倪國龍 張梓軒 焦鳳萍 林國亮

山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)公共衛(wèi)生學院，山東 泰安 271016

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤，其惡性程度高、治愈率低，病死率高達90%[1]。目前，HCC治療的首選方法仍是手術切除，但患者術后的復發(fā)率高，生存率也很低[2]。近年來，發(fā)現(xiàn)真菌多糖可以提高機體免疫力，并具有一定的抗腫瘤活性。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主、有序的死亡，涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等作用。目前認為惡性腫瘤與細胞周期紊亂導致腫瘤細胞無限增生和凋亡減少有關。因此，抑制腫瘤細胞增生和誘導腫瘤細胞凋亡可能成為治療腫瘤的有效方法。Wnt信號通路由Wnt蛋白、Wnt蛋白受體和β-catenin等組成，Wnt/β-catenin信號通路與多種疾病密切相關，如可參與早期胚胎發(fā)育過程中腦和神經(jīng)系統(tǒng)的形成、參與造血干細胞的自我更新、維持小腸組織的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)骨密度及脂肪細胞的分化等[3]。 Wnt/β-catenin信號通路還可通過激活下游的Cyclin D1和c-myc等影響細胞的增殖和凋亡過程，從而可能和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。

本實驗采用MTT法檢測香菇菌糠多糖(polysaccharide extracted fromL.edodeswaste material，PLWM)對HepG2細胞增殖的影響,通過細胞形態(tài)觀察香菇菌糠多糖對HepG2細胞凋亡的影響，采用Western blot檢測香菇菌糠多糖對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響，探索香菇菌糠多糖是否可通過Wnt/β-catenin信號通路促進HepG2細胞凋亡而可能發(fā)揮抗腫瘤作用，為開發(fā)抗肝癌輔助藥物提供實驗和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

香菇菌糠多糖由山東農(nóng)業(yè)大學賈樂教授提供。細胞及培養(yǎng)基：HepG2細胞為本實驗室保存，1%青霉素鏈霉素(1%PS)、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清FBS購自泰安聯(lián)星科技有限公司。主要試劑：MTT等試劑購自泰安華鵬生物科技有限公司，β-catenin、Caspase-3、Bcl-2和GAPDH等抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1香菇菌糠多糖溶液配制 稱取香菇菌糠多糖粉末10 g,加入預熱的20 mL雙蒸水(約75℃左右)溶解1 h。室溫3 000 r/min離心15 min，輕輕吸上清，分別用0.45 μm和0.22 μm的濾膜過濾除菌。采用硫酸苯酚法測定多糖溶液的濃度，多糖溶液分成小包裝保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2細胞培養(yǎng) HepG2細胞使用DMEM(10%FBS,1%PS)培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)，0.25%胰酶消化進行傳代，3～4天傳代1次。

1.2.3MTT實驗檢測香菇菌糠多糖對細胞的毒性 將HepG2細胞鋪至96孔細胞培養(yǎng)板，5×103個細胞/孔，過夜培養(yǎng)。加入香菇菌糠多糖溶液，終濃度為：6.25、12.5、25、50、100和200 μg/mL，每個濃度梯度各設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,用預溫的PBS清洗細胞2次，再按上述終濃度加入香菇菌糠多糖，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，向細胞培養(yǎng)孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清后，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，避光、室溫震蕩10 min。酶標儀測定各孔的吸光度(A490 nm)。

1.2.4MTT法檢測香菇菌糠多糖對HepG2細胞增殖的抑制情況 將HepG2細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔細胞約2×104個，培養(yǎng)18～24 h后加入香菇菌糠多糖溶液，使其終濃度為50 μg/mL，同時以細胞培養(yǎng)液為陰性對照，每組6個復孔。在24、48、72、96和120 h后分別加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清后，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，避光、室溫震蕩10 min。酶標儀測定各孔的吸光度(A490)，并依據(jù)公式：細胞存活率(%)=A給藥/A對照×100%計算細胞的存活率。

1.2.5細胞形態(tài)觀察香菇菌糠多糖對細胞凋亡的影響 將HepG2細胞分別以每孔1×103個接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜。加入香菇菌糠多糖溶液，終濃度為50 μg/mL，以細胞培養(yǎng)液為陰性對照組，以DOX(10 μmol/L)為陽性對照組。培養(yǎng)72 h后觀察細胞形態(tài)，以判斷香菇菌糠多糖是否可促進HepG2細胞發(fā)生凋亡。

1.2.6Western blot檢測蛋白的表達 將HepG2細胞按每孔2×105個接種于12孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)18 h后，加入香菇菌糠多糖溶液，使其終濃度為50 μg/mL，培養(yǎng)液為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,采用4 ℃預冷的PBS洗滌3次，收集細胞沉淀，提取蛋白并采用BCA法測定蛋白質(zhì)的濃度。配制膠板，每孔上樣量為40 μg，采用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，轉膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，洗滌后換HRP標記1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。PBST洗滌3次，每次10 min。化學發(fā)光成像儀顯影，檢測β-catenin、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，劑量依賴效應采用線性回歸分析方法，MTT法檢測細胞增殖實驗的組間比較采用單因素重復測量的方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 香菇菌糠多糖對HepG2細胞的毒性檢測

表1 藥物濃度與吸光度指數(shù)分布擬合回歸分析

圖1 香菇菌糠多糖對HepG2細胞的毒性檢測

2.2 香菇菌糠多糖對細胞增殖的抑制作用

采用MTT法檢測香菇菌糠多糖(PLWM)對HepG2細胞的增殖抑制作用，對時間效應(F=56.664,P<0.001)，組間比較(F=572.991,P<0.001)，兩因素的交互作用(F=39.150，P<0.001)的統(tǒng)計分析結果顯示50 μg/mL的香菇菌糠多糖具有明顯抑制細胞增殖的作用，見表2，圖2。

表2 陰性對照組與50 μg/mL的香菇菌糠多糖處理組數(shù)據(jù)的重復測量分析

圖2 香菇菌糠多糖抑制HepG2細胞增殖的作用

2.3 香菇菌糠多糖對HepG2細胞的影響

我們也觀察了香菇菌糠多糖對HepG2細胞的影響，結果發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，50 μg/mL香菇菌糠多糖可使HepG2細胞發(fā)生明顯皺縮，細胞皺縮形態(tài)與10 μmol/L DOX處理組相似，見圖3，表明香菇菌糠多糖可能具有促進HepG2細胞發(fā)生凋亡的作用。

圖3 香菇菌糠多糖對HepG2細胞形態(tài)的影響(×100)

2.4 香菇菌糠多糖對Wnt/βcatenin信號通路相關蛋白的影響

我們采用Western blot檢測香菇菌糠多糖對Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、Caspase-3和Bcl-2表達的影響。在HepG2細胞中，香菇菌糠多糖可明顯抑制β-catenin、Caspase-3和Bcl-2的蛋白表達量，見圖4。結果表明香菇菌糠多糖可能會通過Wnt/β-catenin信號通路及其下游的Bcl-2促進HepG2細胞發(fā)生凋亡。

圖4 Western blot檢測香菇菌糠多糖對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的影響

3 討 論

Wnt/β-catenin是Wnt信號通路中的經(jīng)典通路，它參與了多種細胞的生命活動，包括組織器官的再生、細胞增殖、細胞凋亡和壞死等，并且Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。

真菌多糖作為藥物研究始于上世紀中期，通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用。陳瑾歆等[6]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可通過抑制Bcl-2表達而促進HepG2細胞發(fā)生凋亡，呂君等[7]也發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路下游Bcl-2的表達促進HepG2細胞凋亡。靈芝多糖可通過Erk信號途徑抑制腫瘤細胞增殖[8]，香菇多糖也可通過激活T細胞和自然殺傷細胞等活性及增強免疫細胞的吞噬能力發(fā)揮抗腫瘤作用[9]，枸杞多糖能明顯促進淋巴細胞分泌IL-1、IL-2，巨噬細胞釋放TNF等細胞因子，激活腫瘤細胞的免疫應答[10]。

目前已有香菇多糖片用作慢性乙型肝炎和消化道腫瘤的放、化療輔助藥。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)香菇菌糠多糖具有抗HBV的作用[11]。為進一步開發(fā)利用香菇菌糠多糖，發(fā)揮其藥用價值，本項目通過體外細胞學實驗發(fā)現(xiàn)50 μg/mL的香菇菌糠多糖具有明顯的抑制細胞增殖作用，可使HepG2細胞形態(tài)發(fā)生明顯皺縮，說明香菇菌糠多糖可能通過促進HepG2細胞凋亡而發(fā)揮抑制HepG2細胞增殖的作用。同時我們通過Western blot方法檢測香菇菌糠多糖對Wnt/β-catenin信號通路及其下游分子的影響，發(fā)現(xiàn)香菇菌糠多糖可抑制β-catenin、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達量，表明香菇菌糠多糖可能通過Wnt/β-catenin信號通路及其下游的Bcl-2來促進HepG2細胞凋亡，從而起到抗腫瘤的作用。