杜 超，李國林,2，張雪松，郭凈潔，王 崇

近年WHO統(tǒng)計顯示，口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC，以下簡稱口腔鱗癌)發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，其作為頜面部最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位列所有癌癥第六位[1-3]。臨床治療口腔鱗癌主要為手術(shù)聯(lián)合放、化療，然而由于其高侵襲性、易發(fā)生淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移的特點，術(shù)后患者極易復(fù)發(fā)，使治療仍面臨巨大挑戰(zhàn)[4-5]。因此探索一種安全有效的抑制口腔鱗癌惡性增殖、遷移及侵襲能力的方法仍是目前基礎(chǔ)及臨床研究的重要課題。

大蒜素(Allicin)提取自天然大蒜鱗莖中，具有殺菌、抗癌等多種藥理學(xué)作用[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)其能影響細胞周期并誘導(dǎo)凋亡、增加抗癌藥物敏感性，對胃癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞有明顯抑制作用[9-13]。大蒜素的這些特性使其有望成為安全、有效的天然植物提純抗腫瘤藥物，但其對口腔鱗癌的治療研究卻尚不明確。本研究試圖通過體外實驗探討大蒜素對口腔鱗癌細胞SCC-15增殖、遷移及侵襲性的影響，并通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進一步探索大蒜素對口腔鱗癌治療作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人舌鱗癌細胞株SCC-15(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)北方醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心實驗室細胞庫贈予)；大蒜素(Solarbio，中國，純度≥98%)，DMEM(Hyclone，美國)；胎牛血清(Biowest，美國)；青/鏈雙抗(Invitrogen，美國)；胰蛋白酶(Solarbio，中國)；CCK-8(Boster，中國)；Transwell小室(Corning，美國)；二甲基亞砜(DMSO，Bioroxx公司，德國)；酶標儀(Biotek公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 制備DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)SCC-15細胞，并置于常規(guī)培養(yǎng)箱(為含有5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱，以下省略)中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8實驗 將SCC-15以每孔5×103個細胞密度接種于96孔板，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后吸除培養(yǎng)液，并將不同濃度的大蒜素溶液(0、5、20、40、100、200、300、400、500、600 μmol/L)分別加入96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。待檢測時按照說明書步驟，將每孔的培養(yǎng)液更換為含有CCK-8的完全培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后使用酶標儀檢測吸光度，根據(jù)所得OD值計算細胞增殖抑制率和半抑制率(IC50)。后續(xù)實驗的實驗組藥物濃度均根據(jù)CCK-8計算的IC50濃度來選擇。

1.2.3 細胞劃痕實驗 將細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，待細胞全部貼壁達到完全融合后，使用移液器槍頭垂直于孔板的底部進行劃痕。用無菌PBS緩慢沖洗去除脫落細胞。對照組細胞加入不含藥物的無血清培養(yǎng)基，實驗組加入以無血清培養(yǎng)基配成的大蒜素溶液繼續(xù)培養(yǎng)(濃度分別為200、400、600 μmol/L)。分別于0、24、48及72 h在光鏡下觀察，記錄各組細胞向劃痕中央遷移的情況并計算細胞遷移率。

1.2.4 Transwell實驗 將Matrigel膠置于4 ℃中溶解過夜，取40 μL稀釋至4倍后的Matrigel膠緩慢均勻的鋪入到Transwell上室中，并在常規(guī)培養(yǎng)箱中孵育4 h。以無血清培養(yǎng)基制備細胞懸液，將Transwell小室放入24孔板內(nèi)，在上室中加入200 μL含有2.5×105個/mL細胞的細胞懸液，下室加入600 μL含血清完全培養(yǎng)基。對照組上室內(nèi)僅有無血清培養(yǎng)基，實驗組上室分別加入含有400、600 μmol/L大蒜素溶液的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后取出小室，并用PBS浸潤后的棉簽擦去上室內(nèi)未穿過膜的細胞。待4%多聚甲醛固定后，濾膜的下表面用結(jié)晶紫染色10 min。中性樹脂封片，在光鏡下觀察并拍照計算胞數(shù)。

1.2.5 大蒜素潛在作用靶點預(yù)測 選擇SwissTargetPrediction在線分析工具，根據(jù)大蒜素的二維和三維結(jié)構(gòu)特點來預(yù)測其潛在靶點。標準化篩選出的數(shù)據(jù)：限制篩選出的基因物種為人，使用UniProt Knowledgebase(UniProtKB)數(shù)據(jù)庫，將篩選出的蛋白質(zhì)名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱并消除重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.2.6 獲取的口腔鱗癌相關(guān)發(fā)病靶點 在GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫輸入關(guān)鍵詞“OSCC”，檢索并整理口腔鱗癌患者的基因芯片表達數(shù)據(jù)集(GSE138206)，選擇所取組織為位于舌部的對照患者和口腔鱗癌患者數(shù)據(jù)，并通過GEO2R(在線R語言分析工具)深入分析該數(shù)據(jù)集的表達特異性及特點。選取大蒜素的潛在作用靶點和口腔鱗癌的發(fā)病相關(guān)靶點的數(shù)據(jù)交集進行下一步分析。

1.2.7 PPI網(wǎng)絡(luò)建設(shè)及功能富集分析 通過蛋白質(zhì)互作檢索數(shù)據(jù)庫STRING-DB構(gòu)建大蒜素靶作用口腔鱗癌靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI)。選取置信區(qū)間大于0.90，將篩選出的核心交集進一步的構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape(版本：3.7.1)構(gòu)建并可視化交互網(wǎng)絡(luò)。為確定交集的核心功能，對大蒜素和口腔鱗癌的數(shù)據(jù)交集進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路和基因本體(Gene Ontology，GO)功能分析。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 組間數(shù)據(jù)比較使用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析。P<0.05檢驗結(jié)果為具有統(tǒng)計學(xué)差異意義。

2 結(jié) 果

2.1 大蒜素對SCC-15細胞具有增殖抑制作用

CCK-8實驗顯示用不同濃度的大蒜素處理細胞：24 h對細胞增殖抑制作用不顯著；48、72 h對細胞增殖抑制作用顯著(P<0.01)，且抑制作用呈濃度依賴性。經(jīng)計算在48、72 h時大蒜素對SCC-15細胞作用的半數(shù)生長抑制濃度(IC50)為200 μmol/L(圖1)。選取200 μmol/L為最小實驗濃度進行后續(xù)實驗。

圖1 大蒜素對SCC-15細胞增殖的抑制作用(#P<0.01)

2.2 大蒜素降低SCC-15細胞遷移能力

劃痕實驗提示：給予不同濃度大蒜素培養(yǎng)SCC-15細胞，24 h時僅在600 μmol/L大蒜素藥物組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，200、400 μmol/L組間與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；大蒜素作用時間增加為48及72 h時，400、600 μmol/L組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2～3)。

圖2 不同濃度大蒜素對SCC-15細胞遷移能力的影響( ×100)

2.3 大蒜素抑制SCC-15細胞侵襲活力

根據(jù)CCK-8及細胞劃痕實驗的結(jié)果選取400、600 μmol/L濃度大蒜素培養(yǎng)SCC-15細胞進行Transwell實驗。48 h后，兩個藥物實驗組與對照組相比，穿過濾膜的細胞數(shù)量明顯減少。對比兩個實驗組，600 μmol/L濃度組比400 μmol/L濃度組穿過濾膜的細胞數(shù)進一步降低(圖4)。

2.4 大蒜素治療口腔鱗癌的潛在靶點基因

去除重復(fù)后，保留了大蒜素104個潛在靶點。與獲得的口腔鱗癌相關(guān)基因進行交集后獲得12個基因(ALDH1A1, ADORA3, CDC25B, MGLL, CYP3A4, CTSS, CTSC, MAOB, AURKA, CES2, HSD11B1, PDE7A)(圖5)。通過進一步應(yīng)用STRING-DB分析靶點蛋白間的相互作用，在去除重復(fù)后得到60個相關(guān)作用靶點，對其交互作用進行可視化分析，構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)(圖6)。

紫色*和#符號代表600 μmol/L處理組在24 h、48 h和72 h時間點分別與對照組比*P<0.05和#P<0.01，綠色#符號代表400 μmol/L處理組在48 h和72 h時間點分別和對照組比#P<0.01

圖4 大蒜素對SCC-15細胞侵襲活力的影響 ( ×100)

2.5 靶基因交集的KEGG和GO功能分析

為了確定60個相關(guān)作用靶點對口腔鱗癌作用的潛在機制，通過KEGG對其進行通路富集分析，篩選出前10個相關(guān)通路。其中P≤0.05且FDR≤0.05的相關(guān)通路為：細胞周期信號通路、p53信號通路、FoxO信號通路、類固醇激素生物合成、人T細胞白血病病毒1型感染及鉑類藥物耐藥性相關(guān)通路等(表1)。GO功能分析結(jié)果顯示：大蒜素主要通過調(diào)控DNA及蛋白質(zhì)的功能或活性來影響口腔鱗癌的生物調(diào)控、代謝過程、定位、增殖和生長等生物過程(圖7)。

3 討 論

口腔頜面部惡性腫瘤具有極強的增殖及侵襲能力，易向局部組織浸潤和發(fā)生早期轉(zhuǎn)移[14]。有統(tǒng)計表明約60%的口腔鱗癌病人在就診檢查時病程已達到中晚期，增加了治療難度，對患者的生存造成嚴重威脅[15]。單純的手術(shù)治療已經(jīng)難以達到滿意的治療效果，常需根據(jù)患者實際病情設(shè)計出特定的治療序列，個體化治療口腔鱗癌[16]?；熢谥委煇盒阅[瘤過程中扮演著重要角色，但化療藥物所帶來的副作用等問題同樣令人擔(dān)憂，這些問題一直制約著口腔鱗癌的治療效果。因此尋找一種安全有效的藥物就成為了當(dāng)下治療口腔鱗癌的重要研究方向。

作為一種天然植物提取物，大蒜素因其生物特性在抗癌治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。有研究證實大蒜素能破壞惡性腫瘤的細胞結(jié)構(gòu)，調(diào)控腫瘤細胞內(nèi)促凋亡信號通路上相關(guān)基因及蛋白的表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[17]。大蒜素還可以增加體內(nèi)免疫細胞對癌細胞的敏感性，提高免疫細胞對癌細胞的殺傷能力[18]。Tao等[19]研究了大蒜素抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖的作用，研究結(jié)果表明相較其他化療藥，大蒜素對SGC-7901細胞具有明顯的抑制作用。本研究中，為探索大蒜素對SCC-15細胞增殖的影響，我們通過CCK-8實驗用不同濃度的大蒜素溶液處理SCC-15細胞，經(jīng)過24 h后觀察到細胞的生長受到了抑制，且這種抑制作用隨著藥物濃度的提高和作用時間的延長而更加明顯。說明大蒜素具有抑制SCC-15細胞增殖的能力，且抑制能力具有濃度和時間依賴性。Jabalee等[20]研究證實，口腔鱗癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移同癌細胞超常的細胞遷移能力和侵襲能力密切相關(guān)。Zhang等[21]通過實驗證明大蒜素能有效抑制人宮頸癌細胞的遷移，降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。我們通過劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素溶液處理后SCC-15細胞的劃痕愈合率較未處理組明顯降低，在處理后的48 h和72 h，大蒜素顯著降低了劃痕兩側(cè)細胞向中央遷移的趨勢?；|(zhì)金屬蛋白酶類(matrixmetalloproteinases，MMPs)可以降解細胞外基質(zhì)成分(extracellular matrix，ECM)，ECM被破壞后組織受腫瘤侵襲的風(fēng)險大大提高。有研究報道稱大蒜素對人結(jié)腸癌205細胞作用后，其侵襲性明顯下降，測得細胞內(nèi)MMP-2、MMP-7和MMP-9的表達降低[22]。在本課題的Transwell侵襲實驗中，Transwell小室底部濾膜上鋪滿的Matrigel膠模擬了細胞外基質(zhì)成分，通過觀察穿過濾膜細胞數(shù)的多少來判斷細胞侵襲能力的強弱。實驗結(jié)果顯示，在實驗進行48 h后，400 μmol/L和600 μmol/L大蒜素組細胞穿過濾膜的數(shù)量較未用大蒜素處理組明顯減少，且600 μmol/L濃度治療組較400 μmol/L組穿過濾膜的細胞數(shù)進一步降低，這說明大蒜素可以抑制口腔鱗癌細胞的侵襲能力。

圖6 大蒜素相關(guān)作用靶點的蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖7 大蒜素相關(guān)作用靶基因的GO功能分析

上述研究通過CCK-8實驗、細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗證明了大蒜素能夠呈濃度和時間依賴性的抑制口腔鱗癌細胞SCC-15的增殖、遷移和侵襲能力。在此基礎(chǔ)上，我們選擇網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進一步探索大蒜素抑制口腔鱗癌發(fā)展的可能機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過大數(shù)據(jù)對生物系統(tǒng)進行篩選和分析，能闡明藥物與作用靶點間的相互作用關(guān)系，成為目前探索藥物多靶點作用的有效手段。本研究首先從大蒜素的結(jié)構(gòu)出發(fā)探索了大蒜素發(fā)揮生物活性作用的潛在靶點，繼而又通過大數(shù)據(jù)篩選、分析出了大蒜素的作用靶點和口腔鱗癌發(fā)病基因的交集。將交集相互作用篩選后，我們得到了我們得到了ALDH1A1, ADORA3, CDC25B, MGLL, CYP3A4, CTSS, CTSC, MAOB, AURKA, CES2, HSD11B1, PDE7A這12個大蒜素作用于口腔鱗癌的核心靶基因。這12個核心靶點基因?qū)δ[瘤形成和發(fā)展過程中的細胞周期、酶活性等重要節(jié)點發(fā)揮調(diào)控作用，它們出現(xiàn)異常往往會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[23-26]，這其中已有臨床及基礎(chǔ)研究表明ALDH1A1和AURKA與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。ALDH1A1陽性的口腔鱗癌患者其預(yù)后和生存率表現(xiàn)均較陰性患者差[27]。 AURKA高表達的患者總體生存率較對照組患者低，且體外實驗中敲除AURKA基因后口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲均被顯著抑制并誘導(dǎo)了口腔鱗癌細胞凋亡[28]。相關(guān)文獻報道體內(nèi)CDC25B、MGLL、CYP3A4、 MAOB、CES2、 HSD11B1異常是腎癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、腸癌、前列腺癌發(fā)生的相關(guān)危險因素[29-34]，但目前尚未有試驗研究這些基因在口腔鱗癌中的致病作用，因此本課題也為其他的學(xué)科的基礎(chǔ)和臨床研究提供了新的方向。通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)了60個與核心靶點相關(guān)的作用靶點。通過KEGG和GO方法對這60個作用靶點富集的通路和功能進行了深入分析。結(jié)果顯示，大蒜素對于口腔鱗癌的作用主要富集在調(diào)控細胞周期、p53信號通路、FoxO凋亡通路等信號通路以及對腫瘤生物調(diào)控、代謝過程、細胞定位、細胞成分和分子成分等方面，通過影響上述通路和生物過程來抑制口腔鱗癌的發(fā)生與發(fā)展，這些可能是大蒜素治療口腔鱗癌的機制。從KEGG和GO分析結(jié)果來看，調(diào)控口腔鱗癌細胞周期和影響p53通路的表達在分析中的顯著程度較高。

既往研究證明大蒜素對細胞周期有較強的特異性，有報道稱大蒜素能通過阻滯人骨肉瘤細胞Saos-2的細胞周期來干擾該細胞的正常增殖[35]。經(jīng)過大蒜素作用后Saos-2細胞停滯在G0/G1期的比例明顯增高，且隨著大蒜素濃度的提高和作用時間的延長，細胞停滯的比例也隨之升高。影響細胞周期有益于減少腫瘤細胞的增殖，結(jié)合我們的實驗結(jié)果和預(yù)測結(jié)果，表明大蒜素可能是通過干預(yù)細胞周期來影響口腔鱗癌細胞的增殖。野生型p53基因是體內(nèi)重要的抑癌基因，對DNA修復(fù)、細胞的增殖、分化等起到調(diào)控作用。但當(dāng)細野生型p53基因出現(xiàn)突變或其他缺陷時，其將失去對細胞監(jiān)視和調(diào)控等功能，突變?yōu)榇侔┗颉Ｒ豁椨嘘P(guān)口腔鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，p53基因是口腔鱗癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素[36]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，突變型p53基因的高表達提示了口腔鱗狀上皮有高度惡化的傾向[37]。這些結(jié)果表明，p53基因的表達與口腔鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)，靶向調(diào)控p53基因有益于口腔鱗癌的治療。我們的研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可以調(diào)控口腔鱗癌中p53信號通路的表達，雖然尚未進行實驗驗證，但Arora等[38]在研究中發(fā)現(xiàn)大蒜素通過增加野生型p53表達水平、下調(diào)突變型p53表達，抑制了皮膚鱗狀細胞癌的進展，這也再次印證了大蒜素靶向調(diào)控p53基因可能是抑制腫瘤發(fā)展的原因。

我們的研究以生物學(xué)實驗為起點，首先探索出了大蒜素對口腔鱗癌SCC-15細胞增殖的抑制作用，并探索出經(jīng)過大蒜素作用后的SCC-15細胞在體外的遷移能力和侵襲能力顯著下降。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從宏觀信息學(xué)的角度探索了大蒜素對口腔鱗癌治療潛在的作用靶點及可能影響的通路及細胞功能。這些研究不僅為大蒜素應(yīng)用于臨床個體化治療口腔鱗癌患者提供了新的研究方向，也為進一步闡明大蒜素抑制口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的機制提供了新的理論依據(jù)和思路。