王 彬，章榮葉，湯賽飛，羅成江，陳曉林，林仙軍

(1.浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 311101 ;2.浙江省臺州市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊(duì)，浙江 臺州 317700；3.浙江建安檢測研究院有限公司，浙江 杭州 310006)

清瘟解毒口服液由地黃、梔子、黃芩、連翹、玄參和板藍(lán)根通過一定的工藝制得[1]，其主要活性成分有黃芩苷、梔子苷、連翹苷等，具有清熱解毒的功效，臨床主要用于雞外感發(fā)熱[2]。該品種檢測標(biāo)準(zhǔn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2017年版)》中藥卷[3]，僅采用薄層色譜法分別鑒別黃芩苷、連翹苷和梔子苷3種物質(zhì)，需要采用3種不同的鑒別方法，操作繁瑣，既耗時(shí)耗力，又只能定性，不能準(zhǔn)確測定其含量，無法滿足對產(chǎn)品質(zhì)量控制的要求。

高效液相色譜法快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高，定性和定量均準(zhǔn)確。高效液相色譜-二極管陣列檢測器法(HPLC-DAD)因其結(jié)合了光譜掃描和數(shù)據(jù)庫功能，定性更準(zhǔn)確，在中獸藥質(zhì)量控制中將發(fā)揮更大的優(yōu)勢。目前，國內(nèi)有學(xué)者采用高效液相色譜法分別測定清瘟解毒口服液中的黃芩苷[4]和連翹苷的含量[4-5]，未見同時(shí)對清瘟解毒口服液中黃芩苷、梔子苷和連翹苷3種有效成分進(jìn)行檢測的文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用HPLC-DAD法對清瘟解毒口服液中梔子苷、黃芩苷和連翹苷同時(shí)檢測的方法進(jìn)行了研究，為清瘟解毒口服液質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀，Agilent 1260，配Agilent 1260 Infinity G4212A型DAD檢測器；AG-285電子天平(Mettler公司)；DELTA320 pH計(jì)(Mettler公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料 甲醇為分析純；乙腈為色譜純；磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、30%雙氧水均為分析純;試驗(yàn)用水為milli-Q超純水。黃芩苷對照品，來源中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號:Z0271705，含量96.8%；梔子苷對照品，來源中國食品藥品檢定研究院，批號:110749-201115，含量99.7%；連翹苷對照品，來源中國食品藥品檢定研究院，批號:110821-201514，含量93.5%。清瘟解毒口服液，100 mL/瓶，來源浙江施比龍生物科技有限公司，批號分別為20180101、20180102和20180103。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制 取黃芩苷對照品5.50 mg、連翹苷對照品9.90 mg和梔子苷對照品5.50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻制成對照品儲備液。

2.2 供試品溶液的配制 量取供試品1.00 mL于100 mL量瓶中，用50%甲醇溶液適量稀釋，超聲處理5 min，再用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.05%磷酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序見表1；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，用二極管陣列檢測器進(jìn)行掃描，掃描范圍為190～400 nm，記錄230 nm波長處的色譜圖。該色譜條件下黃芩苷、連翹苷和梔子苷峰分離良好。對照品溶液典型色譜圖見圖1，光譜圖分別見圖2～4；供試品溶液典型色譜圖見圖5，光譜圖分別見圖6～8。

表1 流動相梯度洗脫程序表Table 1 Gradient mobile phase for HPLC

圖1 黃芩苷、連翹苷和梔子苷對照品溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mix standard solution注：出峰順序依次為梔子苷、黃芩苷和連翹苷Note:The order of peak was asminoidin,baicalin and phillyrin

圖2 梔子苷對照品溶液光譜圖Fig.2 Spectroscopy of asminoidin solution

圖3 黃芩苷對照品溶液光譜圖Fig.3 Spectroscopy of baicalin solution

圖4 連翹苷對照品溶液光譜圖Fig.4 Spectroscopy of phillyrin solution

圖5 清瘟解毒口服液色譜圖Fig.5 Chromatogram of Qingwen jiedu oral liquid 注：出峰順序依次為梔子苷、黃芩苷和連翹苷Note:The order of peak was asminoidin,baicalin and phillyrin

圖6 清瘟解毒口服液中梔子苷光譜圖Fig.6 Spectroscopy of asminoidin solution in Qingwen jiedu oral liquid

圖7 清瘟解毒口服液中黃芩苷光譜圖Fig.7 Spectroscopy of baicalin solution in Qingwen jiedu oral liquid

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍考察 精密量取對照品儲備液適量，用50%甲醇分別稀釋2、5、10、20倍和50倍。制成相應(yīng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表2。

圖8 清瘟解毒口服液中連翹苷光譜圖Fig.8 Spectroscopy of phillyrin solution in Qingwen jiedu oral liquid

表2 梔子苷、黃芩苷和連翹苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curve of baicalin,asminoidin and phillyrin

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取批號為20180101清瘟解毒口服液供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，測得梔子苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%，測得黃芩苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%，測得連翹苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%。表明此方法的儀器精密度符合要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號為20180101清瘟解毒口服液供試品溶液，分別于0、2、4、6、12 h和24 h進(jìn)行測定，測得梔子苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%，測得黃芩苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%，測得連翹苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%。表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.4 方法專屬性 取20180101清瘟解毒口服液各1 mL，置100 mL量瓶中，分別加1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液和5%過氧化氫溶液各1 mL，放置1 h[6]，用50%甲醇溶液定容，依法測定。梔子苷、黃芩苷和連翹苷在鹽酸溶液和過氧化氫溶液均穩(wěn)定，峰面積減少在3%以內(nèi)；在氫氧化鈉溶液中，連翹苷穩(wěn)定，峰面積減少在3%以內(nèi)，梔子苷減少了95%，黃芩苷減少了90%。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取梔子苷、黃芩苷和連翹苷各適量，加甲醇配制成約1 mg/mL的加樣回收率試驗(yàn)溶液。另取批號為20180101的清瘟解毒口服液樣品6份，各1.00 mL，分別精密加入加樣回收率試驗(yàn)溶液各5 mL，置100 mL量瓶中，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下條件檢測，結(jié)果扣除清瘟解毒口服液樣品原有相應(yīng)組分的量，計(jì)算平均回收率及RSD，結(jié)果見表3。

表3 梔子苷、黃芩苷和連翹苷回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recovery of baicalin,asminoidin and phillyrin

2.4.6 實(shí)際樣品的測定 取批號為20180101、20180102和20180103的清瘟解毒口服液3個(gè)平行，各1.00 mL，按照2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，依法檢測，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算黃芩苷、連翹苷和梔子苷含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品中含量測定結(jié)果Table 4 Recovery of baicalin,asminoidin and phillyrin (mg/mL,n=3)

3 討論

3.1 稀釋溶劑的選擇 本試驗(yàn)選擇了甲醇、50%甲醇、20%甲醇等稀釋溶劑進(jìn)行測定，結(jié)果表明，稀釋溶劑為甲醇時(shí)，梔子苷峰較寬，理論板數(shù)偏小，而用50%甲醇溶液稀釋時(shí)，3種藥物峰形尖銳、對稱，分離度好。黃芩苷在甲醇中較易溶解，50%甲醇溶液的溶解度臨界濃度在0.1 mg/mL左右，超聲加熱后可以溶解，冷卻后有時(shí)會析出，導(dǎo)致濃度不準(zhǔn)。因此，在對照品儲備液的配制過程中，第一步是需要用甲醇溶劑，再用50%甲醇溶液稀釋至需要的濃度，甲醇的含量需要保持50%左右，甲醇濃度太低不利于溶解，甲醇濃度太高峰形可能會不好。因此本試驗(yàn)選擇50%甲醇溶液為提取溶劑。

3.2 檢測波長 本試驗(yàn)采用DAD檢測器對梔子苷、黃芩苷和連翹苷進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梔子苷在240 nm波長有最大吸收，黃芩苷在215 nm、277 nm、316 nm波長處有最大吸收，連翹苷在278 nm和220～240 nm處有最大吸收，綜合考慮每個(gè)藥物的響應(yīng)值及雜質(zhì)干擾因素，選擇230 nm作為檢測波長。

3.3 流動相的選擇 參考《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2017年版》中黃芩苷的流動相，考察了乙腈和不同濃度磷酸溶液作為流動相。比較了乙腈與0.01%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液和0.4%磷酸溶液作為流動相，各流動相保留時(shí)間和峰形一致，而乙腈-0.4%磷酸溶液pH值為1.5，乙腈-0.2%磷酸溶液pH值為1.7，pH值小于2.0對色譜柱損害較大；而乙腈-0.05%磷酸溶液pH值為2.3左右。因此，選擇0.05%磷酸溶液-乙腈作為流動相，調(diào)節(jié)流動相比例，3種有效成分分離較好，保留時(shí)間比較合適。最后，確定梯度洗脫程序。

4 結(jié)論

本文采用HPLC-DAD法同時(shí)對清瘟解毒口服液中梔子苷、黃芩苷和連翹苷進(jìn)行檢測，對稀釋溶劑、檢測波長、專屬性和色譜條件等進(jìn)行試驗(yàn)，方法定性定量準(zhǔn)確，可用于清瘟解毒口服液中3種有效成分的含量檢測。