劉向暉，耿碩碩，吳 迪，李 瑩，羅曉娜，許瑩瑩，袁浩澤，王秀梅，謝曉華

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一類調(diào)節(jié)多種發(fā)育過程的生長因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族中最大的亞群[1]。BMPs最初是1965年被發(fā)現(xiàn)并從脫鈣骨基質(zhì)中分離出的，它能夠誘導(dǎo)異位骨的形成。隨著研究的深入，目前已知BMPs會影響許多生物系統(tǒng)的形成和功能，包括鐵代謝、癌癥、骨和肌肉的發(fā)育等[2-4]。牙齒發(fā)育過程中的細(xì)胞分化是由牙齒上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞之間相互作用所產(chǎn)生的[5]，而BMPs在牙齒發(fā)育過程中可以調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)的相互作用，并在早期礦化過程中發(fā)揮作用[6]。在這個過程中，BMP2在上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)[7]。牙齒中的BMP2能夠誘導(dǎo)成釉細(xì)胞的分化和調(diào)節(jié)釉質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，并能夠在早期牙礦化過程中協(xié)調(diào)成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞的分化[8]。在早期牙齒發(fā)育過程中，BMP4的表達(dá)從牙上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，BMP4在牙形態(tài)發(fā)生的上皮-間質(zhì)相互作用中起主要作用[9-10]。BMP4還可以在體外培養(yǎng)的條件下激活成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)使用Osx-Cre條件性敲除BMP2可以導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)釉質(zhì)發(fā)育異常，使用Wnt1-Cre條件性敲除BMP4可以導(dǎo)致小鼠的牙齒出現(xiàn)不同程度的損害[12-13]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)BMP2和BMP4上皮條件性基因敲除鼠會表現(xiàn)出釉質(zhì)生成不良(amelogenesis imperfecta，AI)的癥狀，同時基因敲除鼠成釉上皮也表現(xiàn)出MMP20和KLK4基因轉(zhuǎn)錄水平的下降[14]。本實驗研究了體外情況下BMP2和BMP4對牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白酶表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步闡明BMP2和BMP4蛋白對牙釉質(zhì)發(fā)育的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要儀器和試劑

7500型實時熒光定量PCR儀(Thermo，美國)；Western blot顯影儀(天能，中國)；低溫高速離心機(jī)(Thermo，美國)；電子顯微鏡(Nikon，日本)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；FBS(Gibco，美國)；青霉素(Sigma，美國)；鏈霉素(Sigma，美國)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；重組小鼠BMP2蛋白(R&D，美國)；重組小鼠BMP4蛋白(R&D，美國)；Dorsomorphin(Sigma，美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；SYBR熒光定量聚核酶鏈反應(yīng)試劑盒(TaKaRa,日本)；MMP20、KLK4、GAPDH引物(Invitrogen，美國)；組織總蛋白提取試劑盒(Sigma，美國)；蛋白BCA定量試劑盒(碧云天，中國)；本實驗所用一抗：MMP20(abcam，美國)；KLK4(abcam，美國)；GAPDH(CST，美國)；P-Smad1/5/8(CST，美國)；pan-Smad1/5/8(abcam，美國)；P-p38(CST，美國)；pan-p38(CST，美國)；二抗(索萊寶，中國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞及培養(yǎng)條件 小鼠成釉細(xì)胞系A(chǔ)LC由濱州醫(yī)學(xué)院所贈，細(xì)胞系采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每3 d換液一次,待細(xì)胞生長至80%匯合時常規(guī)傳代培養(yǎng)或給藥處理。重組小鼠BMP2蛋白和BMP4蛋白的使用濃度為100 ng/mL，BMP通路抑制劑Dorsomorphin溶于DMSO，使用濃度為20 μmol/L。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測采用RT-PCR技術(shù)。ALC細(xì)胞經(jīng)處理后使用Trizol法提取RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。定量PCR反應(yīng)總體積為20 μL，具體組成如下：逆轉(zhuǎn)錄cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×TB Green Premix(Takara)10 μL，無酶水7 μL。PCR引物序列如下，KLK4：5′-AACCTAAGGGACAGGGCAGT-3′,5′-GACAGTATCGGCCTCAGGAA-3′；MMP20：5′TGTCTAAGCTCAAGGTGCCCTGTT-3′,5′-TAAGTTGTCCATGTGGGTGCTGGA-3′；GAPDH：5′-TCCAGAACATC-ATCCCTGCCTCTA-3′,5′-ACAAAGTGGTCGTTGAG-GGCAATG-3′。擴(kuò)增流程如下：94 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行比較。

1.2.3 Western blot檢測蛋白 根據(jù)組織總蛋白提取試劑盒操作說明提取細(xì)胞系樣品組織蛋白，使用蛋白BCA定量試劑盒測定樣品蛋白濃度，向樣品中加入還原性loading buffer煮沸變性，配制10% SDS-PAGE凝膠，每孔上30 μg樣品，跑膠后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，采用5%脫脂奶封閉1 h，之后放入抗體中進(jìn)行孵育，PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)中孵育，洗滌后進(jìn)行曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism8.0軟件分析，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”形式報告，組間比較用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMP信號通路的變化

Western blot結(jié)果顯示，與未加入蛋白刺激的對照組相比，BMP蛋白作用30 min后，Smad1/5/8及p38磷酸化水平明顯增加(圖1A)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖1B)。這表明BMP2和BMP4蛋白聯(lián)合干預(yù)可以明顯激活BMP通路的活性，包括Smad依賴性通路(經(jīng)典通路)和Smad非依賴性通路(非經(jīng)典通路)。另一組樣本中加入BMP通路抑制劑(Dorsomorphin)，對照組加入等量的DMSO，處理3 h后取材。Western blot結(jié)果顯示和對照組相比Smad1/5/8的磷酸化水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖2)，而p38磷酸化的變化不明顯。該結(jié)果表明在BMP抑制劑的作用下，Smad依賴性通路(Smad1/5/8通路)的表達(dá)被抑制，而Smad非依賴性通路(p38通路)則不受影響。

與對照組比較，***P<0.001(n=3)

與對照組比較，***P<0.001(n=3)

2.2 牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白酶MMP20和KLK4的變化

Real-time PCR的結(jié)果顯示，與對照組相比，BMP蛋白刺激12 h后，MMP20和KLK4的基因表達(dá)明顯升高(P<0.01，圖3)；與對照組相比，抑制劑處理12 h后，Real-time PCR的結(jié)果顯示MMP20和KLK4的基因表達(dá)明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。該結(jié)果表明BMP2和BMP4重組蛋白能夠正向調(diào)控MMP20、KLK4基因的表達(dá)，抑制劑Dorsomorphin可以負(fù)向調(diào)控MMP20、KLK4基因的表達(dá)，據(jù)此我們可以認(rèn)為：BMP通路，尤其是Smad依賴性通路對MMP20、KLK4基因的表達(dá)具有至關(guān)重要的作用。

與對照組相比，**P<0.01,***P<0.001(n=3)

2.3 BMP蛋白的挽救作用

Western blot結(jié)果顯示，與未作處理的對照組相比，Dorsomorphin作用12 h后，MMP20和KLK4的蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.001，圖4)。而BMP蛋白刺激12 h后，MMP20和KLK4的蛋白表達(dá)變化不大(圖4B)。同時存在Dorsomorphin和BMP蛋白的挽救組相較于抑制劑Dorsomorphin組，MMP20和KLK4的蛋白表達(dá)水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖4B)。該結(jié)果顯示BMP抑制劑Dorsomorphin抑制了MMP20和KLK4蛋白水平的表達(dá)；BMP2、BMP4蛋白對MMP20和KLK4蛋白水平表達(dá)的影響不大；在BMP抑制劑存在的情況下，再加入BMP2、BMP4蛋白進(jìn)行刺激的結(jié)果顯示MMP20和KLK4的蛋白表達(dá)水平有了明顯的改善。BMP蛋白可以上調(diào)由于抑制劑Dorsomorphin導(dǎo)致的MMP20和KLK4蛋白水平的下降。

3 討 論

AI是鈣化障礙和釉質(zhì)形成缺陷的一組遺傳性疾病，嚴(yán)重影響了牙齒的美觀和人們的生活質(zhì)量。AI可以分為礦化不全型和形成不全型，但所有的類型都存在鈣化和釉質(zhì)基質(zhì)形成的障礙。成熟的牙釉質(zhì)主要由無機(jī)物和極少量的有機(jī)成分和水組成。無機(jī)物為高度礦化、有序排列的羥基磷灰石晶體。有機(jī)成分主要是成釉細(xì)胞分泌的基質(zhì)蛋白和蛋白酶，釉質(zhì)基質(zhì)蛋白包括釉原蛋白(amelogenin，AMEL)，成釉蛋白(ameloblastin，AMBN)，釉蛋白(enamelin，ENAM)，釉成熟蛋白(amelotin，AMTN)和牙成釉細(xì)胞相關(guān)蛋白(odontogenic ameloblast-associated protein，ODAM)等；釉基質(zhì)蛋白酶主要有MMP20和KLK4。在釉質(zhì)基質(zhì)蛋白相關(guān)基因中AMEL、AMBN和ENAM基因突變或缺失會引起人和小鼠牙釉質(zhì)生成不良[15-17]。同時釉質(zhì)基質(zhì)蛋白酶中MMP20和KLK4基因的缺失也會導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)育異常[18-21]。

與對照組相比，*P<0.05,***P<0.001；與抑制劑組相比，#P<0.001(n=3)

胞外配體BMP2和BMP4可以與BMPRⅡ形成二聚體，使得BMPRⅡ受體磷酸化。Ⅱ型受體能夠激活Ⅰ型受體，進(jìn)一步磷酸化Smad1/5/8，然后磷酸化的Smad1/5/8在細(xì)胞核內(nèi)與Smad4結(jié)合形成異質(zhì)二聚體復(fù)合物。這種Smad復(fù)合物可以直接或者在其他DNA結(jié)合蛋白的參與下調(diào)控相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[22]。BMP主要通過依賴Smad途徑和p38-MAPK途徑兩條信號通路發(fā)揮作用，且信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程受細(xì)胞外拮抗劑、膜受體、細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境和轉(zhuǎn)錄水平4個層次的調(diào)節(jié)控制。據(jù)研究顯示，條件性敲除Smad4小鼠也會表現(xiàn)出釉質(zhì)和牙本質(zhì)的發(fā)育不良，可以預(yù)見BMP-SMAD途徑對釉質(zhì)發(fā)育至關(guān)重要[23]。

本課題組實驗結(jié)果顯示，BMP2、BMP4蛋白促進(jìn)了ALC細(xì)胞Smad1/5/8和p38磷酸化蛋白的表達(dá)，而在加入BMP抑制劑Dorsomorphin后，Smad1/5/8磷酸化蛋白減少，p38磷酸化蛋白變化不大，說明Dorsomorphin阻斷了Smad1/5/8蛋白的磷酸化?，F(xiàn)有研究顯示Dorsomorphin可以抑制ALK2、ALK3和ALK6-BMP Ⅰ型受體，而這些受體又可阻斷BMP介導(dǎo)的Smad1/5/8磷酸化和成骨分化[24]。同時課題組證明了使用一定濃度的BMP2、BMP4蛋白可以部分恢復(fù)Dorsomorphin阻斷的MMP20和KLK4蛋白的表達(dá)。綜上可見，BMP2和BMP4蛋白能夠通過影響B(tài)MP通路介導(dǎo)下游靶基因MMP20和KLK4的表達(dá)，而Smad依賴性通路在此調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用，而Smad非依賴性通路對釉質(zhì)發(fā)育的影響還需進(jìn)一步探究。

AI作為一種干擾牙釉質(zhì)形成或礦化的遺傳性疾病，臨床上尚缺乏有效且特異的干預(yù)治療手段，目前主要采用修復(fù)治療來改善外觀和功能，而最近的臨床研究表明BMP2和BMP4基因缺失可以導(dǎo)致病人出現(xiàn)牙齒發(fā)育不良的臨床癥狀[25]。這揭示了BMP2和BMP4可能是釉質(zhì)生成不良疾病的潛在致病基因，對其進(jìn)行的靶向預(yù)防和治療，可能為我們防治此類疾病提供新的想法和思路。