張 巧，黃 興，李永成*

（1.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899）

近年來，隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，蝦的產(chǎn)量和消費(fèi)量不斷增長。工業(yè)上，蝦主要加工成蝦仁用于出口，產(chǎn)生的蝦頭、蝦殼、蝦尾等廢棄物約占整蝦質(zhì)量的40%左右[1]。這些蝦類廢棄物如果不經(jīng)適當(dāng)?shù)募庸ぬ幚?，不僅會(huì)產(chǎn)生難聞的氣味，給環(huán)境帶來嚴(yán)重污染，蝦料中豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、蝦青素和甲殼素等營養(yǎng)物質(zhì)或生物材料也會(huì)白白浪費(fèi)[2]。甲殼素是一種由N-乙酰-D-氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的聚合物，在自然界中的含量僅次于纖維素。從甲殼類廢棄物中提取的甲殼素及其脫乙?；瘹ぞ厶窃谑称?、醫(yī)藥、納米材料、水處理、化妝品、環(huán)境等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[3-4]。

在蝦殼廢棄物中，甲殼素的含量約占20%～30%，蛋白質(zhì)的含量約占20%～30%，礦物質(zhì)的含量約占30%～40%[5]。蝦殼甲殼素的提取，主要有脫蛋白和脫鹽兩個(gè)關(guān)鍵步驟。甲殼素提取方法分為化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法采用強(qiáng)酸將蝦殼中難溶于水的鹽類物質(zhì)變成易溶于水的無機(jī)鹽，從而達(dá)到去除蝦殼中礦物質(zhì)的目的，再使用強(qiáng)堿脫除蝦殼中的蛋白質(zhì)[6]?；瘜W(xué)法提取甲殼素過程中，產(chǎn)生的大量酸堿廢水難以處理，且強(qiáng)酸強(qiáng)堿還可能造成甲殼素發(fā)生部分解聚，影響其品質(zhì)。而生物催化、生物轉(zhuǎn)化和發(fā)酵法制備甲殼素的反應(yīng)條件溫和，且相同條件下制備的甲殼素的品質(zhì)較為穩(wěn)定[7]，近年來，生物法制備甲殼素已逐步取代化學(xué)法，得到了科研工作者的廣泛探究。利用微生物發(fā)酵產(chǎn)蛋白水解酶對蝦殼進(jìn)行脫蛋白，不僅是生物法制備甲殼素的重要過程，還能回收蝦殼中的蛋白質(zhì)[8]。發(fā)酵脫蛋白的微生物以芽孢桿菌居多，如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、短芽孢桿菌等，對甲殼類廢棄物的脫蛋白率均在75%以上[9-10]。其中蠟樣芽孢桿菌是一種具有較高蛋白酶活性的微生物，郝凱[11]從凡納濱對蝦的腸道中分離出氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬等微生物，其中產(chǎn)蛋白酶活性最高的菌株是蠟樣芽孢桿菌。目前，發(fā)酵法脫蛋白仍存在發(fā)酵時(shí)間長、操作復(fù)雜、脫蛋白效率較低等問題。對蝦殼蛋白質(zhì)脫除能力強(qiáng)的微生物，在甲殼素制備工藝中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。本研究從蝦塘沉積物中分離并鑒定一株產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌，研究該菌株與枯草芽孢桿菌在不同條件下的脫蛋白作用，為微生物發(fā)酵法提取蝦殼甲殼素提供較好的脫蛋白菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌株

南美白對蝦蝦殼：海南照豐水產(chǎn)有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DX-2：本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母提取粉、胰蛋白胨（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

篩選培養(yǎng)基：1%蝦殼粉、5%葡萄糖、0.1%酵母膏、0.8%NaCl、0.15% CaCl2、0.07%K2HPO3、0.03% KH2PO3、0.05%MgSO4、2%瓊脂，蒸餾水定容至1 000 mL。

蝦殼發(fā)酵培養(yǎng)基：5%蝦殼粉、5%葡萄糖，蒸餾水定容至1 000 mL。

Luria-Bertani（LB）肉湯培養(yǎng)基：0.5%酵母粉、1%胰蛋白胨、1%NaCl，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基滅菌條件：121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQLY-180N立式振蕩培養(yǎng)箱：海知楚儀器有限公司；SH220F石墨消解儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蝦殼預(yù)處理

將去雜后的蝦殼用水清洗干凈，自然晾干后粉碎，過40目篩網(wǎng)，獲得蝦殼粉（蛋白質(zhì)含量為30%左右），密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的分離

從蝦塘沉積物中取樣10 g，加入到裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，攪拌均勻后，超凈工作臺中靜置10 min。取上清液，用無菌水稀釋至10-3、10-4、10-5g/mL。吸入1 mL的上述稀釋液至倒有篩選培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿表面，涂布均勻，35 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落生長情況。

挑取生長良好的單一菌落，接種至LB肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min培養(yǎng)1 d。培養(yǎng)好的菌液在倒有NA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中劃線分離，獲得純菌株。

1.3.3 菌株的鑒定

（1）菌落特征和菌體形態(tài)

將分離到的純菌株劃線于NA培養(yǎng)基表面，35 ℃培養(yǎng)1 d，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色[12]。

（2）生理生化特性

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]，對分離到的具有較高蛋白酶活性的細(xì)菌進(jìn)行生理生化特征的測定。

（3）分子生物學(xué)鑒定

通過測定菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，具體參照潘曉倩等[14]的方法并稍作修改。按照細(xì)菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒上的具體方法從分離到的純菌株菌液中提取DNA，以提取的DNA作為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海派諾生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行測序。將測得的序列結(jié)果與NCBI GenBank中序列進(jìn)行BLAST比對，通過MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 不同培養(yǎng)基組成對蝦殼脫蛋白率的影響

（1）葡萄糖添加量對蝦殼脫蛋白率的影響

將篩選菌株和枯草芽孢桿菌分別培養(yǎng)至OD600nm=1.0時(shí)，按照3%的接種量接種至蝦殼發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量20 mL/100 mL），葡萄糖添加量分別為10 g/L、30 g/L、50 g/L、70 g/L、90 g/L，35 ℃、180 r/min發(fā)酵5 d，測定發(fā)酵液中蝦殼的脫蛋白率。

（2）蝦殼粉添加量對蝦殼脫蛋白率的影響

在葡萄糖添加量優(yōu)化的基礎(chǔ)上，蝦殼粉添加量分別為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，35 ℃、180 r/min發(fā)酵5 d，測定發(fā)酵液中蝦殼的脫蛋白率。

（3）酵母膏添加量對蝦殼脫蛋白率的影響

在葡萄糖和蝦殼粉添加量優(yōu)化的基礎(chǔ)上，酵母膏添加量分別為0、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L，35 ℃、180 r/min發(fā)酵5 d，測定發(fā)酵液中蝦殼的脫蛋白率。

1.3.5 發(fā)酵時(shí)間對蝦殼脫蛋白的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，按照3%的接種量，35 ℃、180 r/min分別發(fā)酵1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力和脫蛋白率的變化。

1.3.6 蛋白酶活力的測定

吸取一定量的發(fā)酵液，參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》測定蛋白酶的活性。蛋白酶酶活定義：在一定反應(yīng)溫度和時(shí)間條件下，1 mL發(fā)酵液在1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，為1個(gè)蛋白酶活力單位（U）。

1.3.7 蝦殼粉脫蛋白率的測定

發(fā)酵結(jié)束后，取出三角瓶，抽濾，將沉淀水洗至上清液的OD600nm為0，獲得的蝦殼粉在60 ℃干燥箱內(nèi)干燥24 h，參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的分光光度法測定總氮和蛋白質(zhì)含量。按照如下公式計(jì)算蝦殼發(fā)酵后的脫蛋白率：

其中：m0為三角瓶中原蝦殼粉的質(zhì)量，g；N0為原蝦殼粉的含氮量，%；m為發(fā)酵后三角瓶中蝦殼粉的質(zhì)量，g；N為發(fā)酵后蝦殼粉的含氮量，%；p為蝦殼粉的蛋白質(zhì)含量，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)特征

從蝦塘中分離到的產(chǎn)蛋白酶菌株C1，通過平板劃線得到的單菌落呈圓形，奶油色，不透明，且邊緣粗糙。進(jìn)一步通過革蘭氏染色，顯微鏡下觀察的形態(tài)見圖1，結(jié)果表明，該菌株呈桿狀，判斷菌株C1是一株革蘭氏陽性桿菌。

圖1 菌株C1的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of strain C1

2.1.2 生理生化鑒定

菌株C1的生理生化特性及對碳源的利用能力見表1所示。該菌株具有使明膠液化、牛奶胨化的能力，具有淀粉酶活性，VP試驗(yàn)、甲基紅（methyl red，MR）試驗(yàn)呈陽性，但不能利用檸檬酸鈉，最適溫度為37 ℃，最適pH為7.5。菌株C1對葡萄糖、果糖、乳糖等大部分單糖、雙糖或糖醇均能較好地利用，但不能以纖維素作為碳源。

表1 菌株C1的生理生化特征及碳源利用情況Table 1 Physiological and biochemical characteristics and carbon source utilization ability of strain C1

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株C1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度及擴(kuò)增片段大小的檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株C1僅在1 500 bp附近顯示一條明顯的條帶，說明擴(kuò)增產(chǎn)物的純度較高，菌株C1的16S rDNA被成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

圖2 菌株C1的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis patterns of PCR amplification products of 16S rDNA for strain C1

將待鑒定菌株的16S rDNA序列與NCBI中相似度高的已知序列構(gòu)建成系統(tǒng)發(fā)育樹，若兩者的16S rDNA同源性達(dá)到99%，則認(rèn)為它們是同一種菌[15]。菌株C1的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3所示。由圖3可知，菌株C1與Bacillus cereus的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到99%，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化特征的結(jié)果，可確定菌株C1為一株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。蠟樣芽孢桿菌因其高蛋白酶活性具有一定的應(yīng)用價(jià)值。于平等[16]從土壤中篩選的蠟樣芽孢桿菌，能產(chǎn)中性蛋白酶，且耐熱性較好，應(yīng)用前景廣闊。吳昱含等[17]從廢鉻污染的土壤中分離到一株產(chǎn)蛋白酶耐鉻的蠟樣芽孢桿菌，該菌株能有效清除含鉻污水中的蛋白質(zhì)，清除率高達(dá)91.9%，達(dá)到制革污水清潔化的目的。

圖3 基于16S rDNA序列菌株C1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenic trees of strain C1 based on 16S rDNA sequences

2.2 不同培養(yǎng)基組成對蝦殼脫蛋白率的影響

2.2.1 葡萄糖添加量對蝦殼脫蛋白率的影響

蝦殼中的蛋白質(zhì)能為微生物的生長提供氮源，因此蝦殼發(fā)酵培養(yǎng)基需要添加適當(dāng)?shù)奶荚?。葡萄糖添加量對蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼的脫蛋白率的影響見圖4所示。由圖4可知，蝦殼發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖添加量為10～50g/L時(shí)，增加葡萄糖含量有利于蝦殼中蛋白質(zhì)的溶出，從而提高蝦殼的脫蛋白率。當(dāng)葡萄糖添加量為50～90g/L時(shí)，繼續(xù)增加葡萄糖添加量，2株芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼的脫蛋白率反而下降。因此，對蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌而言，蝦殼發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的添加量確定為50 g/L。此外，圖4表明蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼的脫蛋白能力高于枯草芽孢桿菌，在蝦殼發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50 g/L的葡萄糖，蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的脫蛋白率分別為80.4%、75.6%。

圖4 葡萄糖添加量對蝦殼脫蛋白率的影響Fig.4 Effect of glucose addition on the deproteinization rate of shrimp shell

2.2.2 蝦殼粉添加量對蝦殼脫蛋白率的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中蝦殼粉添加量對蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼的脫蛋白率的影響見圖5所示。由圖5可知，蝦殼粉添加量為20 g/L時(shí)，2株芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼的脫蛋白率較高，分別達(dá)到85.1%、78.4%，蝦殼粉添加量為10～50 g/L時(shí)，蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼的脫蛋白率均高于枯草芽孢桿菌。蝦殼粉添加量高于20 g/L時(shí)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵的脫蛋白率下降速率較大。因此，2株微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，蝦殼粉添加量確定為20 g/L。

圖5 蝦殼粉添加量對蝦殼脫蛋白率的影響Fig.5 Effect of shrimp shell power addition on the deproteinization rate of shrimp shell

2.2.3 酵母膏添加量對蝦殼脫蛋白率的影響

酵母膏中含有蛋白質(zhì)、維生素和必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種非常理想的微生物發(fā)酵原料[18]。在發(fā)酵初期，蝦殼發(fā)酵培養(yǎng)基中能供微生物利用的可溶性蛋白質(zhì)含量較低，不利于微生物生長。而添加一定量的酵母膏可能促進(jìn)微生物的生長和脫蛋白作用。酵母膏添加量對蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼的脫蛋白率的影響見圖6。

圖6 酵母膏添加量對蝦殼脫蛋白率的影響Fig.6 Effect of yeast extract addition on the deproteinization rate of shrimp shell

由圖6可知，添加0～5 g/L的酵母膏，蠟樣芽孢桿菌對蝦殼的脫蛋白率均高于枯草芽孢桿菌，且酵母膏添加量為1 g/L時(shí)，蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼的脫蛋白率達(dá)到最高（90.1%）。在此基礎(chǔ)上增加酵母膏添加量，脫蛋白率不斷下降，可能原因在于較高含量的酵母膏雖然有利于微生物的生長，但是產(chǎn)蛋白酶能力下降。因此確定酵母膏添加量為1 g/L。

2.3 蝦殼發(fā)酵過程中蛋白酶活力及脫蛋白率的變化

枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼過程中，發(fā)酵液中蛋白酶活力及蝦殼脫蛋白率的變化見圖7所示。

由圖7（a）可知，2株菌的酶活力均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在發(fā)酵0～4 d，枯草芽孢桿菌的酶活力稍高，4 d后蠟樣芽孢桿菌的酶活力較高?？莶菅挎邨U菌在發(fā)酵第4天達(dá)到最高酶活力154.6 U/mL，而蠟樣芽孢桿菌在發(fā)酵第5天的酶活力最高，達(dá)到220.8 U/mL，此時(shí)枯草芽孢桿菌的酶活力僅為145.7 U/mL。

由圖7（b）可知，在蛋白酶的作用下，2株菌均對蝦殼的脫蛋白率不斷增加，0～5 d增加較快，5 d后緩慢增長。發(fā)酵第5天，枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌對蝦殼的脫蛋白率分別達(dá)到80.4%、90.8%。蠟樣芽孢桿菌的脫蛋白作用明顯強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。通過微生物發(fā)酵提取蝦殼中的甲殼素，脫蛋白率較高可以達(dá)到90%～95%[9]，如灰色鏈霉菌發(fā)酵過程中產(chǎn)的蛋白酶對凡納濱對蝦蝦殼進(jìn)行脫蛋白作用，脫蛋白率為91.1%[19]；通過沙雷氏菌發(fā)酵處理南美白對蝦蝦殼，脫蛋白率達(dá)到94.5%[20]。

圖7 蝦殼發(fā)酵過程中蛋白酶活力（a）和脫蛋白率（b）的變化Fig.7 Variation of protease activity (a) and deproteinization rate (b)during shrimp shell fermentation process

3 結(jié)論

從蝦塘沉積物中分離到一株產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌C1，經(jīng)鑒定其為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。與枯草芽孢桿菌相比，本研究篩選到的蠟樣芽孢桿菌對蝦殼的脫蛋白能力更強(qiáng)。當(dāng)蝦殼發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖添加量為50 g/L時(shí)，蝦殼粉20 g/L，酵母膏1 g/L，蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵蝦殼的脫蛋白率較高；此條件下經(jīng)蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵5 d，發(fā)酵液中的蛋白酶活力達(dá)到220.8 U/mL，蝦殼脫蛋白率達(dá)到90.8%，而同等條件下枯草芽孢桿菌的脫蛋白率僅為80.4%。本研究篩選的蠟樣芽孢桿菌，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生高活性的蛋白酶，高效脫除蝦殼中的蛋白質(zhì)，在蝦殼甲殼素的生物提取工藝中具有較好的應(yīng)用前景。