劉勝男 楊 丹 馬宵雁 董毅璇 陳美華

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)藥學(xué)院， 山東 泰安 271016

心肌纖維化(myocardialfibrosis，MF)是心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，心肌間質(zhì)膠原過度沉積所致。心肌纖維化的主要病理變化是心肌的僵硬程度增加，心肌收縮及舒張能力下降，冠脈血供不足等。心肌纖維化破壞心臟功能，可促發(fā)充血性心力衰竭、惡性心律失常和猝死。MF常繼發(fā)于冠心病、高血壓等心血管疾病，也是心室重構(gòu)發(fā)展難以逆轉(zhuǎn)的重要原因，因此預(yù)防及控制心肌纖維化具有重要的臨床意義[1]。傳統(tǒng)中藥益母草用于治療月經(jīng)不規(guī)律、痛經(jīng)、閉經(jīng)等婦科疾病[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，益母草對(duì)人體其他系統(tǒng)疾病，特別是其生物堿(水蘇堿)對(duì)心血管系統(tǒng)有一定的治療和保護(hù)作用，同時(shí)其在抗炎、抗腫瘤、抗菌、止痛、止咳平喘等方面有藥理活性，因而受到廣泛的關(guān)注[3-4]。益母草提取物水蘇堿在抗炎、抗氧化等方面效果顯著，由此推測其可能對(duì)MF具有防治作用。為此本實(shí)驗(yàn)通過觀察益母草提取物水蘇堿(stachydrine)對(duì)異丙腎上腺素(isoproterenol，Iso)致小鼠MF模型的影響，并探討水蘇堿改善小鼠MF的藥理學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明種小鼠，18～22 g，雌雄兼用，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SYXK( 魯) 20190022；正常飲食飲水，光照12 h，明暗交替，實(shí)驗(yàn)處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥品、試劑

水蘇堿(南京澤朗醫(yī)藥有限公司，純度98%)；異丙腎上腺素(合肥巴斯夫生物科技有限公司，純度99%)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物有限公司)；MASSON染液(南京建成生物有限公司)。

1.3 儀器

80-2型低速離心機(jī)，上海醫(yī)療器械集團(tuán)公司;Bio-Rad680 酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)；RM2145 石蠟切片機(jī)(德國LEICA 公司)。

1.4 小鼠MF模型復(fù)制及實(shí)驗(yàn)分組、給藥

小鼠50只，隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、水蘇堿高劑量組、水蘇堿中劑量組、水蘇堿低劑量組(n=10)。除對(duì)照組外，其余各組每只小鼠皮下注射Iso 2.5 mg/kg，連續(xù)28 d，對(duì)照組按照2.5 mg/kg皮下注射等量生理鹽水；同時(shí)，水蘇堿高、中、低劑量組造模同時(shí)分別腹腔注射10.0、5.0、2.5 mg/kg的水蘇堿，對(duì)照組、模型組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)28 d。

1.5 心重指數(shù)測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠稱重，處死小鼠取心臟，稱重，計(jì)算心重指數(shù)(HW/BW)。

1.6 生化指標(biāo)檢測

取心臟，勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作，測定SOD活性、MDA含量和羥脯氨酸含量。

1.7 左心室組織病理學(xué)檢查

取小鼠心尖組織，甲醛固定，石蠟包埋制成5 μm切片，分別進(jìn)行HE及Masson染色，按照染色說明書嚴(yán)格操作，顯微鏡下觀察心肌組織學(xué)的改變。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 心重指數(shù)的變化

與對(duì)照組相比，模型組小鼠心重指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)水蘇堿干預(yù)后，與模型組相比，水蘇堿高、中劑量組心重指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠的心重指數(shù)

2.2 心肌組織SOD活性和MDA含量

與對(duì)照組比較，模型組小鼠心肌SOD活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而MDA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)水蘇堿干預(yù)后，與模型組相比，水蘇堿高、中劑量組小鼠心肌SOD活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量

2.3 心肌組織羥脯氨酸含量

與對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌組織羥脯氨酸含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)水蘇堿治療后，與模型組相比，水蘇堿高、中、低劑量組小鼠心肌組織羥脯氨酸含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠心肌組織羥脯氨酸含量的比較

2.4 心肌組織HE染色

對(duì)照組心肌組織排列整齊，間隙正常；模型組炎性細(xì)胞浸潤，形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞邊緣界限不分明，胞核深染；與模型組比較，水蘇堿高、中、低劑量組炎性浸潤程度均不同程度下降，細(xì)胞邊緣界限分明，胞核較淺，壞死細(xì)胞減少。見圖1。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.水蘇堿高劑量組；D.水蘇堿中劑量組；E.水蘇堿低劑量組。圖1 各組小鼠心肌組織HE染色(×200)

2.5 心肌組織Masson染色

Masson染色顯示心肌組織膠原纖維呈藍(lán)紫色，心肌纖維呈紅色。對(duì)照組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，纖維排列致密整齊；模型組有大量膠原纖維沉積；水蘇堿高、中、低劑量組雖仍有膠原沉積，但較模型組膠原沉積顯著減少。見圖2。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.水蘇堿高劑量組；D.水蘇堿中劑量組；E.水蘇堿低劑量組。圖2 小鼠心肌組織Masson染色(×200)

3 討 論

隨著人口老齡化的進(jìn)程，心臟病的發(fā)病率逐年增加，包括冠心病心肌梗死后的重塑、高血壓性心肌肥厚、糖尿病性心臟病在內(nèi)的許多種心臟病均存在不同程度的心肌纖維化，心肌纖維化是多種心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)。心肌纖維化主要以心肌纖維細(xì)胞異常增殖與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量沉積為重要特點(diǎn)的病理改變，是心肌組織僵硬的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可以導(dǎo)致心室順應(yīng)性下降，影響心臟的正常收縮與舒張，并引發(fā)心律失常。心肌纖維化是多種常見心臟疾病向終末期心臟病發(fā)展的必然過程，是心功能由代償向失代償轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。

心肌纖維化的病理生理學(xué)機(jī)制非常復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)大量的氧自由基生成及過氧化反應(yīng)異常增強(qiáng)是其主要機(jī)制之一[5-6]。SOD、MDA是目前公認(rèn)的能較好反映體內(nèi)氧自由基水平及脂質(zhì)過氧化損傷程度的間接指標(biāo)。SOD是機(jī)體清除自由基的重要酶類，心肌損傷時(shí)SOD的活性降低，機(jī)體超氧化物的生成大于清除，自由基產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài)被破壞，大量自由基導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能障礙，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致多種炎性反應(yīng)及細(xì)胞調(diào)亡，進(jìn)一步導(dǎo)致心肌纖維化。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，與對(duì)照組相比，模型組心重指數(shù)明顯增加，羥脯氨酸含量明顯增加,SOD活性顯著性下降，MDA含量顯著升高；顯微鏡下病理學(xué)顯示炎性細(xì)胞浸潤，出血壞死細(xì)胞增加，Masson染色顯示大量膠原纖維沉積。同樣說明心肌纖維化的病理學(xué)機(jī)制與氧化反應(yīng)有關(guān)，可出現(xiàn)炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

現(xiàn)今醫(yī)學(xué)對(duì)心肌纖維化沒有確切的治療手段，目前臨床多用β腎上腺素受體阻斷劑，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等緩解心肌纖維化，但療效不佳且難以持久用藥[7]。而中藥干預(yù)能從多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，具有一定的優(yōu)勢。益母草對(duì)婦產(chǎn)科疾病具有良好的治療作用，其有效成分水蘇堿具有與益母草傳統(tǒng)功能相近的作用[8]，同時(shí)研究表明益母草水蘇堿對(duì)心血管系統(tǒng)有一定的治療和保護(hù)作用[8]。

本研究顯示，水蘇堿高、中、低劑量組與Iso模型組比較，心重指數(shù)明顯減小，羥脯氨酸含量降低；Masson染色顯示各劑量水蘇堿給藥組雖仍有膠原沉積，但較Iso模型組膠原沉積顯著減少。表明水蘇堿能有效地抑制模型小鼠的心肌肥厚。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)水蘇堿對(duì)Iso所致小鼠的心肌細(xì)胞纖維化程度、炎性浸潤水平和細(xì)胞壞死方面均有改善，其保護(hù)機(jī)制可能與升高心肌組織SOD活性、降低MDA含量和有關(guān)。

既往我們對(duì)水蘇堿對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究中發(fā)現(xiàn)水蘇堿對(duì)四氯化碳所致小鼠肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與升高肝組織SOD活性、降低MDA含量高有關(guān)[9]。結(jié)合本次研究結(jié)果，水蘇堿不但對(duì)肝組織的氧化損傷有保護(hù)作用，對(duì)心肌組織的氧化損傷同樣有保護(hù)作用，兩次研究結(jié)果顯示其抗氧化作用與升高SOD活性和降低MDA含量有關(guān)。在我們的另外一項(xiàng)研究顯示水蘇堿對(duì)急性心肌缺血小鼠的心肌組織具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與降低急性心肌缺血小鼠血清血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶活性和心肌髓過氧化物酶活性，提高心肌Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase活性有關(guān)[10]。與本次結(jié)果中水蘇堿對(duì)心肌損傷起到保護(hù)作用相一致。由此我們推斷水蘇堿可能通過提高心肌組織SOD活性，加快超氧化物的清除，減少自由基數(shù)量，同時(shí)減低心肌組織MDA含量，減輕心肌組織氧化損傷和細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制心肌纖維化的效果。

綜上所述，水蘇堿能有效改善鹽酸異丙腎上腺素誘發(fā)的小鼠心肌纖維化，其機(jī)制可能與提高心肌組織SOD活性、降低MDA含量有關(guān)。