng等(2009)研究表明，多數(shù)病原菌的毒力因子表達及致病性的產(chǎn)生與其QS系統(tǒng)具有密切聯(lián)系。抑制病原菌的QS系統(tǒng)，即群體感應(yīng)淬滅(Quorum quenching, QQ) (Grandclément, 2015)可以在不殺死病原菌的前提下減輕其致病性 (王巖等，2017)。Tinh等(2007)曾從凡納濱對蝦體內(nèi)篩選得到3株QQ菌，并發(fā)現(xiàn)該3株菌能對哈維氏弧菌產(chǎn)生的信號分子起到降解作用，進而調(diào)控其代謝活動。Vinoj等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，具有QQ功能的地衣芽孢桿菌()能有效減少由副溶血弧菌引起的印度明對蝦()死亡率。這些研究均表明，基于QQ角度防治水產(chǎn)動物細菌性病害問題的可行性及巨大潛力。

本研究以根癌農(nóng)桿菌() A136株為報告菌，在實驗室已篩選得到的菌株基礎(chǔ)上，進一步采用Tang等(2013)所構(gòu)建的A136液體X-gal法，從凡納濱對蝦體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境中篩選到具有QQ功能的活性菌株，探討了活性菌株的安全性，并通過單因素實驗探究了不同培養(yǎng)條件對活性菌株生長及其對己酰基高絲氨酸內(nèi)酯(C6-HSL)降解率的影響，為基于QQ角度防治對蝦細菌性病害提供優(yōu)良菌種和基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 群體感應(yīng)猝滅菌株的篩選

從健康凡納濱對蝦體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境中分離出純菌株后，以根癌農(nóng)桿菌A136株為報告菌，參照并改進Tang等(2013)所構(gòu)建的A136液體X-gal法進行QQ菌的篩選。A136于培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、H2O 1000 ml、pH 7.0；滅菌后加入終濃度為50 μg/ml的壯觀霉素和終濃度為4.5 μg/ml的四環(huán)素)中活化24 h后，調(diào)節(jié)OD600=0.5，并按1%接種量接種于新的A136培養(yǎng)基中，加入終濃度為250 μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)共同培養(yǎng)24 h。待測菌株在LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 30 g、H2O 1000 ml、pH 7.2~7.4)中活化24 h后稀釋至OD600 nm=0.5，然后，按2%接種量接種于新的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。取178 μl培養(yǎng)好的待測菌發(fā)酵液與2 μl 5 mmol/L的信號分子C6-HSL (Cayman Chemical公司, 美國)及20 μl哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPEs)緩沖液(1 mol/L, pH 6.7)混合，制成孵育體系，并于30℃條件下孵育。陽性對照(Positive control, PC)組的孵育體系中，以178 μl無菌LB液體培養(yǎng)基代替待測菌發(fā)酵液，陰性對照(Negative control, NC)組中無信號分子C6-HSL。孵育24 h后，離心(9570×, 10 min)取上清液10 μl，與190 μl培養(yǎng)好的A136菌液混合加入96孔板中培養(yǎng)12 h。測定混合體系的OD630 nm和OD490 nm，根據(jù)公式：

計算β-gal活性，活性越高表明混合體系中信號分子C6-HSL的含量越高，即待測菌株的QQ活性越弱。同時，通過檢測活性菌株AHL降解活性的耐熱性，初步判斷活性菌株是否存在AHL降解酶。將篩選出的活性菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，沸水浴處理5 min，再采用A136液體X-gal法檢測其C6-HSL降解活性是否喪失。

1.2 菌株16S rDNA鑒定

測定活性菌株的基因16S rDNA序列，并于NCBI進行基因序列同源性比較分析，利用MEGA 5.0軟件鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。目標(biāo)菌株的16S rDNA序列由生工生物工程(上海)股份有限公司提取并測定。

1.3 活性菌株的體外安全性評估

1.3.1 溶血性 采用濾紙片法(王曉琳等, 2016)檢測活性菌株的溶血性，血瓊脂平板培養(yǎng)基購自貝瑞特生物技術(shù)(鄭州)有限責(zé)任公司。將無菌濾紙片置于血瓊脂培養(yǎng)基上方，將培養(yǎng)好的活性菌株發(fā)酵液稀釋至OD600 nm=1.0后，取10 μl加在濾紙片上，每個功能菌重復(fù)3次，30℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察血瓊脂培養(yǎng)基上是否有溶血圈產(chǎn)生。

1.3.2 藥敏性 采用抗菌藥物藥敏紙片瓊脂擴散法(K-B法)(王嵐等, 2017)進行活性菌株藥敏性實驗，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。將活性菌株接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，取100 μl OD600 nm=1.0的發(fā)酵液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，并將藥敏紙片貼于上方，每種藥敏紙片重復(fù)3次。在30℃條件下，培養(yǎng)24 h后，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)–2011的標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株對各抗生素的敏感性。

1.4 活性菌株的體內(nèi)安全性評估

1.4.1 實驗對蝦與菌株 實驗凡納濱對蝦購自山東乳山某對蝦養(yǎng)殖場，平均體長為(5.7±0.4) cm，平均體重為(1.9±0.9) g，體色正常，游泳活潑，暫養(yǎng)7 d后進行實驗。

從上述實驗中篩選得到的菌株BDZ5和W1B作為實驗材料，以實驗室前期保存的副溶血弧菌為PC組。將各菌株于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后離心(1531×, 10 min)，棄上清液，并用無菌生理鹽水稀釋至濃度為1×106和1×104CFU/ml的菌懸液。

1.4.2 實驗設(shè)計 采用肌肉注射的方法進行體內(nèi)安全性評估，注射部位為凡納濱對蝦第Ⅳ、Ⅴ腹節(jié)之間，注射劑量為50 μl/尾。實驗共分為7組，陰性對照組(NC組)注射等劑量的無菌生理鹽水；L-BDZ5、L-W1B和L-PC組為低濃度(Low, L-)菌液組，分別注射濃度為1×104CFU/ml的BDZ5、W1B和副溶血弧菌菌懸液；H-BDZ5、H-W1B和H-PC組為高濃度(High, H-)菌液組，即分別注射濃度為1×106CFU/ml的相應(yīng)菌懸液。每組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)放15只蝦。實驗持續(xù)96 h，實驗期間，不投喂，不換水，連續(xù)充氧。

1.4.3 樣本采集與指標(biāo)測定 實驗期間，定期觀察、記錄凡納濱對蝦的死亡情況并計算累積死亡率。在實驗的第96小時采集各實驗組對蝦的血清，用于免疫指標(biāo)的測定。免疫指標(biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、溶菌酶(LZM)活力和抗菌酶活力(a)。其中，SOD、NOS和LZM活力采用南京建成生物科技有限公司試劑盒測定；a的測定參照Xu等(2013)的方法，將哈維氏弧菌用磷酸鉀鹽緩沖溶液(1 mol/L, pH=6.4)稀釋成OD570 nm=0.4的菌懸液，在試管(冰水浴條件下)中加入3 ml哈維氏弧菌菌懸液和50 μl血清，混勻后立即測定其OD570 nm值1，再將試管于37℃條件下水浴30 min，立即取出并測定其OD570 nm值2，根據(jù)公式：a=[(1–2)/2]1/2計算a。

1.5 活性菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

以LB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用分光光度計法探究不同發(fā)酵條件對菌株生長的影響，采用1.1中的A136液體X-gal法探究不同發(fā)酵條件對菌株降解信號分子C6-HSL能力的影響。

培養(yǎng)時間：保持其他條件一致，設(shè)置12、24、36、48和60 h共5個發(fā)酵時間，在28℃、180 r/min條件下，培養(yǎng)以探究功能菌的最適培養(yǎng)時間。

起始pH：設(shè)置5.0、6.0、7.0、7.5和8.0共5個起始pH，其他條件一致，在28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，以確定最適起始pH。

鹽度：向培養(yǎng)基中添加NaCl，設(shè)置0、10、20、30和40共5個鹽度，在其他發(fā)酵條件及發(fā)酵時間一致的情況下，探究最適發(fā)酵鹽度。

金屬離子：參照葉云峰等(2011)的方法，根據(jù)菌株對K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+和Mn2+利用情況的差 異，按0.5%的量加入K2HPO4?3H2O，按0.05%的量加入MgSO4?7H2O和CaCl2,按0.0005%的量加入FeSO4?7H2O和MnCl2，保持其他發(fā)酵條件及發(fā)酵時間一致，確定最適發(fā)酵金屬離子。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，運用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。分析之前測試數(shù)據(jù)的正態(tài)性(Shapiro-wilk test)和方差齊性(Levene's test)，若數(shù)據(jù)不具有方差齊性，則對數(shù)據(jù)進行l(wèi)g轉(zhuǎn)化并進一步測試。采用Tukey多重比較檢驗對符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)進行單因素方差(One-way ANOVA)分析。對于不符合正態(tài)分布及l(fā)g轉(zhuǎn)化后仍不具有方差齊性的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗并通過Kruskal-Wallis測試進行顯著性差異分析。<0.05表示各組數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體感應(yīng)淬滅活性菌株的篩選

經(jīng)A136液體X-gal法篩選發(fā)現(xiàn)，2株細菌(BDZ5和W1B)的菌液對信號分子C6-HSL具有顯著的降解作用(<0.05)(圖1)，且經(jīng)沸水處理后，2株QQ活性菌株均喪失了C6-HSL降解活性。

2.2 活性菌株16S rDNA鑒定結(jié)果

菌株BDZ5和W1B的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。從圖2可以看出，BDZ5被鑒定為芽孢桿菌屬()，且與枯草芽孢桿菌()具有最高的相似度(100%)，W1B被鑒定為科貝特氏菌屬()，且與海科貝特氏菌()親緣關(guān)系最近(98%)。

2.3 體外安全性評估結(jié)果

從圖3可以看出，菌株BDZ5和菌株W1B在血平板上無明顯的溶血現(xiàn)象，表明菌株BDZ5和W1B在該實驗條件下不產(chǎn)生溶血素。藥物敏感性實驗結(jié)果顯示(表1)，菌株BDZ5對頭孢氨芐(Cephalexin)、頭孢唑林(Cefamezin)、頭孢拉定(Cefradine)等13種抗生素高度敏感；對苯唑西林(Oxacillin)中度敏感；菌株W1B對羧芐西林(Carbenicillin)、頭孢他啶(Ceftazidime)、頭孢曲松(Ceftriaxone)等8種抗生素高度敏感；對氨芐西林(Ampicillin)、哌拉西林(Piperacillin)、頭孢氨芐(Cephalexin)等8種抗生素中度敏感。

圖1 2株活性菌株菌液的標(biāo)準(zhǔn)化β-半乳糖苷酶(β-gal)活性

H-：沸水浴后的菌液；PC：陽性對照組；NC：陰性對照組。不同字母表示各組間差異顯著(<0.05)

H-: The bacteria after boiling water bath; PC: Positive control; NC: Negative control. Different letters indicate significant differences between groups (<0.05)

2.4 感染細菌后各組凡納濱對蝦累積死亡率

注射感染96 h后，L-BDZ5、H-BDZ5、L-W1B和H-W1B組凡納濱對蝦累積死亡率均低于NC組，且H-W1B組最低(圖4)，但與NC組相比無顯著差異(>0.05)。L-PC和H-PC組累積死亡率均高于NC組，且H-PC組最高，與NC組之間相比無顯著差異(> 0.05)。此外，H-PC組的凡納濱對蝦累積死亡率顯著高于H-W1B組(<0.05)。

圖2 菌株BDZ5和W1B基于Neighbor-Joining方法的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(比例尺代表遺傳距離)

圖3 菌株BDZ5和W1B溶血性實驗

2.5 感染細菌后各組對蝦血清免疫酶活性

注射1×104CFU/ml的BDZ5菌懸液使凡納濱對蝦血清中SOD活性顯著提高(<0.05)(圖5A)，其余各組與NC組相比無顯著差異(>0.05)；注射不同濃度的BDZ5和W1B菌懸液對凡納濱對蝦血清中的NOS活性無顯著影響(>0.05) (圖5B)，但觀察到H-PC組凡納濱對蝦血清中NOS活性顯著高于NC組(<0.05)；各組凡納濱對蝦血清中LZM活性與NC組相比均無顯著差異(>0.05) (圖5C)，但H-W1B組的LZM活性顯著高于H-PC組(<0.05)；注射不同濃度的BDZ5和W1B菌懸液對凡納濱對蝦血清中的抗菌酶活性無顯著影響(>0.05)(圖5D)，但注射1×106CFU/ml的副溶血弧菌菌懸液使凡納濱對蝦血清中抗菌酶活性顯著降低(<0.05)。

2.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株BDZ5和W1B的生長及信號分子C6-HSL降解率均逐漸提高(圖6A、圖7A)，48 h時達到最高，繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，菌株BDZ5和W1B的生長及信號分子C6-HSL降解率呈下降趨勢。起始pH為7.0時，最有利于菌株BDZ5生長(圖6B)；起始pH為7.5時，菌株BDZ5的信號分子C6-HSL降解率達到最高。起始pH為6時，菌株W1B生長最好(圖7B)；起始pH為7.5時，菌株W1B對信號分子C6-HSL的降解率最高。菌株BDZ5的生長隨鹽度的提高呈先上升后下降的趨勢(圖6C)，鹽度為20條件下，菌株BDZ5生長情況最好；當(dāng)鹽度為30時，菌株BDZ5對信號分子C6-HSL的降解率達到最高。菌株W1B在鹽度≤20的條件下無法培養(yǎng)(圖7C)，且在鹽度為40條件下的生長情況顯著好于鹽度為30 (<0.05)；但在鹽度為30條件下，菌株W1B對信號分子C6-HSL的降解率顯著高于鹽度為40 (<0.05)。培養(yǎng)基中添加一定量的Mn2+和Fe2+使菌株BDZ5的生長顯著提高(<0.05)(圖6D)，其中，Mn2+的效果最好；且Mn2+能顯著提高菌株BDZ5對信號分子C6-HSL的降解能力(<0.05)。Mn2+、Fe2+、Mg2+和Ca2+均能使菌株W1B的生長顯著提高(<0.05) (圖7D)，且Ca2+效果最好；Mn2+和Ca2+能提高菌株W1B對信號分子C6-HSL的降解率，但與對照組相比未達到顯著水平(>0.05)。

表1 菌株BDZ5和W1B藥敏性實驗結(jié)果

Tab.1 The antibiotic susceptibility test result of strains BDZ5 and W1B

注：R：耐藥；I：中度敏感；S：敏感

Note: R: Resistance; I: Moderate sensitivity; S: Sensitive

圖4 感染細菌后各組對蝦累積死亡率

PC：陽性對照組；NC：陰性對照組。96 h時不同字母表示各組間差異顯著(<0.05)

PC: Positive control; NC: Negative control. Different letters at 96 h indicate significant difference between the groups (<0.05)

圖5 感染細菌后各組對蝦血清超氧化物歧化酶(A)，一氧化氮合酶(B)，溶菌酶(C)和抗菌酶(D)活性

PC：陽性對照組；NC：陰性對照組。不同字母表示各組間差異顯著(<0.05)

PC: Positive control; NC: Negative control. Different letters indicate significant difference between the groups (<0.05)

圖6 不同培養(yǎng)時間(A)、pH (B)、鹽度(C)和金屬離子(D)對菌株BDZ5的C6-HSL降解率及生長的影響

NC：陰性對照組。不同大寫字母表示菌株對信號分子C6-HSL降解率具有顯著差異(<0.05)，不同小寫字母表示菌株的生長具有顯著差異(<0.05)，下同

NC: Negative control. Different uppercase letters indicate that the C6-HSL degradation rate of the strains with different metal ions were significantly different (<0.05). Different lowercase letters indicate that the growth of the strains with different metal ions were significantly different (<0.05), the same as bellow

圖7 不同培養(yǎng)時間(A)、pH (B)、鹽度(C)和金屬離子(D)對菌株W1B的C6-HSL降解率及生長的影響

3 討論

本研究采用A136液體X-gal法從健康的凡納濱對蝦體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境中篩選得到2株對信號分子C6-HSL具有降解作用的活性菌株BDZ5和W1B，經(jīng)鑒定分別為芽孢桿菌屬和科貝特氏菌屬。近年來，QQ菌的相關(guān)研究已經(jīng)成為了微生物領(lǐng)域的熱點，但其在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用尚處于起步階段。此前，已有研究表明，芽孢桿菌屬的某些細菌，如短小芽孢桿菌()、蘇云金芽孢桿菌()、蠟樣芽孢桿菌()、巨大芽孢桿菌()和枯草芽孢桿菌等能抑制某些病原菌的QS系統(tǒng)，降低病原菌的毒力并對水產(chǎn)動物起到保護作用(Bai, 2008; Pan, 2008; 宋增福等，2013; Tinh, 2014; 韋存等，2018)，本研究結(jié)果再一次表明了芽孢桿菌屬細菌的QQ功能?？曝愄厥暇巧钤诤Ｋh(huán)境中的一種革蘭氏陰性菌，目前，針對科貝特氏菌的研究相對較少，尤其是在QQ方面。Trentin等(2011)曾從干擾病原菌QS系統(tǒng)的角度探究了?？曝愄厥暇鷮Ρ砥て咸亚蚓?)生物膜形成的影響，但并未給出直接研究結(jié)果來證明?？曝愄厥暇腝Q活性。該研究是首次報道關(guān)于科貝特氏菌屬對信號分子C6-HSL具有強降解作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)沸水浴處理后，2株功能菌株均喪失了對信號分子C6-HSL的降解活性。QQ菌通過QQ活性物質(zhì)起到抑制病原菌QS系統(tǒng)的作用，根據(jù)分子量的大小，可分為大分子QQ酶和小分子QS阻抑物(于敏等, 2018)。其中，AHL降解酶是目前大分子QQ物質(zhì)研究的重點，根據(jù)降解機制的不同，AHL降解酶又分為AHL內(nèi)酯酶、AHL酰基轉(zhuǎn)移酶和AHL氧化還原酶，多數(shù)的AHL降解酶不具有耐熱性，因此，可通過檢測功能菌株降解信號分子的耐熱性，初步判斷菌株是否具有AHL降解酶。本研究結(jié)果表明，功能菌株可能存在AHL降解酶活性，但菌株BDZ5和W1B各具有何種QQ酶仍需進一步深入探討。

益生菌的安全性問題備受關(guān)注，目前，還沒有形成完善的安全性評價體系。當(dāng)前，針對益生菌安全性的研究主要集中在體外研究和體內(nèi)研究2個方面(郝生宏等, 2004)。溶血實驗和藥物敏感性實驗是體外安全性評估的2個重要方面(Baumgartner, 1998; 劉勇等, 2011)。某些細菌能釋放溶血素引起紅細胞膜裂解而導(dǎo)致嚴(yán)重的細菌性疾病(Craig, 2017)，甚至對人類具有潛在的危害。本研究中，枯草芽孢桿菌BDZ5和海科貝特氏菌W1B均未表現(xiàn)出明顯的溶血現(xiàn)象，表明在實驗條件下，該2株菌株均不產(chǎn)生溶血素。藥物敏感性實驗是體外安全性評價的另一個重要方面，其主要目的是測試待測菌株對抗生素是否具有耐藥性，從而防止耐藥益生菌無限生長及對機體內(nèi)源性菌株產(chǎn)生耐藥性誘導(dǎo)(王曉琳, 2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株BDZ5對頭孢氨芐、頭孢唑林等13種抗生素敏感，菌株W1B對羧芐西林、頭孢他啶等8種抗生素敏感，并對多數(shù)抗生素中度敏感，表明多數(shù)抗生素能對該2株菌株進行有效控制。根據(jù)體外安全性評估結(jié)果，可以將該2株菌作為潛在益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。

除了體外安全性評估，對養(yǎng)殖動物進行體內(nèi)安全性測試也是十分重要的。對水產(chǎn)動物進行體內(nèi)安全性測試的方式主要包括注射、浸浴和投喂等。張歡歡等(2016)采用注射和浸浴的方式檢測功能菌對凡納濱對蝦的安全性；陳文斌等(2017)采用浸浴的方式發(fā)現(xiàn)降氮菌株NB9對對蝦的成活率無顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，與副溶血弧菌不同，向凡納濱對蝦體內(nèi)注射 1×104CFU/ml和1×106CFU/ml的BDZ5及W1B菌懸液均不會引起對蝦死亡率的升高，進一步表明這2株菌對凡納濱對蝦無明顯毒害作用。

本研究進一步測試了感染細菌后，各組凡納濱對蝦血清中的免疫及抗氧化相關(guān)酶活性，包括SOD、NOS、LZM和抗菌活性。其中，SOD在清除凡納濱對蝦體內(nèi)自由基方面具有重要作用(Trenzado, 2006)；NOS在細菌感染后被激活，通過釋放NO對病原起到滅殺作用(Yao, 2010)；LZM和抗菌酶在破壞和清除體內(nèi)病原方面十分重要(Chang, 2018)。這些免疫及抗氧化酶活性的變化反映出凡納濱對蝦受刺激的情況。本研究中，未觀察到注射BDZ5和W1B菌懸液對凡納濱對蝦的免疫及抗氧化酶活性具有顯著影響，表明這2株菌對凡納濱對蝦未造成明顯的刺激。相反，注射1×106CFU/ml的副溶血弧菌后，NOS活性顯著提高，表明凡納濱對蝦受到了病原的刺激；抗菌酶活性顯著降低，表明凡納濱對蝦的免疫系統(tǒng)受到了病原的破壞。此外，還觀察到凡納濱對蝦注射1×106CFU/ml的副溶血弧菌后的LZM活性顯著低于注射1×106CFU/ml的W1B，與該2組的累積死亡率數(shù)據(jù)一致。總之，通過凡納濱對蝦血清中免疫及抗氧化酶活性的變化進一步說明了BDZ5和W1B具有安全性。

為探究不同的培養(yǎng)條件對這2株活性菌株生長及功能的影響，本研究以LB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行單因素實驗，分別研究了不同培養(yǎng)時間、起始pH、鹽度和金屬離子對活性菌株生長和信號分子C6-HSL降解率的影響，研究結(jié)果可為菌株的大規(guī)模發(fā)酵及實際應(yīng)用提供參考。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)條件對活性菌株的生長和功能的影響具有不一致性，即最適生長條件下，菌株并不一定具有最高的信號分子C6-HSL降解活性，二者之間甚至可能完全相反，這與丁碧婷(2012)的研究結(jié)果相似。

綜上所述，本研究從凡納濱對蝦養(yǎng)殖體系中篩選得到2株具有QQ功能的活性菌株，經(jīng)鑒定分別是芽孢桿菌屬和科貝特氏菌屬。安全性評價結(jié)果表明，這2株活性菌對凡納濱對蝦無明顯毒害作用，可以作為潛在益生菌應(yīng)用于對蝦養(yǎng)殖，最終通過單因素條件優(yōu)化實驗確定了2株活性菌的最適生長和信號分子C6-HSL降解條件，為基于QQ角度防治對蝦細菌性病害提供了優(yōu)良菌種，并為菌株的大規(guī)模發(fā)酵及后續(xù)應(yīng)用提供了參考資料。后續(xù)研究將集中在QQ活性物質(zhì)的分離、純化及實際應(yīng)用效果方面，探究活性菌株的主要功能組分及對對蝦的保護作用，為在實際生產(chǎn)中應(yīng)用QQ菌株防治細菌性病害提供基礎(chǔ)研究資料。

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Screening, Safety Evaluation and Fermentation Conditions Optimization of Quorum Quenching Bacteria fromCulture System

YU Peng1,2, YE Haibin2, SHAN Hongwei1①, MA Shen1, WANG Teng1

(1. Ocean University of China, Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Qingdao 266003; 2. Shandong Key Laboratory of Disease Control in Mariculture,Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao 266104)

With the development of shrimp culture industry, bacterial diseases are becoming very serious. To explore the new methods of controlling bacterial diseases in shrimps through quorum quenching (QQ), potential probiotics with QQ activity from the culture system ofwere screened and identified in the present study. The safety of QQ strains was evaluated and fermentation conditions were optimized. TheA136 liquid X-gal method was used to screen QQ strains. Two bacterial fermentation broths showed significant degradation of hexanoyl homoserine lactone (C6-HSL), while the degradation activities were both lost after boiling water bath treatment. The strains were subjected to 16S rDNA gene sequencing analysis, and BDZ5 and W1B were identified assp.andsp., respectively.The safety evaluation results showed that strains BDZ5 and W1B were not hemolyzed and were not sensitive to most antibiotics.After injection of the two strains, the cumulative mortality of shrimp did not increase, and the serum immune and antioxidase enzyme activities in shrimp did not change significantly, indicating that the two strains are safe for shrimp.Single factor condition optimization results showed the optimal growth conditions of BDZ5 as follows: initial pH 7.0, salinity 20, and 0.0005% MnCl2for 48 h culture time. Moreover, the optimal growth conditions of W1B were as follows: initial pH 6.0, salinity 40, and 0.05% CaCl2for 48 h.Except for the culture time, the optimal C6-HSL degradation conditions of two strains were different from their growth conditions. Under the culture condition of initial pH 7.5, salinity 30, and 0.0005% MnCl2for 48 h, the degradation rate of the signal molecule C6-HSL by the action of the two active bacteria reached the maximum.The results of the study can provide excellent strains for controlling bacterial diseases in shrimp based on QQ and provide reference materials for large-scale fermentation and subsequent application of the strains.

; Bacterial disease control; Quorum quenching bacteria; Safety; Condition optimization

SHAN Hongwei, E-mail: shanhongwei@ouc.edu.cn

S968.22

A

2095-9869(2020)05-0010-10

10.19663/j.issn2095-9869.20190509001

http://www.yykxjz.cn/

于鵬, 葉海斌, 單洪偉, 馬甡, 王騰. 凡納濱對蝦養(yǎng)殖體系中群體感應(yīng)淬滅菌的篩選、安全性評估及發(fā)酵條件優(yōu)化. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2020, 41(5): 82–91

Yu P, Ye HB, Shan HW, Ma S, Wang T. Screening, safety evaluation and fermentation conditions optimization of quorum quenching bacteria fromculture system. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 82–91

* 山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2018BC051)和山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室開放課題(KF201903)共同資助 [This work was supported by Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2018BC051), and the Open Fund of Shandong Key Laboratory of Disease Control in Mariculture(KF201903)]. 于 鵬，E-mail: yupeng5151@stu.ouc.edu.cn

單洪偉，E-mail: shanhongwei@ouc.edu.cn

2019-05-09,

2019-07-02

(編輯 陳 嚴(yán))